專利名稱：一種鉛離子熒光dna探針及鉛離子濃度的熒光測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鉛離子濃度的檢測(cè)分析領(lǐng)域，具體地涉及一種鉛離子熒光DNA探針及利用該探針進(jìn)行鉛離子濃度的熒光測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
鉛是分布廣、有蓄積性的環(huán)境污染物。鉛是性質(zhì)穩(wěn)定的重金屬元素，其對(duì)人體極為有害，尤其嚴(yán)重危害兒童的健康。隨著工業(yè)和其他行業(yè)的迅速發(fā)展，人們對(duì)鉛的大量使用， 使得鉛污染已經(jīng)從職業(yè)環(huán)境向水、大氣、食品、醫(yī)藥等人們的日常生活環(huán)境擴(kuò)展。在環(huán)境檢測(cè)、口岸快速篩查、消費(fèi)品安全、廢水處理和工業(yè)過(guò)程中，對(duì)鉛的靈敏、快速的篩查和準(zhǔn)確的定量十分重要。目前，在分析實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)于痕量鉛的主要測(cè)試方法集中在原子吸光光譜法(洪穎，陳國(guó)松，張紅漫等，《廣東微量元素科學(xué)》2004, 11 (4) 62飛6 ； 許財(cái)欽，《中國(guó)公共衛(wèi)生》，2005，21 (3)，361)，ICP-AES法(陳文新，方奕文，光譜實(shí)驗(yàn)室， 2003(20) 4，495 497)，ICP-MS法(陳虹，張素珍，吳小均，《安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)》，2010，38 (23)， 12509 12513)。這些方法對(duì)鉛的檢出限在10 μ g/kg lmg/kg，而這些方法均需要大型設(shè)備和燃燒氣，成本較高，不易微型化。雙硫腙測(cè)定鉛具有較好穩(wěn)定性和高靈敏度(測(cè)定范圍在1(Γ 400mg/kg)，已建立了成熟的國(guó)標(biāo)方法(GB7470-87《水質(zhì)鉛的測(cè)定雙硫腙分光光度法》)，但由于試驗(yàn)過(guò)程中涉及有毒有機(jī)溶劑，該方法不利于環(huán)境保護(hù)。另一方面，納米生物技術(shù)的快速發(fā)展為檢測(cè)技術(shù)變革提供了新的方向。隨著能夠與金屬離子選擇性結(jié)合的離子載體紛紛出現(xiàn)，人們?cè)诖嘶A(chǔ)上發(fā)展了多種重金屬離子的檢測(cè)方法。脫氧核酶(DNAzyme)是一種具有使RNA水解作用的單鏈DNA分子，又稱為催化性 DNA，它可以通過(guò)體外篩選(SELEX)技術(shù)得到。部分脫氧核酶的活性與某些金屬離子密切相關(guān)，且脫氧核酶具有易于合成和修飾、高穩(wěn)定性和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)(Lu Y. Chem. Eur. J. [J],2002，8(20) :4588^4596 ；Li J.,Zheng W.，Kwon A. H.，et al.. Nucleic Acids Res. [J]，2000，28 (2) :481-488 ；Xiao Y. ,Rowe A. A.，Plaxco K. ff. . J. Am. Chem. Soc [J]， 2007,129(2) :262-263)。其中Yi Lu小組利用對(duì)Pb2+敏感的17E脫氧核酶(DNAzyme)分子開(kāi)發(fā)了一系列檢測(cè)Pb2+的熒光、比色傳感器(Li J. et. al, J. Am. Chem. Soc. , 2000， 122:10466-10467 ；Liu J. et. al. , Anal. Chem. , 2003，75: 6666-6667)。這些傳感器多是在17E脫氧核酶及其底物鏈上標(biāo)記熒光信號(hào)分子及猝滅分子，利用Pb2+切割后脫氧核酶構(gòu)象變化導(dǎo)致的熒光信號(hào)變化來(lái)定量Pb2+濃度。這些傳感器由于需要進(jìn)行DNA鏈的雙標(biāo)記，甚至三標(biāo)記，成本較高。同時(shí)，由于在室溫下，切割后的底物鏈可能重新與17E脫氧核酶雜交，為了獲得較低的熒光背景，試驗(yàn)操作溫度須嚴(yán)格控制在4°C以下，實(shí)驗(yàn)條件較嚴(yán)格。 因此，現(xiàn)有利用17E脫氧核酶及底物鏈多標(biāo)記探針檢測(cè)Pb2+的方法存在著操作難點(diǎn)多、不易推廣等不足。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)利用17E脫氧核酶檢測(cè)Pb2+的方法中的實(shí)驗(yàn)條件要求高、 需對(duì)DNA探針多次標(biāo)記、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，提出一種由17E脫氧核酶及FAM熒光素標(biāo)記的底物鏈組成的單標(biāo)記、高靈敏的新型鉛離子熒光DNA探針，以納米金膠作為FAM熒光素的猝滅劑，進(jìn)行鉛離子濃度的熒光檢測(cè)。本發(fā)明不僅保持了 17E脫氧核酶的高靈敏度、高特異性， 還大大降低了鉛離子的檢測(cè)成本。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了一種鉛離子熒光DNA探針，包括17E脫氧核酶以及底物鏈雜交組成的雙鏈，所述底物鏈的5’末端以FAM熒光素修飾；
其中，所述17E脫氧核酶的序列為
5' -CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT _3’ ；
所述底物鏈的序列為
5，-FAM-ACTCACTATMGGAAGAGATG-3，；
所述FAM熒光素如以下結(jié)構(gòu)式(II)所示。
權(quán)利要求
1.一種鉛離子熒光DNA探針，其特征在于，所述探針包括17E脫氧核酶以及底物鏈雜交組成的雙鏈，所述底物鏈的5’末端以FAM熒光素修飾；其中，所述17E脫氧核酶的序列為5' -CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT _3’ ；所述底物鏈的序列為5，-FAM-ACTCACTAIMGGAAGAGATG-3，；所述FAM熒光素如以下結(jié)構(gòu)式(II)所示。
2.如權(quán)利要求I所述的鉛離子熒光DNA探針，其特征在于，所述探針如以下結(jié)構(gòu)式(I) 所示。
3.一種利用如權(quán)利要求I所述鉛離子熒光DNA探針進(jìn)行鉛離子濃度的熒光測(cè)定方法， 其特征在于，以17E脫氧核酶及底物鏈雜交組成的鉛離子熒光DNA探針作為鉛離子的識(shí)別元件，以底物鏈5’末端修飾的FAM熒光素作為熒光信號(hào)分子，以納米金膠作為熒光猝滅劑， 利用FAM熒光素與所述鉛離子熒光DNA探針單雙鏈結(jié)合時(shí)的熒光信號(hào)差異，對(duì)待測(cè)樣品中的鉛離子濃度進(jìn)行熒光檢測(cè)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述鉛離子熒光DNA探針是由所述17E脫氧核酶及底物鏈在95°C、15min的退火條件下雜交組成。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在鉛離子存在的情況下，所述鉛離子熒光 DNA探針中的底物鏈的第九及第十個(gè)核苷酸之間打開(kāi)，所述鉛離子熒光DNA探針解鏈。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述解鏈后的鉛離子熒光DNA探針中的底物鏈與所述納米金膠結(jié)合，所述FAM熒光素猝滅。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述熒光檢測(cè)在激發(fā)波長(zhǎng)為494nm，發(fā)射波長(zhǎng)520nm處進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述鉛離子濃度的檢出限為2nmol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及鉛離子濃度的檢測(cè)分析領(lǐng)域，公開(kāi)了一種鉛離子熒光DNA探針，包括17E脫氧核酶以及底物鏈雜交組成的雙鏈，底物鏈末端以FAM熒光素修飾。本發(fā)明還公開(kāi)了一種利用探針進(jìn)行鉛離子濃度的熒光測(cè)定方法，以鉛離子熒光DNA探針作為鉛離子的識(shí)別元件，以底物鏈末端修飾的FAM熒光素作為熒光信號(hào)分子，以納米金膠作為熒光猝滅劑，利用FAM熒光素與鉛離子熒光DNA探針單雙鏈結(jié)合時(shí)的熒光信號(hào)差異，對(duì)待測(cè)樣品中的鉛離子濃度進(jìn)行熒光檢測(cè)。本發(fā)明方法靈敏度高，對(duì)鉛離子選擇性好，且具有成本低、操作方便、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586429SQ20121001833
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者衛(wèi)碧文, 吳繼魁, 張俊玲, 林莉, 高歡 申請(qǐng)人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局機(jī)電產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)中心