一種新普魯蘭酶的制備和分離方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新普魯蘭酶的制備和分離方法，其步驟包括：a.菌株培養(yǎng)基配方；b.菌株培養(yǎng)條件；c.新普魯蘭酶的分離方法；d新普魯蘭酶的柱層析分離。本發(fā)明制備的新普魯蘭酶性能穩(wěn)定、酶活力高、分離純化的新普魯蘭酶耐酸堿，耐高溫，同時具有催化水解α-(1,4)–和α-(1,6)–糖苷鍵及催化二者間的相互轉(zhuǎn)糖苷的雙重作用，能大幅度提高淀粉轉(zhuǎn)化率，同時還可增加淀粉用途，生產(chǎn)出新品種。新普魯蘭酶可廣泛用于淀粉加工業(yè)特別是淀粉的生物轉(zhuǎn)化加工領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景和顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種新普魯蘭酶的制備和分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵產(chǎn)生新普魯蘭酶及這種酶的分離提取方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 新普魯蘭酶（neopullulanase，nPU，EC3. 2. 1. 135)屬于葡萄糖苷水解酶類 (Glycosyl hydrolase family)的 α -淀粉水解酶族 13 ( a-amylase family 13)中的一 種，它是一個多功能復(fù)合型的淀粉水解酶，能催化淀粉四種的反應(yīng)：水解α-(1 -4)糖苷 鍵、水解α - (1 - 6)糖苷鍵、α - (1 - 4)鍵的轉(zhuǎn)糖苷作用、α - (1 - 6)鍵的轉(zhuǎn)糖苷作用。 因此，新普魯蘭酶具有普魯蘭酶（pullulanase，PU，EC3. 2. 1.41)的活性，可將普魯蘭的 α - (1 - 6)糖苷鍵斷開，生成麥芽三糖；又具有α -淀粉酶（EC3. 2. 1. 1)的活性，可將普魯 蘭水解生成潘糖；另外，在高糖濃度下，新普魯蘭酶還具有轉(zhuǎn)α-(1 - 4)和α-(1 - 6)糖 苷作用，可將葡萄糖苷的分枝連接方式在α - (1 - 4)和α - (1 - 6)中相互轉(zhuǎn)換。
[0004] 在自然界，每種植物都能利用光合作用合成淀粉并將之貯存起來，為人類和動物 提供源源不斷的能量。作為最原始的貯存能源，淀粉是很重要的多糖，在食品、飲料工業(yè)中 是必不可少的原料，可作為食品加工原料或添加劑用于粉絲、涼粉、雪糕、方便面、飲料等產(chǎn) 品中。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以淀粉為原料經(jīng)物理、化學(xué)方法及酶制劑的處理，可改變原淀 粉的溶解度、黏度、滲透性、凝膠性、吸水性等理化性能，生產(chǎn)出一系列不同性能的變性淀 粉、淀粉衍生物、水解糖、淀粉糖衍生物和其它發(fā)酵產(chǎn)品。
[0005] 由于新普魯蘭酶能參與淀粉水解的四種反應(yīng)，所以在淀粉加工業(yè)中有著重要的 用途：1、提高淀粉的利用率。在淀粉糖化過程中輔助性的加入新普魯蘭酶，可水解殘余的 α-(1 - 6)糖苷鍵支鏈糖，提高淀粉糖的轉(zhuǎn)化率。在以淀粉生產(chǎn)酒精的工藝中，添加新普 魯蘭酶可將淀粉的利用率提高3%?5%。2、用于低聚糖的生產(chǎn)。如低聚異麥芽糖生產(chǎn)是 α -淀粉酶、β -淀粉酶、轉(zhuǎn)糖苷酶協(xié)同作用，使淀粉先水解然后再經(jīng)過轉(zhuǎn)糖苷作用生成低 聚異麥芽糖，在低聚糖的生產(chǎn)中用新普魯蘭酶替代其它轉(zhuǎn)糖苷酶，可將低聚糖的轉(zhuǎn)化率由 原來的45%提高到60%左右。3、在葡萄糖苷酶催化機(jī)制研究中的作用。新普魯蘭酶能催化 四種淀粉的水解反應(yīng)，在葡萄糖苷酶家族中是獨(dú)一無二的，因此，它的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)， 三級結(jié)構(gòu)的研究并與其他相關(guān)的酶比較研究就顯得尤為重要，不同來源的新普魯蘭酶是否 具有同樣的性質(zhì)，研究它們的同源性比較及與淀粉酶家族的同源性比較有著重要意義。
[0006] 新普魯蘭酶工業(yè)化生產(chǎn)菌種極少，目前為止，國外研究開發(fā)的菌種只有五到六種， 文獻(xiàn)報道的主要菌種有嗜熱脂肪芽孢桿菌TRS40 (Bacillus stearothermophilusTRS40) 、普通高溫放線菌R247 (Thermoactinomyces vulgaris R247)、嗜堿性芽孢桿菌 (Alkalophilic Bacillus)、多粘芽抱桿菌（Bacillus polymyxa)、環(huán)脂酸芽抱桿菌 (Alicyclobacillus acidocaldarius)等，大多數(shù)菌種都處于菌種選育與理論研究階段，而 國內(nèi)在這方面的研究還未見報道。淀粉水解酶在淀粉水解糖、淀粉糖衍生物和淀粉發(fā)酵產(chǎn) 品生產(chǎn)中起著決定性的作用。性能穩(wěn)定、酶活力高、多功能的新普魯蘭酶產(chǎn)品開發(fā)和利用可 大幅度提高淀粉轉(zhuǎn)化率，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益，同時還可增加淀粉用途，生產(chǎn)出新品種，促 進(jìn)淀粉加工業(yè)的快速發(fā)展。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 基于上述，本發(fā)明的目的在于提供一種新普魯蘭酶的制備和分離方法。
[0008] 本發(fā)明采用的微生物菌種為中國普通微生物保藏管理中心保藏的嗜熱脂肪芽孢 桿菌（Bacillus stearothermophilus Typestrain )，保藏編號為 CGMCC1. 1923。
[0009] 本發(fā)明以初始的嗜熱脂肪芽孢桿菌為出發(fā)菌種，經(jīng)培養(yǎng)，篩選，液體發(fā)酵培養(yǎng)后得 到一定密度的菌細(xì)胞培養(yǎng)液，然后經(jīng)離心、細(xì)胞破碎、硫酸銨鹽析、柱層析分離后得到液體 新普魯蘭酶。下面進(jìn)行詳細(xì)分述： 一種新普魯蘭酶的制備和分離方法，其步驟分為： 1.試管斜面培養(yǎng) 1. 1試管斜面培養(yǎng)基配制：培養(yǎng)基配方：蛋白胨9~12g，酵母粉2~5g，牛肉膏2~5g，NaCl 3?6g，瓊脂18?25g，NaH2P04 0. 1?0. 5g，葡萄糖1?3g，蒸餾水0. 8?1L，將以上試劑放入2L不 銹鋼容器中不斷加熱攪拌，溫度至5(T60°C全部溶解，并調(diào)整液體pH為5. (Γ7. 0,將溶解后 的液體分別裝入15 _ X 150 mm規(guī)格的試管中，每只試管裝入8~10ml，透氣娃膠試管塞封 口后，在121°C，滅菌2(T30 min后將試管放置1(Γ15度角斜面上，待培養(yǎng)基凝固后備用； 1. 2菌種試管斜面培養(yǎng)：將嗜熱脂肪芽孢桿菌在無菌條件下用接種針接入試管斜面培 養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中50°C?55°C條件下靜置培養(yǎng)18~24小時，此時細(xì)菌菌落生長至全部覆 蓋培養(yǎng)基表層，菌種斜面培養(yǎng)完成，備用； 2. 菌種試管液體培養(yǎng) 2. 1試管液體培養(yǎng)制備：液體試管培養(yǎng)基配方：蛋白胨9~12g，酵母粉2~5g，牛肉膏 2?5g，NaC13?6g，NaH 2P04 0· 1 ?0· 5g，葡萄糖 1 ?3g, 蒸餾水0. 8~1L。將以上試劑放入2L不銹鋼容器中不斷加熱攪拌，溫度至5(T60°C全部 溶解，并調(diào)整液體pH為5. (Γ7. 0 ;將溶解后的液體分別裝入15 mm X 150 mm規(guī)格的試管 中，每只試管裝入l(Tl2ml，透氣硅膠試管塞封口后121°C，20?30min滅菌，待培養(yǎng)基冷卻 至常溫后備用； 2. 2菌種試管液體培養(yǎng)：將嗜熱脂肪芽孢桿菌在無菌條件下用接種針將斜面培養(yǎng)菌株 接入試管液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中50°C?55°C條件下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)20?36小時，振蕩 轉(zhuǎn)速120?150r/ min，備用； 3. 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng) 3. 1產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)制備：培養(yǎng)基配方：蛋白胨l(Tl5g，酵母粉5~8g，牛肉膏5~8g，NaCl 5?8g，NaH2P04 0. 1?0. 5g，葡萄糖1?3g，蒸餾水1. (Tl. 2L ;將以上試劑放入2L不銹鋼容器中 不斷加熱攪拌，溫度至5(T60°C全部溶解，并調(diào)整液體pH為5. (Γ7. 0。將溶解后的液體分別 裝入500ml規(guī)格的三角瓶中，每只瓶裝入15(T200ml，紗布包裹的棉塞封口，牛皮紙包裹嚴(yán) 實后121°C，20?30min滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至常溫后備用； 3. 2三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將2. 2備用的試管液體培養(yǎng)菌種在無菌條件下轉(zhuǎn)接入三角瓶液 體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中50°C?55°C條件下振蕩培養(yǎng)48?72小時，振蕩轉(zhuǎn)速18(T200r/ min，得到嗜熱脂肪芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液；測定培養(yǎng)基菌密度吸收00540^(1(3111) > 2. 0時結(jié) 束培養(yǎng)； 4.新普魯蘭酶的分離方法 4. 1菌細(xì)胞收集和破碎 將3. 2得到嗜熱脂肪芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)5000?8000g離心l(Tl5min，收集上清 的無細(xì)胞液備用；沉淀的菌細(xì)胞使用50 mM pH6.0磷酸緩沖液（PBS)懸浮后移入細(xì)胞破碎 機(jī)中，在800?lOOOBar壓力下0?4°C破碎1?5min，菌體破碎液經(jīng)10000?12000g離 心15~20min,棄去沉淀，收集上清的備用； 4. 2新普魯蘭酶粗酶液的制備 取4. 1無細(xì)胞液或菌體破碎后的上清液，分別用0. 75?0. 80mol的硫酸銨0?4°C鹽 析18?24小時，12000?15000g離心15?20min，棄去上清液，沉淀溶于pH6. 0, 50mM PBS 中，透析去除硫酸銨，離心除去沉淀后得到新普魯蘭酶粗酶液； 5. 新普魯蘭酶的柱層析分離 將4. 2新普魯蘭酶粗酶液裝入透析袋中，放入底部鋪有聚乙二醇20000的平皿內(nèi)，0? 4°C濃縮，測定濃縮粗酶液的蛋白質(zhì)含量和酶活力；用50 mM pH6.0 PBS對10mmX800mm DEAE-52纖維素離子交換層析柱平衡4?6小時，取濃縮粗酶液加入層析柱，用pH6. 0， 50mM PBS平衡至使用紫外分光光度儀在0D28Qnm檢測平衡洗脫液無蛋白吸收峰，再用含50mM /L NaCl的pH6. 0, 50mM PBS洗脫，流速0. 8?lmL/min，自動部分收集器收集洗脫液，每管 2~3mL，逐管測定蛋白質(zhì)含量和酶活力，并計算酶的比活力，收集酶活部分，并經(jīng)pH6. 0, 50mM PBS透析除去其他離子，聚乙二醇20000濃縮后得到純化的新普魯蘭酶。
[0010] 本發(fā)明的新普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)主要如下： ① 酶作用的最適pH : 5. 0?7. 0 ; ② 酶作用的穩(wěn)定溫度范圍：35?75°C ; ③ 純化酶分子量大?。篠DS-PAGE電泳分子量為58. 0?59. OKDa ; ④ 酶的抑制劑和激活劑：Ca2+、Mg2+、C〇2+、P04 3' HP042'H2P(V對酶有一定的激活作用， 而Fe 3+、Fe2+和EDTA對酶則有較強(qiáng)的抑制作用，酶在磷酸鹽緩沖液中很穩(wěn)定。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點和產(chǎn)生的有益效果是： 1.與普通的普魯蘭酶（pullulanase，PU，EC3. 2. 1. 41)相比，本發(fā)明制備的新普魯蘭酶 (neopullulanase，nPU，EC3. 2. 1. 135)是一種多功能淀粉酶，性能穩(wěn)定、酶活力高、分離純化 的新普魯蘭酶耐酸堿，耐高溫，同時具有催化水解α - (1，4)-和α _(1，6)-糖苷鍵及催 化二者間的相互轉(zhuǎn)糖苷的雙重作用，能大幅度提高淀粉轉(zhuǎn)化率，同時還可增加淀粉用途，生 產(chǎn)出新品種。新普魯蘭酶可廣泛用于淀粉加工業(yè)特別是淀粉的生物轉(zhuǎn)化加工領(lǐng)域，具有顯 著的經(jīng)濟(jì)效益。
[0012] 2.在淀粉加工工業(yè)特別是淀粉的糖化過程中添加新普魯蘭酶，可同時作為脫支酶 和淀粉酶使用，快速提高淀粉水解速度，增加淀粉利用率；在焙烤加工過程中，此酶可適應(yīng) ρΗ5. 0?7. 0酸性環(huán)境和65-75°C的高溫環(huán)境，適合于淀粉加工業(yè)特別是淀粉的生物轉(zhuǎn)化加 工。
[0013] 3.本發(fā)明制備新普魯蘭酶使用中國普通微生物保藏管理中心保藏的嗜熱脂肪芽 孢桿菌(保藏編號為CGMCC1. 1923)為初始出發(fā)菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，菌種易得，液體粗酶液容易 發(fā)酵得到。分離純化的新普魯蘭酶耐酸堿，耐高溫，應(yīng)用范圍廣，具有良好市場推廣前景。
[0014]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1為嗜熱脂肪芽孢桿菌細(xì)胞破碎前（比例10X 100)形態(tài)顯微鏡檢圖。
[0016] 圖2為嗜熱脂肪芽孢桿菌細(xì)胞破碎后（比例10 X 100)形態(tài)顯微鏡檢圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明再作進(jìn)一步的說明： 本實施例采用的菌種為嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus Typestrain )〇
[0018] 實施例： 一種新普魯蘭酶的制備和分離方法，其步驟分為： 1.試管斜面培養(yǎng) 1. 1試管斜面培養(yǎng)基配制：培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，酵母粉3g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊 脂20g，NaH2P04 0. lg，葡萄糖lg，蒸餾水1L ;將以上試劑放入2L不銹鋼容器中不斷加熱攪 拌，溫度為至60°C全部溶解，并調(diào)整液體pH為7.0;將溶解后的液體分別裝入15 mm X 150 mm規(guī)格的試管中，每只試管裝入8?10ml，透氣娃膠試管塞封口后，在121°C，滅菌20 min 后，將試管放置10?15度角斜面上，待培養(yǎng)基凝固后備用。1L培養(yǎng)基可制備100?120只 試管斜面培養(yǎng)基； 1. 2菌種試管斜面培養(yǎng)：將嗜熱脂肪芽孢桿菌在無菌條件下用接種針接入試管斜面培 養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中50°C?55°C條件下靜置培養(yǎng)18?24小時，此時細(xì)菌菌落生長至全部 覆蓋培養(yǎng)基表層，菌種斜面培養(yǎng)完成，備用； 2. 菌種試管液體培養(yǎng) 2. 1試管液體培養(yǎng)制備：液體試管培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，酵母粉3g，牛肉膏3g，NaCl 5g，NaH 2P04 0. lg，葡萄糖lg，蒸餾水1L。將以上試劑放入2L不銹鋼容器中不斷加熱攪拌， 溫度至60°C全部溶解，并調(diào)整液體pH為7.0。將溶解后的液體分別裝入15 mm X 150 mm 規(guī)格的試管中，每只試管裝入10?12ml，透氣娃膠試管塞封口后121°C，20 min滅菌。待 培養(yǎng)基冷卻至常溫后備用。1L液體培養(yǎng)基可制備80?100只試管液體培養(yǎng)基。
[0019] 2. 2菌種試管液體培養(yǎng)：將嗜熱脂肪芽孢桿菌在無菌條件下用接種針將斜面培養(yǎng) 菌株接入試管液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中50°C?55°C條件下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)20?36小時， 振蕩轉(zhuǎn)速150r/min，備用。
[0020] 3.產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng) 3. 1產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)制備：培養(yǎng)基配方：蛋白胨12g，酵母粉5g，牛肉膏5g，NaCl 6g， NaH2P04 0. lg，葡萄糖lg，蒸餾水1L。將以上試劑放入2L不銹鋼容器中不斷加熱攪拌，溫 度至60°C全部溶解，并調(diào)整液體pH為7. 0。將溶解后的液體分別裝入500ml規(guī)格的三角瓶 中，每只瓶裝入150ml，紗布包裹的棉塞塞封口，牛皮紙包裹嚴(yán)實后121 °C，20 min滅菌，待 培養(yǎng)基冷卻至常溫后備用。1L液體培養(yǎng)基可制備6瓶三角瓶液體培養(yǎng)基。
[0021] 3. 2三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將備用的試管液體培養(yǎng)菌種在無菌條件下轉(zhuǎn)接入三角瓶液 體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中50°C?55°C條件下振蕩培養(yǎng)48?72小時，振蕩轉(zhuǎn)速200r/ min。 測定培養(yǎng)基菌密度吸收(?540Μ (1cm)彡2. 0時培養(yǎng)結(jié)束。
[0022] 4.新普魯蘭酶的分離方法 4. 1菌細(xì)胞收集和破碎 將3. 2所得嗜熱脂肪芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液1000ml經(jīng)5000?8000g離心lOmin，收集 上清的無細(xì)胞液800ml備用。在沉淀的菌細(xì)胞200g中加入100ml，50 mM pH6. 0 PBS懸 浮后移入細(xì)胞破碎機(jī)中，在800?lOOOBar壓力下0?4°C破碎1?5min。挑取細(xì)胞破碎 液涂于載玻片上，使用美蘭染色液染色，在顯微鏡（10X 100)下鏡檢細(xì)胞破碎效果(破碎前 后的菌細(xì)胞形態(tài)顯微鏡檢見附圖1和圖2)。菌體破碎液280ml經(jīng)10000?12000g離心 15min，棄去細(xì)胞破碎沉淀物，收集上清265ml備用。如上清液體中含糖時還需使用超濾膜 (E2012C-28D，截流分子量上限彡1000)除去糖類物質(zhì)。
[0023] 4. 2新普魯蘭酶粗酶液的制備 取4. 1中無細(xì)胞液800ml和菌體破碎后的上清液265ml，分別用0. 75?0. 80mol的硫酸 銨0?4°C鹽析18?24小時，12000?15000g離心15min，棄去上清液，合并沉淀25g溶于 50ml，50mM pH6. 0PBS中，透析去除硫酸銨，離心除去沉淀后得到新普魯蘭酶粗酶液100ml。 并依照公式：
【權(quán)利要求】
1. 一種新普魯蘭酶的制備和分離方法，其步驟分為：
1.試管斜面培養(yǎng) 1. 1試管斜面培養(yǎng)基配制：培養(yǎng)基配方：蛋白胨9~12g，酵母粉2~5g，牛肉膏2~5g，NaCl 3?6g，瓊脂18?25g，NaH2P04 0. 1?0. 5g，葡萄糖1?3g，蒸餾水0. 8?1L，將以上試劑放入2L不 銹鋼容器中不斷加熱攪拌，溫度至5(T60°C全部溶解，并調(diào)整液體pH為5. (Γ7. 0,將溶解后 的液體分別裝入15 _ X 150 mm規(guī)格的試管中，每只試管裝入8~10ml，透氣娃膠試管塞封 口后，在121°C，滅菌2(T30 min后將試管放置1(Γ15度角斜面上，待培養(yǎng)基凝固后備用； 1. 2菌種試管斜面培養(yǎng)：將嗜熱脂肪芽孢桿菌在無菌條件下用接種針接入試管斜面培 養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中50°C?55°C條件下靜置培養(yǎng)18~24小時，此時細(xì)菌菌落生長至全部覆 蓋培養(yǎng)基表層，菌種斜面培養(yǎng)完成，備用；
2. 菌種試管液體培養(yǎng) 2. 1試管液體培養(yǎng)制備：液體試管培養(yǎng)基配方：蛋白胨9~12g，酵母粉2~5g，牛肉膏 2?5g，NaC13?6g，NaH 2P04 0. 1?0. 5g，葡萄糖1?3g，蒸餾水0. 8?1L ;將以上試劑放入2L不銹 鋼容器中不斷加熱攪拌，溫度至5(T60°C全部溶解，并調(diào)整液體pH為5. (Γ7. 0 ;將溶解后的 液體分別裝入15 mm X 150 mm規(guī)格的試管中，每只試管裝入l(Tl2ml，透氣娃膠試管塞封 口后121°C，20?30min滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至常溫后備用； 2. 2菌種試管液體培養(yǎng)：將嗜熱脂肪芽孢桿菌在無菌條件下用接種針將斜面培養(yǎng)菌株 接入試管液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中50°C?55°C條件下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)20?36小時，振蕩 轉(zhuǎn)速120?150r/ min，備用；
3. 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng) 3. 1產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)制備：培養(yǎng)基配方：蛋白胨l(Tl5g，酵母粉5~8g，牛肉膏5~8g，NaCl 5?8g，NaH2P04 0. 1?0. 5g，葡萄糖1?3g，蒸餾水1. (Tl. 2L ;將以上試劑放入2L不銹鋼容器中 不斷加熱攪拌，溫度至5(T60°C全部溶解，并調(diào)整液體pH為5. (Γ7. 0 ;將溶解后的液體分別 裝入500ml規(guī)格的三角瓶中，每只瓶裝入15(T200ml，紗布包裹的棉塞塞封口，牛皮紙包裹 嚴(yán)實后121°C，20?30min滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至常溫后備用； 3. 2三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將2. 2備用的試管液體培養(yǎng)菌種在無菌條件下轉(zhuǎn)接入三角瓶液 體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中50°C?55°C條件下振蕩培養(yǎng)48?72小時，振蕩轉(zhuǎn)速18(T200r/ min，得到嗜熱脂肪芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液；測定培養(yǎng)基菌密度吸收00540^(1(3111) > 2. 0時結(jié) 束培養(yǎng)；
4. 新普魯蘭酶的分離方法 4. 1菌細(xì)胞收集和破碎 將3. 2得到嗜熱脂肪芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)5000?8000g離心l(Tl5min，收集上清 的無細(xì)胞液備用；沉淀的菌細(xì)胞使用50 mM pH6.0磷酸緩沖液（PBS)懸浮后移入細(xì)胞破碎 機(jī)中，在800?lOOOBar壓力下0?4°C破碎1?5min，菌體破碎液經(jīng)10000?12000g離 心15~20min,棄去沉淀，收集上清的備用； 4. 2新普魯蘭酶粗酶液的制備 取4. 1無細(xì)胞液或菌體破碎后的上清液，分別用0. 75?0. 80mol的硫酸銨0?4°C鹽 析18?24小時，12000?15000g離心15?20min，棄去上清液，沉淀溶于pH6. 0, 50mM PBS 中，透析去除硫酸銨，離心除去沉淀后得到新普魯蘭酶粗酶液；
5.新普魯蘭酶的柱層析分離 將4. 2新普魯蘭酶粗酶液裝入透析袋中，放入底部鋪有聚乙二醇20000的平皿內(nèi)，0? 4°C濃縮，測定濃縮粗酶液的蛋白質(zhì)含量和酶活力；用50 mM pH6.0 PBS對10mmX800mm DEAE-52纖維素離子交換層析柱平衡4?6小時，取濃縮粗酶液加入層析柱，用pH6. 0， 50mM PBS平衡至使用紫外分光光度儀在OD28Qnm檢測平衡洗脫液無蛋白吸收峰，再用含50mM /L NaCl的pH6. 0, 50mM PBS洗脫，流速0. 8?lmL/min，自動部分收集器收集洗脫液，每管 2~3mL，逐管測定蛋白質(zhì)含量和酶活力，并計算酶的比活力，收集酶活部分，并經(jīng)pH6. 0, 50mM PBS透析除去其他離子，聚乙二醇20000濃縮后得到純化的新普魯蘭酶。
【文檔編號】C12N9/44GK104120117SQ201310141067
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月23日
【發(fā)明者】胡先望, 杜健泉, 梁寧, 吳潤, 王雄, 陳朋, 嚴(yán)曉娟 申請人:甘肅省商業(yè)科技研究所