專利名稱：一種控制細(xì)菌纖維素聚合度的細(xì)菌纖維素微生物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種控制細(xì)菌纖維素聚合度的細(xì)菌纖維素微生物制備方法。
背景技術(shù)：
在1886年，A. J. Brown就首次報(bào)道由木醋桿菌合成一種凝膠物質(zhì)，并用化學(xué)分析方法確定為纖維素。但直到20世紀(jì)下半葉細(xì)菌纖維素(BC)具有許多獨(dú)特性質(zhì)才引起人們廣泛關(guān)注。細(xì)菌纖維素是小分子的碳水化合物經(jīng)微生物發(fā)酵形成的纖維類物質(zhì)。與傳統(tǒng)植物纖維素相比，細(xì)菌纖維素有許多優(yōu)良性能，如高純度、高聚合度、高結(jié)晶度、高親水性、高 楊氏模量、高強(qiáng)度和較好的生物相容性。因此，細(xì)菌纖維素作為ー種天然的生物聚合物受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注，在食品エ業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、造紙、聲學(xué)器材和石油開采等方面應(yīng)用前景廣闊。聚合度是高聚物重要的性能指標(biāo)，同樣聚合度也是細(xì)菌纖維素的ー項(xiàng)重要性能。纖維素聚合度表征纖維素分子鏈的長短，一般來見，細(xì)菌纖維素具有高聚合度的特征，具有較高的機(jī)械強(qiáng)度、高結(jié)晶度、高親水性、高楊氏模量和良好的生物相容性，故可應(yīng)用于食品、造紙、醫(yī)藥等領(lǐng)域。聚合度上升時(shí)，纖維素強(qiáng)度加大。但高聚合度也使細(xì)菌纖維素的溶解成為一大難題，使其應(yīng)用受到較大的限制；低聚合度的細(xì)菌纖維素其機(jī)械強(qiáng)度下降、還原性增強(qiáng)、堿溶能力増加，生物活性更強(qiáng)，吸濕能力也發(fā)生改變，低聚合度的細(xì)菌纖維素更適合做細(xì)菌纖維素的原料。細(xì)菌纖維素的聚合度在500-18000左右，木醋桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素結(jié)晶度高于普通高等植物纖維，而低于藻類(valinia)和動(dòng)物纖維(tunicin)。據(jù)測定，Ax菌纖維素的聚合度為16000，優(yōu)質(zhì)棉纖維為1300(Γ14000，棉短絨為5000左右，木漿纖維素為700(Γ10000，植物中聚合度最高的為單球囊藻纖維達(dá)2650(Γ44000 ;天然纖維中精制棉的平均聚合度為250-200，未漂白亞硫酸鹽木漿400-250 ;漂白亞硫酸鹽木漿280-200，漂白硫酸鹽木漿190-140，球磨木制纖維素100-80 ;再升纖維中的絲線20-30 ;輪胎簾子線30-15 ；。纖維素的聚合度低于700時(shí)，斷裂強(qiáng)度急劇降低，低于200時(shí)多碎裂成粉末，不再具有纖維特性。有學(xué)者研究表明，聚合度對纖維素表面性能是有影響的。結(jié)果表明纖維素的表面能隨分子量(聚合度)的增加而増大。研究還發(fā)現(xiàn)纖維素的表面能Y S與聚合度DP之間的關(guān)系大致可以描述為Y s = 37. 56 + O. 02DP，而纖維素的極性率P與聚合度DP之間的關(guān)系則是ー種非線性關(guān)系，如=P = 11. 88 — O. 02DP + 9. IODP20 DP約在1000左右時(shí)有可能導(dǎo)致極性率最小。由于細(xì)菌纖維素具有高聚合度的特征，從而使細(xì)菌纖維素的溶解成為一大難題，也使其應(yīng)用受到較大的限制。因此，目前國內(nèi)外有少數(shù)研究者有少量關(guān)于細(xì)菌纖維素溶解的研究，通過采用不同的溶解或降解方法達(dá)到降低細(xì)菌纖維素聚合度的目的。采用的方法有在化學(xué)或物理因素的作用下，細(xì)菌纖維素發(fā)生功能基轉(zhuǎn)化，聚合度下降并引起葡萄糖基中碳ー碳鍵、碳ー氧鍵斷裂，直至完全裂解轉(zhuǎn)化，生成各種小分子化合物的反應(yīng)稱為纖維素的降解。方式有水解、氧化降解、機(jī)械降解、熱降解、光化學(xué)降解等。研究較多的纖維素溶劑主要有強(qiáng)堿、N-甲基嗎啉-N-氧化物(NMMO)、氯化鋰-ニ甲基こ酰胺(LiCl DMAC)等，這些溶劑存在著不穩(wěn)定、有毒害、不易回收、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。如論文“細(xì)菌纖維素在NMMO · H2O中的溶解性能”《分子材料科學(xué)與工程》，2011年第06期，27 (6):80-83研究的細(xì)菌纖維素在NMMO · H2O中的溶解行為，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌纖維素由I型轉(zhuǎn)變?yōu)镮I型；論文“細(xì)菌纖維素在室溫離子液體中的溶解性能”《功能高分子學(xué)報(bào)》，2009，2 (4):349-355研究了 [AMM]C1對BC的溶解作用，發(fā)現(xiàn)AMM]Cl對細(xì)菌纖維素的溶解作用是直接溶解。溶解過程中，BC細(xì)菌纖維素的結(jié)晶度下降，分子間的氫鍵作用力削弱，結(jié)晶結(jié)構(gòu)受到破壞，發(fā)生了從纖維素N到纖維素0的晶型轉(zhuǎn)變，且再生后的細(xì)菌纖維素?zé)o定型區(qū)增多。發(fā)明專利201010598451. 1“一種高聚合度細(xì)菌纖維素的溶解方法”(東華大學(xué))，就是將聚合度為1500-1600的細(xì)菌纖維素用NaOH水溶液水煮，之后用蒸餾水洗滌至中性，真空干燥，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%-80%的ZnCl2水溶液進(jìn)行溶解；發(fā)明專利200910046940. 3 “ー種高聚合度細(xì)菌纖維素纖維的制備方法”描述的是一種高聚合度細(xì)菌纖維素纖維的制備方法，包括，(I)將 細(xì)菌纖維素溶解在溶劑中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I 30%的細(xì)菌纖維素溶液，過濾，靜置脫泡，得紡絲溶液(2)將步驟(I)紡絲溶液經(jīng)噴絲孔噴出后固化成型，再經(jīng)過拉伸，水洗，定型和干燥這幾道常規(guī)エ序后制成成品。通常將纖維素分子鏈包含単體的平均數(shù)稱為聚合度(DP)。聚合度的測定方法有很多，如滲透壓法、光散射法、超速離心法和粘度法等。目前較常用的是粘度法，以毛細(xì)管粘度計(jì)和落球式粘度計(jì)為主。通常用銅氨、銅こニ銨和鉻こニ銨溶液為溶剤，效果較好，而且裝置簡單，便于操作，適合在生產(chǎn)中隨時(shí)檢測。本發(fā)明中采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的聚合度。具體方法如下稱取干細(xì)菌纖維素溶于銅-こニ胺溶液中，配制成纖維素濃度為c的溶液。測細(xì)菌纖維素在銅-こニ胺溶液中的相對粘度も，增比粘度nsp。根據(jù)單點(diǎn)法測定高聚物溶液
特性粘度[n]的通用公式咖]』，:1，)。根據(jù)Mark-Houwink 經(jīng)驗(yàn)方程！! η ]=kMa，k、a 為常數(shù)。由《Polymer DataHandbook》查的得k、α值，求得粘均分子量M。由平均聚合度(DP) = g公式，求得纖維素的平均聚合度。目前，國內(nèi)主要集中研究在發(fā)酵優(yōu)化提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量方面。細(xì)菌纖維素的發(fā)酵生產(chǎn)一般是在含葡萄糖的復(fù)雜營養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行的，Son HJ等采用Acetobacter sp. V6、在如下培養(yǎng)基[I. 5%葡萄糖，O. 2%(NH4)2SO4, O. 3%KH2P04, O. 3%Na2HP04 · 12H20, O. 08%MgS04 ·7Η20，0. 0005%FeS04 ·7Η20, 0. 0003%H3B03, 0 . 00 0 0 5% 煙酰胺，和 O. 6% こ醇]中搖瓶發(fā)酵 8 天、轉(zhuǎn)速200r/m,BC的產(chǎn)量最高達(dá)4. 16g/L。而米用Acetobacter sp.A9、在如下培養(yǎng)基[4%葡萄糖，O. 1% 酵母膏，O. 7% 蛋白胨，O. 8%Na2HP04 · 12Η20]，ρΗ6· 5，溫度 30°C，發(fā)酵 7 天，BC 產(chǎn)量達(dá)3. 8g/l，如果在上述培養(yǎng)基中加入I. 4%(v/v)的こ醇，搖瓶發(fā)酵8天，BC產(chǎn)量大幅度提高到15. 2g/l。臺灣吳文騰等用Acetobacter xyIinum以改進(jìn)的氣升式反應(yīng)器取代傳統(tǒng)反應(yīng)器發(fā)酵72小吋，BC產(chǎn)率提高3倍，達(dá)O. 107g/l/h，產(chǎn)量達(dá)7. 72g/l。馬霞等采用木醋桿菌靜止培養(yǎng)條件下，在基本培養(yǎng)基(胰蛋白胨O. 5%，酵母粉O. 5%，葡萄糖2. 0%，Na2HPCM O. 5%，pH6. O。121°C滅菌20min)中添加醋酸、檸檬酸和乳酸，使細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量得到提高。其中，添加O. I %的醋酸，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量為2. 75g/L ;加入O. 2 %的檸檬酸時(shí)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為2. 15g/L ;加入O. I %的乳酸，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量為2. 76g/L。Joseph Gerard等發(fā)現(xiàn)添加聚丙烯酰胺-丙烯酸也可顯著提高木醋桿菌的BC產(chǎn)率。在BC發(fā)酵中，無論是搖瓶或者發(fā)酵罐培養(yǎng)，PH的準(zhǔn)確控制是很重要的，通常采用緩沖液、pH傳感器或人工手段來控制pH，顯然這種辦法是很麻煩的，而Noto N等發(fā)現(xiàn)只要在培養(yǎng)基中加入生化級玉米漿，即使不采取上述手段控制，BC的產(chǎn)量幾 乎是ー樣的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠控制細(xì)菌纖維素的平均聚合度為136f2350之間的控制細(xì)菌纖維素聚合度的細(xì)菌纖維素微生物制備方法，以適應(yīng)各種エ業(yè)加工的需求，拓寬了細(xì)菌纖維素的應(yīng)用范圍。本發(fā)明的控制細(xì)菌纖維素聚合度的細(xì)菌纖維素微生物制備方法，其特征在于，包括以下步驟(a)菌種的液體活化葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)⑶-BC-1CCTCCM208149經(jīng)固體斜面活化后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，于28-32°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)18 36小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為80-110r/m，沖程為65_75mm，由此獲得液體活化種子液，所述的液體活化培養(yǎng)基為每升含有葡萄糖80 120g，酵母膏8 12g，蛋白胨5 10g，余量為水，pH 值 6. 0 7.0 ;(b)發(fā)酵將液體活化種子液按照5 10%的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)或者靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，得到目標(biāo)細(xì)菌纖維素；所述的動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)為在溫度28-32°C，沖程65-80mm，轉(zhuǎn)速60_100r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)6 12天；所述的靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)為在溫度28_32°C靜止放置6-12天；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為以下培養(yǎng)基中的ー種發(fā)酵培養(yǎng)基A:姆升含有葡萄糖30_50g,酵母膏O. 8-1. 2g,蛋白胨6_8g,Na2HPO4 · 12H206-10g，生化級玉米漿4_8g，こ酸O. 8-1. 2g，無水こ醇8_12g，余量為水，pH值
5.8-6. 2，由此發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵得到的細(xì)菌纖維素產(chǎn)物的平均聚合度為215(Γ2350 ；發(fā)酵培養(yǎng)基B :每升含有甘油或木糖30_50g，酵母膏0.8_1.2g，蛋白胨6_8g，Na2HPO4 · 12H20 6_10g，生化級玉米漿4_8g，こ酸O. 8_1. 2g，無水こ醇8_12g，余量為水，pH值5. 8-6. 2，由此發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵得到的細(xì)菌纖維素產(chǎn)物的平均聚合度為1361 1380 ；發(fā)酵培養(yǎng)基C:姆升含有葡萄糖15_25g,酵母膏4_6g,蛋白胨4_6g,Na2HPO4 · 12Η202· 5-3. Og,檸檬酸I. 2-1. 8g，余量為水，pH值4. 8-5. 2，由此發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵得到的細(xì)菌纖維素產(chǎn)物的平均聚合度為155(Γ1650。所述的葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 經(jīng)固體斜面活化后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中優(yōu)選為將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp.)⑶-BC-1CCTCC M 208149劃線于固體培養(yǎng)基斜面上，28 32°C培養(yǎng)24 48小時(shí)，再冷藏于4°C 3飛天，然后再按Icm2面積上述斜面上的菌種接種于20ml的液體活化培養(yǎng)基的量接種，所述的固體培養(yǎng)基為每升含有葡萄糖8(Tl20g，酵母膏8 12g，碳酸鈣15 25g，瓊脂15 22g，余量為水，pH值6. 5^7. 2。細(xì)菌纖維素微生物合成方法有動(dòng)態(tài)發(fā)酵或靜態(tài)發(fā)酵法，而多數(shù)菌種只能采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵或靜態(tài)發(fā)酵中的一種進(jìn)行細(xì)菌纖維素的合成。動(dòng)態(tài)發(fā)酵法耗能相對較高、エ藝也較復(fù)雜，但比較適合大規(guī)模生產(chǎn)，且細(xì)菌纖維素產(chǎn)量可能較高；靜態(tài)發(fā)酵法耗能低、エ藝簡單、廢液排放極少，但產(chǎn)量可能不高，較適合小規(guī)模生產(chǎn)。而本發(fā)明可以根據(jù)實(shí)際需要選擇動(dòng)態(tài)發(fā)酵或靜態(tài)發(fā)酵法來制備平均聚合度為136Γ2350的細(xì)菌纖維素。本發(fā)明以細(xì)菌纖維素產(chǎn)生菌一葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)⑶-BC-1CCTCC M 208149作為發(fā)酵菌株，通過調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)方式、發(fā)酵時(shí)間等方式達(dá)到控制細(xì)菌纖維素聚合度，使得細(xì)菌纖維素平均聚合度在1361 2350范圍內(nèi)，因此可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需要制備不同平均聚合度的細(xì)菌纖維素。本發(fā)明提供了ー種有別于物理或化學(xué)因素控制細(xì)菌纖維素平均聚合度的方法，該 控制方法簡單，通過調(diào)節(jié)細(xì)菌纖維素平均聚合度以適應(yīng)各種エ業(yè)加工的需求，拓寬了細(xì)菌纖維素的應(yīng)用范圍。本發(fā)明的葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. )GD-BC-ICCTCC M 208149,于2008年10月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號為CCTCC NO M 208149。該菌株在專利號為200810218500. 7，發(fā)明名稱為細(xì)菌纖維素產(chǎn)生菌及利用該菌株制備細(xì)菌纖維素的方法中也公開過。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)ー步說明，而不是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的控制細(xì)菌纖維素聚合度的細(xì)菌纖維素微生物制備方法，包括以下步驟(I)斜面菌種活化將培養(yǎng)好的保藏斜面種葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp.)⑶-BC-1CCTCC M 208149劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下葡萄糖8(Tl20g，酵母膏8 12g，碳酸鈣15 25g，瓊脂15 22g，自來水1L，調(diào)pH值至
6.5 7. 2。28 32°C培養(yǎng)24 48小時(shí)，再冷藏于4°C 3 5天。(2)菌種的液體活化將上述冷藏于4°C的斜面上約Icm2面積的菌種刮下，接種于20ml液體活化培養(yǎng)基中，液體活化培養(yǎng)基配方組成如下葡萄糖80 120g，酵母膏8 12g，蛋白胨5 10g，自來水1L，調(diào)pH值至6. (Γ7. 0.。液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于28-32°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)18 36小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為80_110r/m，沖程為65-75mm，由此得到液體活化種子液。(3)發(fā)酵取培養(yǎng)好的液體活化種子液,按5-10%接種量,接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。米用不同發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵方式，所制備得到的細(xì)菌纖維素的平均聚合度是不同的，分別描述如下a、發(fā)酵培養(yǎng)基A :配方組分如下(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計(jì)算)葡萄糖30-50g，酵母膏0. 8-1. 2g，蛋白胨6-8g，Na2HPO4 · 12H20 6-10g,生化試劑級玉米漿4_8g，乙酸0. 8-1. 2g,無水こ醇8-12g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前調(diào)pH值至5. 8-6. 2，可用NaOH及HCl調(diào)節(jié)。然后于121°C滅菌15分鐘，備用。如果采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，可用500ml(更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于28-32°C，沖程65-80mm，轉(zhuǎn)速60-100r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)6-12天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液；如果采用靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，則其他步驟與動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)相同，但不必振蕩培養(yǎng)，而是于28-32°C靜止放置6-12天后，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。b、發(fā)酵培養(yǎng)基B :配方組分如下(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計(jì)算)甘油或木糖30-50g，酵母膏O. 8-1. 2g，蛋白胨6-8g，Na2HPO4 · 12H20 6-10g,生化試劑級玉米漿4_8g，乙酸O. 8-1. 2g,無水こ醇8-12g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前調(diào)pH值至5. 8-6. 2，可用NaOH及HCl調(diào)節(jié)。然后于121°C滅菌15分鐘，備用。如果采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，可用500ml(更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于28-32°C，沖程65_80mm，轉(zhuǎn)速60_100r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)6-12天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液；如果采用靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，則其他步驟與動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)相同，但不必振蕩培養(yǎng)，而是于28-32°C靜止放置6-12天后，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。C、發(fā)酵培養(yǎng)基C :配方組分如下(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計(jì)算)葡萄糖15-25g，酵母膏 4-6g，蛋白胨 4-6g，Na2HPO4 · 12Η20 2· 5-3. 0g，檸檬酸 I. 2-1. 8g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前調(diào)pH值至4. 8-5. 2，可用NaOH及HCl調(diào)節(jié)。然后于121°C滅菌15 分鐘，備用。如果采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，可用500ml (更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于28-32°C，沖程65-80_，轉(zhuǎn)速60-100r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)6_12天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液；如果采用靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，則其他步驟與動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)相同，但不必振蕩培養(yǎng)，而是于28-32°C靜止放置6-12天后，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。(4)細(xì)菌纖維素產(chǎn)物分離純化發(fā)酵液經(jīng)固液分離，固體為細(xì)菌纖維素凝膠，液體為發(fā)酵廢液，取出細(xì)菌纖維素凝膠，蒸餾水沖洗多次，除去表面雜質(zhì)。將細(xì)菌纖維素凝膠浸入O. Imol / L的NaOH溶液中，80°C保溫60min，除去殘存的菌體和培養(yǎng)基。然后用去離子水反復(fù)沖洗，再將細(xì)菌纖維素凝膠浸入O. lmol/L的NaOH溶液中，100°C水浴至凝膠呈乳白色半透明狀。然后用去離子水反復(fù)沖洗，使凝膠膜PH值為7. 0，105°C烘干至恒重，得干的細(xì)菌纖維素。(5)細(xì)菌纖維素產(chǎn)物平均聚合度測定稱取干的細(xì)菌纖維素溶于銅-こニ胺溶液中，配制成細(xì)菌纖維素濃度為c的溶液。測細(xì)菌纖維素在銅-こニ胺溶液中的相對粘度も，增比粘度nsp。根據(jù)單點(diǎn)法測定高聚物
溶液特性粘度[n]的通用公式=[η]=^2(^ lny/,) g根據(jù)Mark-Houwink 經(jīng)驗(yàn)方程！! η ]=kMa，k、α 為常數(shù)。由《Polymer Data
Handbook》查的得k、α值，求得粘均分子量M。由平均聚合度< DP) = $公式，求得細(xì)菌
1()2
纖維素的平均聚合度。實(shí)施例I :將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下(g/L):葡萄糖80g，酵母膏Sg，碳酸鈣15g，瓊脂15g，其余成分為水，pH6. 5，滅菌備用。28°C培養(yǎng)24小吋，再冷藏于4°C 5天。取4°C冰箱內(nèi)保藏5天的斜面種，用接種針將上述斜面上約Icm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的20ml液體活化培養(yǎng)基中[液體活化培養(yǎng)基的配方組成(g/L):葡萄糖80g，酵母膏8g，蛋白胨5g，其余成分為水，調(diào)pH值至6. 0，滅菌備用。]，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于28°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為80r/m，沖程為65mm，得到液體活化種子液。取上述培養(yǎng)好的液體活化種子液按5%接種量(2. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)如下葡萄糖30g,酵母膏O. 8g,蛋白胨6g, Na2HPO4 · 12H20 6g,生化級玉米衆(zhòng)4g,こ酸O. 8g，無水こ醇8g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至5. 8。然后于121°C滅菌15分鐘，備用。可用500ml(更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于28°C，沖程65mm，轉(zhuǎn)速60r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)6天，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液；發(fā)酵液經(jīng)固液分離，固體為細(xì)菌纖維素凝膠，液體為發(fā)酵廢液，取出細(xì)菌纖維素凝膠，蒸餾水沖洗2次，將細(xì)菌纖維素凝膠浸入 O.Imol / L的NaOH溶液中，80°C保溫60min，然后用去離子水沖洗2次后，再將細(xì)菌纖維素凝膠浸入O. lmol/L的NaOH溶液中，100°C水浴至凝膠呈乳白色半透明狀。然后用去離子水反復(fù)沖洗，使凝膠膜PH值為7. 0，105°C烘干至恒重，得干的細(xì)菌纖維素。然后采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為2180。實(shí)施例2 將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下(g/L):葡萄糖80g，酵母膏Sg，碳酸鈣15g，瓊脂15g，其余成分為水，pH6. 5，滅菌備用。28°C培養(yǎng)24小吋，再冷藏于4°C 5天。取4°C冰箱內(nèi)保藏5天的斜面種，用接種針將上述斜面上約Icm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的20ml液體活化培養(yǎng)基中[液體活化培養(yǎng)基的配方組成(g/L):葡萄糖80g，酵母膏8g，蛋白胨5g，其余成分為水，調(diào)pH值至6. O。]，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于28°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為80r/m，沖程為65mm，由此得到液體活化種子液。取上述培養(yǎng)好的液體活化種子液按5%接種量(2. 5ml)接種到新配置、121 °C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L)如下葡萄糖30g,酵母膏O. 8g,蛋白胨6g, Na2HPO4 · 12H20 6g,生化級玉米衆(zhòng)4g,こ酸
O.8g，無水こ醇8g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至5. 8。然后于121°C滅菌15分鐘，備用?？捎?00ml (更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于28°C靜止放置6天后，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液經(jīng)固液分離，固體為細(xì)菌纖維素凝膠，液體為發(fā)酵廢液，取出細(xì)菌纖維素凝膠，蒸餾水沖洗2次，將細(xì)菌纖維素凝膠浸入O. Imol / L的NaOH溶液中，80°C保溫60min，然后用去離子水沖洗2次后，再將細(xì)菌纖維素凝膠浸入O. lmol/L的NaOH溶液中，100°C水浴至凝膠呈乳白色半透明狀。然后用去離子水反復(fù)沖洗，使凝膠膜PH值為7. 0,105°C烘干至恒重，得干的細(xì)菌纖維素。然后采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為2150。實(shí)施例3
將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下(g/L):葡萄糖100g，酵母膏10g，碳酸鈣25g，瓊脂18g，其余成分為水，pH7. 2，滅菌備用。32°C培養(yǎng)36小時(shí)，再冷藏于4°C 3天。取4°C冰箱內(nèi)保藏3天的斜面種，用接種針將上述斜面上約Icm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的20ml液體活化培養(yǎng)基中[液體活化培養(yǎng)基的配方組成(g/L):葡萄糖100g，酵母膏10g，蛋白胨7. 5g，其余成分為水，調(diào)pH值至7. 0，滅菌備用。]，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于32°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)28小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為90r/m,沖程為75mm，得到液體活化種子液。取上述培養(yǎng)好的液體活化種子液按7%接種量(3. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L)如下葡萄糖50g,酵母膏1.2g,蛋白胨8g, Na2HPO4 · 12H20 10g,生化級玉米衆(zhòng)8g,こ酸1.2g，無水こ醇12g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至6. 2。然后于121°C滅菌15分鐘，備用?？捎?00ml (更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于32°C，沖程80mm，轉(zhuǎn)速 100r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)12天，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液；發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為2350。實(shí)施例4 本實(shí)施例與實(shí)施例3基本相同，只是實(shí)施例3采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵(于32°C，沖程80mm，轉(zhuǎn)速lOOr/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)12天，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液)，而本實(shí)施例采用靜態(tài)發(fā)酵，將液體活化種子液按7%接種量(3. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32°C，靜置培養(yǎng)12天，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為2289。實(shí)施例5 將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下(g/L):葡萄糖120g，酵母膏12g，碳酸鈣20g，瓊脂22g，其余成分為水，pH7. 0，滅菌備用。30°C培養(yǎng)48小時(shí)，再冷藏于4°C 3天。取4°C冰箱內(nèi)保藏3天的斜面種，用接種針將上述斜面上約Icm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的20ml液體活化培養(yǎng)基中[液體活化培養(yǎng)基的配方組成(g/L):葡萄糖120g，酵母膏12g，蛋白胨10g，其余成分為水，調(diào)pH值至6. O。]，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于30°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為110r/m，沖程為70mm,由此得到液體活化種子液。取上述培養(yǎng)好的液體活化種子液按10%接種量(5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L)如下葡萄糖40g,酵母膏I. Og,蛋白胨7. Og7Na2HPO4 · 12H20 8. Og,生化級玉米衆(zhòng)6. Og,こ酸I. 0g，無水こ醇10g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至6. O。然后于121°C滅菌15分鐘，備用?？捎?00ml (更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于30°C，沖程70mm，轉(zhuǎn)速85r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)9天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為2301。實(shí)施例6 本實(shí)施例與實(shí)施例5基本相同，只是實(shí)施例5采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵(于30°C，沖程70mm，轉(zhuǎn)速85r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)9天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。)，而本實(shí)施例采用靜態(tài)發(fā)酵，將液體活化種子液按10%接種量(5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30°C，靜置培養(yǎng)9天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為2255。實(shí)施例7 將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下(g/L):葡萄糖80g，酵母膏Sg，碳酸鈣15g，瓊脂15g，其余成分為水，pH6. 5，滅菌備用。28°C培養(yǎng)24小時(shí)，再4°C保藏5天。取4°C冰箱內(nèi)保藏5天的斜面種，用接種針將上述斜面上約Icm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的20ml液體活化培養(yǎng)基中[液體活化培養(yǎng)基的配方組成(g/L):葡萄糖80g，酵母膏8g，蛋白胨5g，其余成分為水，調(diào)pH值至6. O。]，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于28°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為80r/m，沖程為65mm，由此得到液體活化種子液。取上述培養(yǎng)好的液體活化種子液按5%接種量(2. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)如下甘油30g,酵母膏O. 8g,蛋白胨6g,Na2HP04 ·12Η20 6g,生化級玉米衆(zhòng)4g,こ酸O. 8g,無水こ醇8g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至5. 8。然后于121°C滅菌15分鐘，備用?？捎?00ml (更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于28°C，沖程65mm，轉(zhuǎn)速60r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)6天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1365。實(shí)施例8 本實(shí)施例與實(shí)施例7基本相同，只是實(shí)施例7采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵(于28°C，沖程65mm，轉(zhuǎn)速60r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)6天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。)，而本實(shí)施例采用靜態(tài)發(fā)酵，將液體活化種子液按5%接種量(2. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C靜止放置6天后，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1361。實(shí)施例9 將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下(g/L):葡萄糖100g，酵母膏10g，碳酸鈣25g，瓊脂18g，其余成分為水，pH7. 2，滅菌備用。32°C培養(yǎng)36小吋，4°C冷藏3天。取4°C冰箱內(nèi)保藏3天的斜面種，用接種針將上述斜面上約Icm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的20ml液體活化培養(yǎng)基中[液體活化培養(yǎng)基的配方組成(g/L):葡萄糖100g，酵母膏10g，蛋白胨7. 5g，其余成分為水，調(diào)pH值至7. O。]，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于32°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)28小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為90r/m，沖程為75mm，由此得到液體活化種子液。取上述培養(yǎng)好的液體活化種子液按7%接種量(3. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L)如下甘油50g,酵母膏I. 2g,蛋白胨8g, Na2HPO4 · 12H20 IOg,生化級玉米衆(zhòng)8g,こ酸1.2g，無水こ醇12g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至6. 2。然后于121°C滅菌15分鐘，備用?？捎?00ml (更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于32°C，沖程80mm，轉(zhuǎn)速100r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)12天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì) 菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1380。實(shí)施例10 本實(shí)施例與實(shí)施例9基本相同，只是實(shí)施例9采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵(于32°C，沖程80mm，轉(zhuǎn)速lOOr/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)12天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液)，而本實(shí)施例采用靜態(tài)發(fā)酵，將液體活化種子液按7%接種量(3. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，于32°C，靜置培養(yǎng)12天后，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1375。實(shí)施例11 將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下(g/L):葡萄糖120g，酵母膏12g，碳酸鈣20g，瓊脂22g，其余成分為水，pH7.0，滅菌備用。30°C培養(yǎng)48小吋，4°C保藏3天。取4°C冰箱內(nèi)保藏3天的斜面種，用接種針將上述斜面上約lcm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的20ml液體活化培養(yǎng)基中[液體活化培養(yǎng)基的配方組成(g/L):葡萄糖120g，酵母膏12g，蛋白胨10g，其余成分為水，調(diào)pH值至6. O。]，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于30°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為110r/m，沖程為70mm，由此得到液體活化種子液。取上述培養(yǎng)好的液體活化種子液按10%接種量(5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/U如下甘油40g,酵母膏I. Og,蛋白胨7. 0g, Na2HPO4 · 12H20 8. Og,生化級玉米衆(zhòng)6. Og,こ酸l.Og，無水こ醇10g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至6. O。然后于121°C滅菌15分鐘，備用?？捎?00ml (更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于30°C，沖程70mm，轉(zhuǎn)速85r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)9天，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1375。
實(shí)施例12 本實(shí)施例與實(shí)施例11基本相同，只是實(shí)施例11采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵(于30°C，沖程70mm,轉(zhuǎn)速85r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)9天，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液)，而本實(shí)施例采用靜態(tài)發(fā)酵，將液體活化種子液按10%接種量(5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，于30°C，靜置培養(yǎng)9天后，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1372。實(shí)施例13 本實(shí)施例與實(shí)施例7基本相同，只是發(fā)酵培養(yǎng)基不同，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/ L):木糖30g,酵母膏O. 8g,蛋白胨6g, Na2HPO4 · 12H20 6g,生化級玉米衆(zhòng)4g,こ酸O. 8g,無水こ醇8g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至5. 8。然后于121°C滅菌15分鐘，備用。得到細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1370。實(shí)施例14 本實(shí)施例與實(shí)施例8基本相同，只是發(fā)酵培養(yǎng)基不同，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L):木糖30g,酵母膏O. 8g,蛋白胨6g, Na2HPO4 · 12H20 6g,生化級玉米衆(zhòng)4g,こ酸O. 8g,無水こ醇8g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至5. 8。然后于121°C滅菌15分鐘，備用。得到細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1362。實(shí)施例15 本實(shí)施例與實(shí)施例9基本相同，只是發(fā)酵培養(yǎng)基不同，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L):木糖50g,酵母膏I. 2g,蛋白胨8g, Na2HPO4 · 12H20 IOg,生化級玉米衆(zhòng)8g,こ酸I. 2g,無水こ醇12g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至6. 2。然后于121°C滅菌15分鐘，備用。得到的細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1378。實(shí)施例16 本實(shí)施例與實(shí)施例10基本相同，只是發(fā)酵培養(yǎng)基不同，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L):木糖50g，酵母膏I. 2g,蛋白胨8g,Na2HPO4 ·12Η20 IOg,生化級玉米衆(zhòng)8g,こ酸I. 2g,無水こ醇12g，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至6. 2。然后于121°C滅菌15分鐘，備用。得到的細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1375。實(shí)施例17 本實(shí)施例與實(shí)施例11基本相同，只是發(fā)酵培養(yǎng)基不同，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L):木糖40g，酵母膏I. 0g，蛋白胨7. 0g，Na2HPO4 ·12Η20 8. 0g，生化級玉米漿6. Og,こ酸
1.(^，無水こ醇1(^，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至6. O。然后于121°C滅菌15分鐘，備用。得到的細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1369。實(shí)施例18 本實(shí)施例與實(shí)施例12基本相同，只是發(fā)酵培養(yǎng)基不同，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L):木糖40g，酵母膏I. 0g，蛋白胨7. 0g，Na2HPO4 ·12Η20 8. 0g，生化級玉米漿6. Og,こ酸
1.(^，無水こ醇1(^，其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前用NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH值至6. O。然后于121°C滅菌15分鐘，備用。得到的細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1365。實(shí)施例19 將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下(g/L):葡萄糖80g，酵母膏Sg，碳酸鈣15g，瓊脂15g，其余成分為水，pH6. 5，滅菌備用。28°C培養(yǎng)24小吋，4°C冷藏5天。取4°C冰箱內(nèi)保藏5天的斜面種，用接種針將上述斜面上約Icm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的20ml液體活化培養(yǎng)基中[液體活化培養(yǎng)基的配方組成(g/L):葡萄糖80g，酵母膏Sg，蛋白胨5g，其余成分為水，調(diào)pH值至6. O。]，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于28°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為80r/m，沖程為65mm，由此得到液體活化種子液。取上述培養(yǎng)好的液體活化種子液按5%接種量(2. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L)如下葡萄糖15g,酵母膏4g,蛋白胨4g, Na2HPO4 · 12H20 2. 5g,朽1檬酸I. 2g,其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前調(diào)PH值至4. 8，可用NaOH及HCl調(diào)節(jié)。然后于121°C滅菌15分鐘，備用。可用500ml (更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于28°C，沖程65mm，轉(zhuǎn)速60r/m的往復(fù)式搖床振蕩培 養(yǎng)6天，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1562。實(shí)施例20 本實(shí)施例與實(shí)施例19基本相同，只是實(shí)施例19采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵(于28°C，沖程65mm,轉(zhuǎn)速60r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)6天，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液)，而本實(shí)施例采用靜態(tài)發(fā)酵，將液體活化種子液按5%接種量(2. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C靜止放置6天后，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得出細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1550。實(shí)施例21 將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下(g/L):葡萄糖100g，酵母膏10g，碳酸鈣25g，瓊脂18g，其余成分為水，pH7. 2，滅菌備用。32°C培養(yǎng)36小吋，4°C保藏3天。取4°C冰箱內(nèi)保藏3天的斜面種，用接種針將上述斜面上約Icm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的20ml液體活化培養(yǎng)基中[液體活化培養(yǎng)基的組成(g/L):葡萄糖100g，酵母膏10g，蛋白胨7. 5g，其余成分為水，調(diào)pH值至7. O。]，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于32°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)28小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為90r/m，沖程為75mm，由此得到液體活化種子液。取上述培養(yǎng)好的液體活化種子液按7%接種量(3. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L)如下葡萄糖25g,酵母膏6g,蛋白胨6g, Na2HPO4 · 12H20 3. Og,朽1檬酸I. 8g,其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前調(diào)pH值至5. 2，可用NaOH及HCl調(diào)節(jié)。然后于121°C滅菌15分鐘，備用?？捎?00ml (更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于32°C，沖程80mm，轉(zhuǎn)速100r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)12天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。
發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得到的細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1650。實(shí)施例22 本實(shí)施例與實(shí)施例21基本相同，只是實(shí)施例21采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵(于32°C，沖程80mm，轉(zhuǎn)速lOOr/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)12天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液)，而本實(shí)施例采用靜態(tài)發(fā)酵，將液體活化種子液按7%接種量(3. 5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，于32°C，靜置培養(yǎng)12天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得到的細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1630。實(shí)施例23
將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp. ) GD-BC-ICCTCC M 208149 劃線于新配制的固體培養(yǎng)基斜面上，固體培養(yǎng)基斜面配方組成如下(g/L):葡萄糖120g，酵母膏12g，碳酸鈣20g，瓊脂22g，其余成分為水，pH7.0，滅菌備用。30°C培養(yǎng)48小吋，4°C冷藏3天。取4°C冰箱內(nèi)保藏3天的斜面種，用接種針將上述斜面上約Icm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的20ml液體活化培養(yǎng)基中[液體活化培養(yǎng)基的配方組成(g/L):葡萄糖120g，酵母膏12g，蛋白胨10g，其余成分為水，調(diào)pH值至6. O。]，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于30°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為110r/m，沖程為70mm，由此得液體活化種子液。取上述培養(yǎng)好的液體活化種子液按10%接種量(5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成(g/L)如下葡萄糖20g,酵母膏5g,蛋白胨5g, Na2HPO4 · 12H20 2. 8g,朽1檬酸I. 5g,其余成分為水。培養(yǎng)基于滅菌前調(diào)pH值至5.0，可用NaOH及HCl調(diào)節(jié)。然后于121°C滅菌15分鐘，備用?？捎?00ml (更大體積也可)的三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為三角瓶體積的10%，如果用500ml三角瓶，則裝發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，于30°C，沖程70mm，轉(zhuǎn)速85r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)9天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得到的細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1604。實(shí)施例24:本實(shí)施例與實(shí)施例23基本相同，只是實(shí)施例23采用動(dòng)態(tài)發(fā)酵(于30°C，沖程70_，轉(zhuǎn)速85r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)9天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液)，而本實(shí)施例采用靜態(tài)發(fā)酵，將液體活化種子液按10%接種量(5ml)接種到新配置、121°C滅菌15分鐘并已冷卻至室溫的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，于30°C，靜置培養(yǎng)9天，停止發(fā)酵，得發(fā)酵液。發(fā)酵液按照實(shí)施例I的方法分離純化得到干的細(xì)菌纖維素，再采用粘度法測定細(xì)菌纖維素的平均聚合度，得到的細(xì)菌纖維素的平均聚合度為1590。
權(quán)利要求
1.一種控制細(xì)菌纖維素聚合度的細(xì)菌纖維素微生物制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (a)菌種的液體活化葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp.)⑶-BC-1CCTCCM208149經(jīng)固體斜面活化后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，于28-32°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)18 36小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為80-110r/m，沖程為65_75mm，由此獲得液體活化種子液，所述的液體活化培養(yǎng)基為每升含有葡萄糖80 120g，酵母膏8 12g，蛋白胨5 10g，余量為水，pH 值 6. 0 7· O ； (b)發(fā)酵將液體活化種子液按照5 10%的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)或者靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，得到目標(biāo)細(xì)菌纖維素； 所述的動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)為在溫度28-32°C，沖程65-80_，轉(zhuǎn)速60_100r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)6 12天； 所述的靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)為在溫度28-32°C靜止放置6-12天； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為以下培養(yǎng)基中的一種 發(fā)酵培養(yǎng)基A:每升含有葡萄糖30-50g，酵母膏O. 8-1. 2g,蛋白胨6_8g，Na2HPO4 · 12H206-10g，生化級玉米漿4_8g，乙酸O. 8-1. 2g，無水乙醇8_12g，余量為水，pH值5.8-6. 2 ； 發(fā)酵培養(yǎng)基B:每升含有甘油或木糖30-50g，酵母膏O. 8-1. 2g，蛋白胨6_8g，Na2HPO4 · 12H20 6_10g，生化級玉米漿4_8g，乙酸O. 8-1. 2g，無水乙醇8_12g，余量為水，pH值 5. 8-6. 2 ； 發(fā)酵培養(yǎng)基C:每升含有葡萄糖15-25g,酵母膏4-6g,蛋白胨4-6g,Na2HPO4 · 12H202. 5-3. Og，檸檬酸 I. 2-1. 8g，余量為水，pH 值 4. 8-5. 2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌纖維素微生物制備方法，其特征在于，所述的葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)⑶-BC-ICCTCC M 208149經(jīng)固體斜面活化后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中為將葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)⑶-BC-ICCTCC M 208149劃線于固體培養(yǎng)基斜面上，28 32°C培養(yǎng)2Γ48小時(shí)，再冷藏于4°C 3飛天，然后再按Icm2面積上述斜面上的菌種接種于20ml的液體活化培養(yǎng)基的量接種，所述的固體培養(yǎng)基為每升含有葡萄糖8(Tl20g，酵母膏8 12g，碳酸鈣15 25g，瓊脂15 22g，余量為水，pH值6. 5^7. 2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制細(xì)菌纖維素聚合度的細(xì)菌纖維素微生物制備方法。本發(fā)明以細(xì)菌纖維素產(chǎn)生菌--葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149作為發(fā)酵菌株，通過調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)方式、發(fā)酵時(shí)間等方式達(dá)到控制細(xì)菌纖維素聚合度，使得細(xì)菌纖維素平均聚合度在1361～2350范圍內(nèi)，因此可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需要制備不同平均聚合度的細(xì)菌纖維素。本發(fā)明提供了一種有別于物理或化學(xué)因素控制細(xì)菌纖維素平均聚合度的方法，該控制方法簡單，通過調(diào)節(jié)細(xì)菌纖維素平均聚合度以適應(yīng)各種工業(yè)加工的需求，拓寬了細(xì)菌纖維素的應(yīng)用范圍。
文檔編號C12R1/01GK102816810SQ20121033313
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月10日
發(fā)明者施慶珊, 馮勁, 李文茹, 陳愛美, 疏秀林, 馮靜, 孫廷麗, 歐陽友生, 陳儀本 申請人:廣東省微生物研究所