專利名稱：納米金顆粒在dna折紙芯片上的可控分布方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是ー種納米技術(shù)領(lǐng)域的分布方法，特別是基于非對(duì)稱ニ維DNA折紙術(shù)芯片為模板，構(gòu)建5nm納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法。
背景技術(shù)：
納米金(nanogold)是指金的微小顆粒,其直徑為I 一 IOOnm,—般為分散在水中形 成的膠體溶液，故又稱膠體金。在納米金顆粒表面吸附著某種化學(xué)物質(zhì)，單體納米金顆粒是非常穩(wěn)定的。金納米粒子電子密度高，具有量子尺寸效應(yīng)，小體積效應(yīng)和表面效應(yīng)，可以通 過(guò)靜電引力、疏水效應(yīng)等多種作用形式與大分子結(jié)合形成穩(wěn)定的膠體金探針。在過(guò)去40多年來(lái)，納米金顆粒已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于免疫細(xì)胞化學(xué)以及生物標(biāo)記等生物技術(shù)中。2006年，加州理工大學(xué)的Rothemund提出、設(shè)計(jì)、并實(shí)現(xiàn)了 DNA折紙術(shù)。[RothemundPw. Nature2006,440, 297)。Rothemund在最初的文章中折出了六種圖形，雖然各具特色，但不難發(fā)現(xiàn)它們?nèi)渴菍?duì)稱圖形。DNA折紙術(shù)排布納米金按照方式方法的不同大體可分為三類第一類是寡核苷酸雜交法。在納米金顆粒上修飾某寡核苷酸鏈(實(shí)際ー個(gè)金球表面會(huì)連很多鏈)，然后把它加入折紙術(shù)圖形中，由于訂書(shū)釘鏈上會(huì)伸出與該寡核苷酸鏈互補(bǔ)的探針，所以金球?qū)⑼ㄟ^(guò)核酸鏈的雜交而結(jié)合到圖形的特定位置上[しJD，PintoY，SeelllanNc, et al. Nano LetterS 2004,4,2343]。第二類是直接組裝法。既然納米金可以與DNA結(jié)合，那么就有可能讓其直接參與折紙術(shù)圖形自組裝過(guò)程，自組裝完成的同時(shí)，也就形成了這些小分子的排布[SharmaJ, ChhabraR, Andersen CS, et al. J Am Chem Soc 2008，130，7820]。第三類是其他方法。其他連接納米金的方法還有很多，比如Chengde Mao組開(kāi)發(fā)的分子光刻法(molecular lithography)〔DengZ,Mao C. Angew Chem Int Ed Engl2004,43，4068〕，等等。公開(kāi)文獻(xiàn)記載了張釗等在先進(jìn)材料上發(fā)表名為空間可尋址免索引的液相非対稱DNA折紙芯片文章中公開(kāi)了 DNA折紙芯片訂書(shū)釘鏈序列表[zhaoz, Yingw, et al. AdyMater2010，22,1],該文利用仿中國(guó)地圖形狀的非対稱ニ維DNA折紙術(shù)為模板，在模板上設(shè)計(jì)和引出特定的寡核苷酸序列作為連接位點(diǎn)，通過(guò)和修飾了互補(bǔ)序列DNA短鏈的生物素ー親和素系統(tǒng)雜交結(jié)合，把納米粒子結(jié)合到折紙芯片上，同吋，還對(duì)納米粒子的結(jié)合位置進(jìn)行了比較。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法。本發(fā)明采用現(xiàn)有技術(shù)相同的DNA折紙芯片訂書(shū)釘鏈序列表，方向是從左到右為5’一 3’。但是，本發(fā)明中模板上設(shè)計(jì)結(jié)合位點(diǎn)的位置和伸出特定的寡核苷酸序列在制備DNA折紙芯片吋，需將帶伸出寡核苷酸捕獲探針的訂書(shū)釘鏈替換列表中相同序列號(hào)的訂書(shū)釘鏈即可。本發(fā)明通過(guò)利用寡核苷酸序列修飾和雜交的方法，在仿中國(guó)地圖形狀的納米折紙術(shù)結(jié)構(gòu)上連接5nm粒徑膠體金顆粒,從而實(shí)現(xiàn)納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布。本發(fā)明是通過(guò)以下三種技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 技術(shù)方案一技術(shù)方案一包括步驟如下第一歩，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個(gè)非對(duì)稱ニ維圖形，制備DNA折紙芯片；所述的非対稱ニ維圖形，在特定位置的訂書(shū)釘鏈末端伸出寡核苷酸捕獲探針，讓它與末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的目標(biāo)鏈ー對(duì)ー雜交。所述的非対稱ニ維圖形是依靠M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長(zhǎng)達(dá)7249個(gè)堿基腳手架長(zhǎng)鏈光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而圖形則來(lái)自用于綁定的229條短訂書(shū)釘鏈。所述的DNA折紙芯片的制備方法(I)把所有要用的IOOyM訂書(shū)釘鏈，包括形成非対稱ニ維圖形的、伸出探針的等體積混合，再稀釋20倍備用；訂書(shū)釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號(hào)為9。(2)在96孔板上混合總量為30 u I的溶液0. 025 u M訂書(shū)釘鏈22 U I ；1/2濃度的 M13mpl8 1 u I ； I X TAE-Mg2+buf f er 7u I0第二步，制備膠體金探針；第二步中所述的膠體金探針制備方法①寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比I加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫300rpm搖24小時(shí)。②加入終濃度0.1M NaCl，室溫300rpm搖48小時(shí)。③4°C, 15000rpm離心10分鐘，棄上清。④加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0.1M NaCl清洗兩次。⑤加入IxTE ；10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4で保存。⑥5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長(zhǎng)紫外吸收峰測(cè)定。第三步，粒徑膠體金探針與非対稱ニ維圖形DNA折紙芯片連接；第三步中所述的連接是指5nm粒徑膠體金探針與非対稱ニ維圖形DNA折紙芯片摩爾濃度比2比I混合，37°C水浴雜交I小吋。第四步，原子力顯微鏡成像；第四步中所述的原子力顯微鏡成像的步驟吸取2. 5iU樣品(實(shí)際2-5 Ul均可)滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)ー使用輕敲模式，液相成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，采用技術(shù)方案一所述方法，納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率能達(dá)到10%左右。技術(shù)方案ニ考慮到連接在金膠顆粒上的寡核苷酸探針存在著大約50°C的活性溫度閾值(meltingtemperature),低于該溫度寡核苷酸探針吸附在金膠顆粒表面而喪失了大部分和捕獲探針鏈鏈接的能力，結(jié)果導(dǎo)致連接效率很低。當(dāng)雜交溫度高于50°C時(shí)，仿中國(guó)地圖折紙圖形會(huì)出現(xiàn)局部熱降解和不規(guī)則連接，失去原有形貌。所以雜交固定在靠近金顆粒底部寡核苷酸探針上，以避免寡核苷酸探針吸附在金膠顆粒表面影響連接效率。技術(shù)方案ニ包括步驟如下第一歩，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個(gè)非對(duì)稱ニ維圖形，制備DNA折紙芯片；所述的非対稱ニ維圖形是依靠M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長(zhǎng)達(dá)7249個(gè)堿基腳手架長(zhǎng)鏈光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而圖形則來(lái)自用于綁定的229條短訂書(shū)釘鏈。所述的DNA折紙芯片的制備方法(I)把所有要用的IOOyM訂書(shū)釘鏈，包括形成非対稱ニ維圖形的、伸出探針的等 體積混合，再稀釋20倍備用；訂書(shū)釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號(hào)為9。(2)在96孔板上混合總量為30 U I的溶液0. 025 U M訂書(shū)釘鏈22 U I ；1/2濃度的 M13mpl8 1 u I ； I X TAE-Mg2+buf f er 7u I0第二步，制備膠體金探針；所述的膠體金探針，在膠體金探針連入地圖之前，先將ー個(gè)IOnt短鏈，在50°C時(shí)，雜交固定在靠近金顆粒底部寡核苷酸探針上。所述的膠體金探針制備方法包括以下步驟 ①寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比I加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫300rpm搖24小時(shí)。②加入終濃度0.1M NaCl，室溫300rpm搖48小時(shí)。③4°C, 15000rpm離心10分鐘，棄上清。④加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0.1M NaCl清洗兩次。⑤加入IxTE ；10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4で保存。⑥5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長(zhǎng)紫外吸收峰測(cè)定。第三歩，DNA短鏈與膠體金探針雜交；第三步中所述的雜交是指5nm粒徑膠體金探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比I比I混合，50°C水浴雜交I小吋。第四步，粒徑膠體金探針與非対稱ニ維圖形DNA折紙芯片連接；第四步中所述的連接是指5nm粒徑膠體金探針與非対稱ニ維圖形DNA折紙芯片摩爾濃度比2比I混合，37°C水浴雜交I小吋。第五步，原子力顯微鏡成像；第五步中所述的原子力顯微鏡成像的步驟吸取2. 5 Ul樣品(實(shí)際2-5 iU均可)滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)ー使用輕敲模式，液相成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，采用技術(shù)方案ニ所述方法，納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率略有提高，能達(dá)到15%左右。技術(shù)方案三技術(shù)方案三包括步驟如下第一歩，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個(gè)非對(duì)稱ニ維圖形，制備DNA折紙芯片；
所述的非対稱ニ維圖形，在特定位置附近伸出三條訂書(shū)釘鏈末端修飾寡核苷酸捕獲探針，讓它們與同一個(gè)末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的報(bào)告探針鏈三對(duì)ー雜交。所述的非対稱ニ維圖形是依靠M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長(zhǎng)達(dá)7249個(gè)堿基腳手架長(zhǎng)鏈光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而圖形則來(lái)自用于綁定的229條短訂書(shū)釘鏈。所述的DNA折紙芯片的制備方法(I)把所有要用的IOOyM訂書(shū)釘鏈，包括形成非対稱ニ維圖形的、伸出探針的等體積混合，再稀釋20倍備用；訂書(shū)釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號(hào)為9，10，22。(2)在96孔板上混合總量為30 U I的溶液0. 025 U M訂書(shū)釘鏈22 U I ；1/2濃度的 M13mpl8 1 u I ； I X TAE-Mg2+buf f er 7u I0第二步，制備膠體金探針；第二步中所述的膠體金探針制備方法①寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比I加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫300rpm搖24小時(shí)。②加入終濃度0.1M NaCl，室溫300rpm搖48小時(shí)。③4°C, 15000rpm離心10分鐘，棄上清。④加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0.1M NaCl清洗兩次。⑤加入IxTE ；10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4で保存。⑥5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長(zhǎng)紫外吸收峰測(cè)定。第三歩，DNA短鏈與膠體金探針雜交；第三步中所述的雜交是指5nm粒徑膠體金探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比I比I混合，50°C水浴雜交I小吋。第四步，粒徑膠體金探針與非対稱ニ維圖形DNA折紙芯片連接；
第四步中所述的連接是指5nm粒徑膠體金探針與非対稱ニ維圖形DNA折紙芯片摩爾濃度比2比I混合，37°C水浴雜交I小吋。第五步，原子力顯微鏡成像；第五步中所述的原子力顯微鏡成像的步驟吸取2. 5 Ul樣品(實(shí)際2-5 iU均可)滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)ー使用輕敲模式，液相成像。在折紙圖形特定位置附近伸出三條訂書(shū)釘鏈末端修飾寡核苷酸捕獲探針，讓它們與同一個(gè)末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的報(bào)告探針鏈三對(duì)ー雜交,再結(jié)合方案ニ，使得金顆粒空間位置得到有效控制同時(shí)增強(qiáng)了連接的穩(wěn)定性。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，采用技術(shù)方案三所述方法，納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率明顯提高，能達(dá)到95%以上。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1檢測(cè)條件本實(shí)施例采用DNA折紙術(shù)構(gòu)造了中國(guó)地圖的形狀，原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示所得到的中國(guó)地圖最長(zhǎng)處約150納米，最寬處約120納米，高度為2納米。此圖形是依靠腳手架長(zhǎng)鏈(M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長(zhǎng)達(dá)7249個(gè)堿基)光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而地案則來(lái)自用于綁定的229條短訂書(shū)釘鏈。此圖形的特點(diǎn)是229條訂書(shū)釘鏈就是兩百多個(gè)可尋址的潛在反應(yīng)位點(diǎn)，模版上的任何一點(diǎn)都可以利用圖形自身作為參照精確定位，無(wú)需索引標(biāo)記。另外，229條短DNA單鏈中的任意一條都可以伸出核苷酸序列作為捕獲探針與帶納米顆粒標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸序列進(jìn)行雜交，作為折紙圖形上納米顆粒的連接點(diǎn)。在利用此非對(duì)稱圖形為模板形成納米點(diǎn)分布時(shí)，利用模板復(fù)雜性來(lái)降低對(duì)納米點(diǎn)分布的復(fù)雜性要求。本實(shí)施例中所述的非対稱ニ維圖形，在特定位置的訂書(shū)釘鏈末端伸出寡核苷酸捕獲探針，讓它與末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的目標(biāo)鏈ー對(duì)ー雜交。本實(shí)施例以中國(guó)地圖為芯片基底，所有訂書(shū)釘鏈，包括形成地圖的、伸出探針的， 全部從上海捷瑞公司訂購(gòu)(PAGE純化)，且統(tǒng)ー用二次水稀釋到100 y M備用。腳手架鏈?zhǔn)褂肗EB公司的M13mpl8病毒單鏈，貨號(hào)N4040S。共7249base，濃度為0. 25 y g/ yl，總5 y g。由于Iy 0.42pmol，故濃度約0. lpM/yl = 0. liiM。實(shí)際稀釋到1/2濃度使用。不用酶切處理，保持環(huán)鏈狀態(tài)。5nm粒徑膠體金顆粒使用Sigma公司，貨號(hào)G1402。使用相同的反應(yīng)buffer和成像buffer :在I X TAE (Tris，40mM ;こ酸，20mM ；EDTA, 2mM)中加入こ酸鎂粉末,Mg2+終濃度為12. 5mM,pH8. O。使用美國(guó)Veeco/Digital Instruments公司的多模式原子力顯微鏡(Multimode AFM)觀測(cè)。J-scanner, NP-S針尖,共振頻率在7_10kHz之間。本實(shí)施例的納米顆粒的可控分布實(shí)施步驟如下兎一制備仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片1.把所有要用的訂書(shū)釘鏈(IOOyM)包括形成地圖的、伸出探針的等體積混合，再稀釋20倍備用。訂書(shū)釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號(hào)為9。2.在96孔板上按照以下體系混合溶液(以下是最“節(jié)省”的體系，實(shí)際做時(shí)可以整體翻倍，或単獨(dú)把腳手架鏈翻倍)訂書(shū)釘鏈(0.025 PM) 22 U IM13mpl8 (1/2 濃度)IulIX TAE-Mg2+buffer 7 U ITotal30 U I3.放在 PCR 儀(ABI 9700)上退火，95°C 降溫至 20°C，0. 1°C /IOs = 0. 6°C /min =rc /iooso第二制備5nm粒徑膠體金探針1.寡核苷酸與5nm粒徑膠體金顆粒摩爾濃度比200比I加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫300rpm搖24小時(shí)。2.加入終濃度0.1M NaCl，室溫300rpm搖48小時(shí)。3. 4°C, 15000rpm 離心 10 分鐘，棄上清。4.加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0.1M NaCl清洗兩次。5.加入 IxTE(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4で保存。
6. 5nm粒徑膠體金顆粒探針濃度利用0D260測(cè)定。第三5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片連接5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片摩爾濃度比2比I混合，37°C水浴雜交I小吋。第四原子力顯微鏡成像吸取2. 5 Ul樣品(實(shí)際2-5 Ul均可)滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)ー使用輕敲模式，液相成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，本實(shí)施例納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率能達(dá)到10%左右。
實(shí)施例2檢測(cè)條件本實(shí)施例采用DNA折紙術(shù)構(gòu)造了中國(guó)地圖的形狀，原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示所得到的中國(guó)地圖最長(zhǎng)處約150納米，最寬處約120納米，高度為2納米。此圖形是依靠腳手架長(zhǎng)鏈(M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長(zhǎng)達(dá)7249個(gè)堿基)光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而地案則來(lái)自用于綁定的229條短訂書(shū)釘鏈。此圖形的特點(diǎn)是229條訂書(shū)釘鏈就是兩百多個(gè)可尋址的潛在反應(yīng)位點(diǎn)，模版上的任何一點(diǎn)都可以利用圖形自身作為參照精確定位，無(wú)需索引標(biāo)記。另外，229條短DNA單鏈中的任意一條都可以伸出核苷酸序列作為捕獲探針與帶納米顆粒標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸序列進(jìn)行雜交，作為折紙圖形上納米顆粒的連接點(diǎn)。在利用此非對(duì)稱圖形為模板形成納米點(diǎn)分布時(shí)，利用模板復(fù)雜性來(lái)降低對(duì)納米點(diǎn)分布的復(fù)雜性要求。本實(shí)施例中考慮到連接在金膠顆粒上的寡核苷酸探針存在著大約50°C的活性溫度閾值(melting temperature),低于該溫度寡核苷酸探針吸附在金膠顆粒表面而喪失了大部分和捕獲探針鏈鏈接的能力，結(jié)果導(dǎo)致連接效率很低。當(dāng)雜交溫度高于50°C時(shí)，仿中國(guó)地圖折紙圖形會(huì)出現(xiàn)局部熱降解和不規(guī)則連接，失去原有形貌。所以雜交固定在靠近金顆粒底部寡核苷酸探針上，以避免寡核苷酸探針吸附在金膠顆粒表面影響連接效率。本實(shí)施例以中國(guó)地圖為芯片基底，所有訂書(shū)釘鏈，包括形成地圖的、伸出探針的，全部從上海捷瑞公司訂購(gòu)(PAGE純化)，且統(tǒng)ー用二次水稀釋到100 y M備用。腳手架鏈?zhǔn)褂肗EB公司的M13mpl8病毒單鏈，貨號(hào)N4040S。共7249base，濃度為0. 25 y g/ yl，總5 y g。由于Iy 0.42pmol，故濃度約0. lpM/yl = 0. liiM。實(shí)際稀釋到1/2濃度使用。不用酶切處理，保持環(huán)鏈狀態(tài)。5nm粒徑膠體金顆粒使用Sigma公司，貨號(hào)G1402。使用相同的反應(yīng)buffer和成像buffer :在I X TAE (Tris，40mM ;こ酸，20mM ；EDTA, 2mM)中加入こ酸鎂粉末,Mg2+終濃度為12. 5mM,pH8. O。使用美國(guó)Veeco/Digital Instruments公司的多模式原子力顯微鏡(Multimode AFM)觀測(cè)。J-scanner, NP-S針尖,共振頻率在7_10kHz之間。本實(shí)施例的納米顆粒的可控分布實(shí)施步驟如下兎一制備仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片1.把所有要用的訂書(shū)釘鏈(IOOiiM)包括形成地圖的、伸出探針的等體積混合，再稀釋20倍備用。訂書(shū)釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號(hào)為9。2.在96孔板上按照以下體系混合溶液(以下是最“節(jié)省”的體系，實(shí)際做時(shí)可以整體翻倍，或単獨(dú)把腳手架鏈翻倍)訂書(shū)釘鏈(0.025iiM) 22 U I
M13mpl8(l/2 濃度)IulI X TAE-Mg2+buffer7 U ITotal30 u I3.放在 PCR 儀(ABI 9700)上退火，95°C 降溫至 20°C，0. 1°C/IOs = 0. 6°C/min =rc /iooso第二制備5nm粒徑膠體金探針1.寡核苷酸與5nm粒徑膠體金顆粒摩爾濃度比200比I加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫300rpm搖24小時(shí)。2.加入終濃度0.1M NaCl，室溫300rpm搖48小時(shí)。3. 4°C, 15000rpm 離心 10 分鐘，棄上清。4.加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0.1M NaCl清洗兩次?！?br>
5.加入 IxTE(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4で保存。6. 5nm粒徑膠體金顆粒探針濃度利用0D260測(cè)定。第三IOnt DNA短鏈與5nm粒徑膠體金顆粒探針雜交5nm粒徑膠體金顆粒探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比I比I混合，50°C水浴雜交I小時(shí)。第四5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片連接5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片摩爾濃度比2比I混合，37°C水浴雜交I小吋。第五原子力顯微鏡成像吸取2.5 Ul樣品(實(shí)際2-5 Ul均可)滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)ー使用輕敲模式，液相成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，本實(shí)施例納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率略有提聞，能達(dá)到15%左右。實(shí)施例3檢測(cè)條件本實(shí)施例采用DNA折紙術(shù)構(gòu)造了中國(guó)地圖的形狀，原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示所得到的中國(guó)地圖最長(zhǎng)處約150納米，最寬處約120納米，高度為2納米。此圖形是依靠腳手架長(zhǎng)鏈(M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長(zhǎng)達(dá)7249個(gè)堿基)光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而地案則來(lái)自用于綁定的229條短訂書(shū)釘鏈。此圖形的特點(diǎn)是229條訂書(shū)釘鏈就是兩百多個(gè)可尋址的潛在反應(yīng)位點(diǎn)，模版上的任何一點(diǎn)都可以利用圖形自身作為參照精確定位，無(wú)需索引標(biāo)記。另外，229條短DNA單鏈中的任意一條都可以伸出核苷酸序列作為捕獲探針與帶納米顆粒標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸序列進(jìn)行雜交，作為折紙圖形上納米顆粒的連接點(diǎn)。在利用此非對(duì)稱圖形為模板形成納米點(diǎn)分布時(shí)，利用模板復(fù)雜性來(lái)降低對(duì)納米點(diǎn)分布的復(fù)雜性要求。本實(shí)施例中在折紙圖形特定位置附近伸出三條訂書(shū)釘鏈末端修飾寡核苷酸捕獲探針，讓它們與同一個(gè)末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的報(bào)告探針鏈三對(duì)ー雜交,再結(jié)合方案ニ，使得金顆粒空間位置得到有效控制同時(shí)增強(qiáng)了連接的穩(wěn)定性。本實(shí)施例以中國(guó)地圖為芯片基底，所有訂書(shū)釘鏈，包括形成地圖的、伸出探針的，全部從上海捷瑞公司訂購(gòu)(PAGE純化)，且統(tǒng)ー用二次水稀釋到100 y M備用。腳手架鏈?zhǔn)褂肗EB公司的M13mpl8病毒單鏈，貨號(hào)N4040S。共7249base，濃度為0. 25 y g/yl，總5 y g。由于1^~0.42 11101，故濃度約0.1 11/111 = 0.1^。實(shí)際稀釋到1/2濃度使用。不用酶切處理，保持環(huán)鏈狀態(tài)。5nm粒徑膠體金顆粒使用Sigma公司，貨號(hào)G1402。使用相同的反應(yīng)buffer和成像buffer :在I X TAE (Tris，40mM ;こ酸，20mM ；EDTA, 2mM)中加入こ酸鎂粉末,Mg2+終濃度為12. 5mM,pH8. O。使用美國(guó)Veeco/Digital Instruments公司的多模式原子力顯微鏡(Multimode AFM)觀測(cè)。J-scanner, NP-S針尖,共振頻率在7_10kHz之間。本實(shí)施例的納米顆粒的可控分布實(shí)施步驟如下兎一制備仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片1.把所有要用的訂書(shū)釘鏈(IOOilM)包括形成地圖的、伸出探針的等體積混合，再稀釋20倍備用。訂書(shū)釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號(hào)為9 ，10，22。2.在96孔板上按照以下體系混合溶液(以下是最“節(jié)省”的體系，實(shí)際做時(shí)可以整體翻倍，或単獨(dú)把腳手架鏈翻倍)訂書(shū)釘鏈(0.025 PM) 22 U IM13mpl8(l/2 濃度)IulIX TAE-Mg2+buffer7 U ITotal30 u I3.放在 PCR 儀(ABI 9700)上退火，95°C 降溫至 20°C，0. 1°C /10s = 0. 6°C /min =rc /iooso第二制備5nm粒徑膠體金探針1.寡核苷酸與5nm粒徑膠體金顆粒摩爾濃度比200比I加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫300rpm搖24小時(shí)。2.加入終濃度0.1M NaCl，室溫300rpm搖48小時(shí)。3. 4°C, 15000rpm 離心 10 分鐘，棄上清。4.加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0.1M NaCl清洗兩次。5.加入 IxTE(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4で保存。6. 5nm粒徑膠體金顆粒探針濃度利用0D260測(cè)定。 第三IOnt DNA短鏈與5nm粒徑膠體金顆粒探針雜交5nm粒徑膠體金顆粒探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比I比I混合，50°C水浴雜交I小時(shí)。第四5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片連接5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片摩爾濃度比2比I混合，37°C水浴雜交I小吋。第五原子力顯微鏡成像吸取2.5 Ul樣品(實(shí)際2-5 Ul均可)滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)ー使用輕敲模式，液相成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，本實(shí)施例納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率明顯提高，能達(dá)到95%以上。DNA折紙芯片訂書(shū)釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列如下(直體部分是訂書(shū)釘鏈，斜體部分是伸出寡核苷酸捕獲探針，從左到右為5’ _3’，制備DNA折紙芯片時(shí)，替換相同序列號(hào)訂書(shū)釘鏈)9CGCCTAGTTGGACGGCGACACAGGAGGTAGTGCCGTCGAGAGGG (用于技術(shù)方案一，ニ，三)10CGCCTAGTTGGACGGCGACACAGTACCAGGCGGATATTAGCGGG (用于技術(shù)方案三) 22CGCCTAGTTGGACGGCGACAGTTTTGCTAAGAGAAGGATTAGGAGAGGCTGA (用于技術(shù)方案三)IOnt DNA短鏈序列(從左到右為5’ _3’)CGCCTAGTTG巰基基團(tuán)修飾報(bào)告探針序列(從左到右為5’ -3’ )
TGTCGCCGTCCAACTAGGCG-SH以上實(shí)施例的原子力顯微鏡成像結(jié)果分別顯示納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率能達(dá)到10% _15%，最高能達(dá)到95%以上。
權(quán)利要求
1.一種納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征在于，包括如下步驟第一步，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個(gè)非對(duì)稱二維圖形，制備DNA折紙芯片，第二步，制備膠體金探針，第三步，DNA短鏈與膠體金探針雜交，第四步，粒徑膠體金探針與非對(duì)稱二維圖形DNA折紙芯片連接，第五步，原子力顯微鏡成像，所述的膠體金探針，在膠體金探針連入地圖之前，先將一個(gè)IOnt短鏈，在50°C時(shí)，雜交固定在靠近金顆粒底部寡核苷酸探針上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征是，所述的DNA折紙芯片，其制備方法如下(1)把所有要用的ΙΟΟμΜ訂書(shū)釘鏈，包括形成非對(duì)稱二維圖形的、伸出探針的等體積混合，再稀釋20倍備用；(2)在96孔板上混合總量為30μ I的溶液0. 025 μ M訂書(shū)釘鏈22μ I ; 1/2濃度的 M13mpl8 1 μ I ；I XTAE-Mg2+buffer :7μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征是，所述的膠體金探針，其制備方法①寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比I加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫 300rpm搖24小時(shí)；②加入終濃度O.1M NaCl，室溫300rpm搖48小時(shí)；③4°C，15000rpm離心10分鐘,棄上清；④加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度O.1M NaCl清洗兩次；⑤加入IXTE ；10mM Tris-HCl，ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存；⑥5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長(zhǎng)紫外吸收峰測(cè)定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征是，所述的雜交是指5nm粒徑膠體金探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比I比I混合，50°C水浴雜交I 小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征是，所述的連接是指5nm粒徑膠體金探針與非對(duì)稱二維圖形DNA折紙芯片摩爾濃度比2比I混合， 37°C水浴雜交I小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征是，所述的原子力顯微鏡成像是指吸取2-5 μ I樣品滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原子力顯微鏡下成像。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其包括如下步驟第一步，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個(gè)非對(duì)稱二維圖形，制備DNA折紙芯片；第二步，制備膠體金探針；第三步，DNA短鏈與膠體金探針雜交；第四步，粒徑膠體金探針與非對(duì)稱二維圖形DNA折紙芯片連接；第五步，原子力顯微鏡成像；所述的膠體金探針，在膠體金探針連入地圖之前，先將一個(gè)10nt短鏈，在50℃時(shí)，雜交固定在靠近金顆粒底部寡核苷酸探針上；本發(fā)明在極微量生化檢測(cè)芯片研制，納米器件開(kāi)發(fā)，納米粒子基本性質(zhì)研究等學(xué)科領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用空間。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103014146SQ20121036295
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者賀林, 李璨, 馮曉錄, 陳培華 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)