磁性熒光多模態(tài)納米生物探針及其制備方法和應(yīng)用

磁性熒光多模態(tài)納米生物探針及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種磁性熒光多模態(tài)納米生物探針及其制備方法和應(yīng)用，特異性靶向肝癌細(xì)胞，包括二氧化硅將磁性納米粒子與熒光染料的共包埋功能化修飾氨基，核酸適體與磁性熒光探針共價(jià)偶聯(lián)同時(shí)特異性靶向肝癌細(xì)胞。所述的磁性納米粒子為尺寸為十納米順磁性氧化鐵，所述的熒光染料為異硫氰酸熒光素，所述的包埋劑二氧化硅為四乙基原硅酸鹽和3?氨丙基三乙氧基硅烷水解得到，所述的核酸適體為TLS11a。該探針合成方法簡(jiǎn)便，材料易得，熒光性能穩(wěn)定，為肝癌的早期診斷奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
磁性黃光多模態(tài)納米生物探針及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及納米生物探針領(lǐng)域，具體設(shè)及一種磁性巧光探針用于制備生物傳感。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，盡管多數(shù)W手術(shù)切除為主，同時(shí)輔助 化療、熱療等綜合治療，部分改善了肝癌的治療效果，但是肝癌患者的長(zhǎng)期存活率仍然比較 低，究其愿意，主要是由于大多數(shù)肝癌患者的病情隱匿，潛伏期長(zhǎng)，腫瘤生長(zhǎng)迅速導(dǎo)致早期 診斷困難。因此，早期精確祀向診斷、良好的生物兼容性、低毒副作用成為肝癌乃至癌癥診 斷的挑戰(zhàn)。但是，隨著近年來(lái)納米技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)的結(jié)合，納米材料W其獨(dú)特的納米結(jié)構(gòu)和 性能W及良好的穩(wěn)定性，低成本等優(yōu)勢(shì)引起了研究者的廣泛關(guān)注。針對(duì)目前臨床肝癌診斷 中出現(xiàn)的早期診斷困難、祀向效果差、有毒副作用等缺點(diǎn)，巧妙的利用光學(xué)成像、核磁共振 成像(MRI)和細(xì)胞成像構(gòu)建多模態(tài)探針，避開單模式成像的局限性，從而達(dá)到肝癌早期祀向 診斷目的。
[0003] 二氧化娃納米顆粒由于具有大的比表面積、良好的生物相容性，結(jié)構(gòu)可調(diào)，分散性 良好，細(xì)胞毒性小，并且可W進(jìn)行功能化修飾等特點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越吸引人們的注意。通過(guò)二 氧化娃前驅(qū)體TE0S和APTES的水解將順磁性氧化鐵和共價(jià)結(jié)合的巧光染料同時(shí)包裹形成分 散性良好的磁性巧光核殼結(jié)構(gòu)。其中順磁性氧化鐵(SPI0)既作為MRI造影劑又可作為分離 手段，巧光染料通過(guò)與氨基化娃源試劑共價(jià)結(jié)合共包裹于二氧化娃內(nèi)，并能保持持久的良 好巧光性能。此外，磁性巧光多模態(tài)納米粒子表面偶聯(lián)生物活性分子增加其祀向性，祀向識(shí) 別肝癌細(xì)胞。結(jié)合特異性的祀向?qū)Ρ葎┖舜殴舱癯上?，?shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷，同時(shí)對(duì)腫瘤治療 效果進(jìn)行有效的原位監(jiān)測(cè)，使評(píng)價(jià)疾病的指標(biāo)更完善。磁性巧光多模態(tài)探針集磁性、巧光、 祀向于一身，祀向識(shí)別的同時(shí)可W用于核磁共振成像(MRI)，光學(xué)成像W及細(xì)胞成像利于更 直觀的觀察病灶，對(duì)于癌癥的臨床早期診斷尤其是肝癌，具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明的目的是提供一種磁性巧光多模態(tài)納米生物探針及其制備方法 和應(yīng)用，采用兩種不同娃源試劑同時(shí)將順磁性氧化鐵(SPI0)和巧光染料異硫氯酸巧光素 (Fluorescein isothiocyanate，門TC)包裹并進(jìn)行表面修飾，其中順磁性氧化鐵既作為MRI 造影劑又可作為分離手段，解決了現(xiàn)有技術(shù)中巧光易澤滅或巧光不穩(wěn)定和傳統(tǒng)造影劑滯留 時(shí)間短的問(wèn)題。本發(fā)明還提供了巧妙的利用光學(xué)成像、核磁共振成像和細(xì)胞成像，避開單模 式成像的局限性，從而達(dá)到肝癌早期祀向診斷目的。
[0005] 技術(shù)方案：本發(fā)明的一種磁性巧光多模態(tài)探針，包括順磁性的四氧化Ξ鐵 (Ferroferric oxide，F(xiàn)e3〇4)、異硫氯酉畫巧光素 (Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、二氧 化娃（Si〇2)分別由四乙基原娃酸鹽（Tetraethylo;rthosilicate，TEOS)和3-氨丙基Ξ乙氧 基硅烷（3-aminop;ropyl) triethoxysi lane，APTES)的水解得到和核酸適體（TLS1 la Aptamer)，其特征在于，所述順磁性四氧化Ξ鐵(Ferroferric oxide，F(xiàn)e3〇4)和巧光素異硫 氯酸巧光素 (Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)]；TC)同時(shí)被二氧化娃(Si〇2)包裹形成尺寸均 一的磁性巧光探針，并能特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞，進(jìn)行光學(xué)成像、細(xì)胞成像與核磁共振成像。
[0006] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案:該探針W順磁性四氧化Ξ鐵核屯、，二 氧化娃為外殼，形成二氧化娃同時(shí)包裹順磁性四氧化Ξ鐵和異硫氯酸巧光素 FITC的殼核結(jié) 構(gòu)，其中巧光素 FITC和3-氨丙基Ξ乙氧基硅烷APTES共價(jià)偶聯(lián)形成FITC-APTES同時(shí)被包埋 于二氧化娃中，進(jìn)而得到尺寸均一的磁性巧光探針，再偶聯(lián)上肝癌祀向識(shí)別核酸適體 化S11 a得到磁性巧光多模態(tài)探針。
[0007] 所述的生物探針核為順磁性四氧化Ξ鐵，粒徑為8-12nm，殼為二氧化娃，殼層厚度 40-90nm，殼層厚度調(diào)控根據(jù)TE0S和APTES的用量。
[0008] 本發(fā)明的磁性巧光多模態(tài)納米生物探針的制備方法是：W順磁性四氧化Ξ鐵為核 屯、，Si〇2為外殼同時(shí)將順磁性四氧化Ξ鐵和異硫氯酸巧光素包裹，偶聯(lián)上肝癌祀向識(shí)別核 酸適體化Slla得到尺寸均一磁性巧光多模態(tài)探針，該探針同時(shí)具有異硫氯酸巧光素的巧光 性質(zhì)和順磁性四氧化Ξ鐵的順磁性性質(zhì)；
[0009] 具體步驟為：
[0010] 步驟一，巧光素與氨基化娃源偶聯(lián)得到巧光素異硫氯酸巧光素-3-氨丙基Ξ乙氧 基硅烷FITC-APTES:向FITC乙醇溶液中加入APTES，室溫避光反應(yīng)充分得到FITC-APTES;
[001。 步驟二，制備化304@Si02:在超聲環(huán)境下，向堿性Fe304乙醇溶液中逐滴加入TE0S乙 醇溶液，超聲反應(yīng)充分得到化地4@Si02 ;
[0012] 步驟Ξ，制備Fe3〇4@Si〇2(FITC):化3〇4@Si〇2在超聲環(huán)境下，逐滴加入FITC-APTES， 再加入TE0S，振蕩均勻，繼續(xù)超聲反應(yīng)充分得到化3^@Si〇2(門TC);
[OOU] 步驟四，禪聯(lián)核酸適體TLSlla制備磁性巧光多模態(tài)探針：向含有Fe3〇4@Si〇2(FITC) 的PBS(地os地ate buffer saline,憐酸緩沖鹽溶液)緩沖液中分別加入邸C和NHS(l-(3-二 甲氨基丙基）-3 -乙基碳二亞胺鹽酸鹽（l-(3-Dimethylaminop;ropyl)-3- ethylcarbodiimide hy化ochloride，抓C)和N-徑基班巧酷亞胺（N-Hy化oxysuccinimide， NHS))進(jìn)行活化，活化后再加入核酸適體化S1 la，室溫反應(yīng)充分后，離屯、，PBS洗涂后得到磁 性巧光多模態(tài)探針。
[0014] 所述的超聲反應(yīng)溫度小于等于40°C，整個(gè)反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。
[0015] 本發(fā)明的磁性巧光多模態(tài)納米生物探針應(yīng)用在祀向識(shí)別肝癌細(xì)胞，并應(yīng)用于肝癌 細(xì)胞的光學(xué)成像、細(xì)胞成像和核磁共振成像。
[0016] 該磁性巧光探針用于細(xì)胞成像的最優(yōu)濃度為60yg/2X105細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明的原理:磁性巧光多模態(tài)探針中的順磁性氧化鐵既分離手段，又作為核磁 共振成像造影劑，可W有效地改變病變組織中質(zhì)子的自旋-自旋弛豫時(shí)間，從而達(dá)到增強(qiáng)對(duì) 比度的效果。吞隧細(xì)胞吞隧超順磁性氧化鐵顆粒后使相應(yīng)區(qū)域信號(hào)減低，而腫瘤組織因不 含正常的吞隧細(xì)胞而保持信號(hào)不變。集磁性、巧光、祀向于一身，祀向識(shí)別的同時(shí)進(jìn)行光學(xué) 成像，細(xì)胞成像和核磁共振成像，避開單模式成像的局限性，從而達(dá)到肝癌細(xì)胞早期祀向識(shí) 別目的。
[001引有益效果：
[0019] 1.本發(fā)明使用磁性巧光多模態(tài)探針，一方面該探針合成方法簡(jiǎn)便，材料易得，尺寸 均一，分散性好，巧光性能穩(wěn)定，與傳統(tǒng)造影劑相比，毒副作用小，滯留時(shí)間延長(zhǎng)更利于多模 態(tài)成像。
[0020] 2.使用本發(fā)明磁性巧光多模態(tài)探針實(shí)現(xiàn)多模態(tài)，同時(shí)對(duì)早期肝癌進(jìn)行可視化診 斷，避開單一模式成像的局限性，減少了檢測(cè)次數(shù)，同時(shí)對(duì)樣品的需求量較少，毒副作用小， 因此其臨床化研究具有廣泛的應(yīng)用前景和重要的意義。
[0021] 3.本發(fā)明設(shè)計(jì)了尺寸均一、巧光穩(wěn)定性好的W順磁性四氧化Ξ鐵為核屯、，Si〇2為 外殼的核殼結(jié)構(gòu)，W核酸適配體為祀向生物活性分子，特異性表達(dá)肝癌細(xì)胞，與傳統(tǒng)抗體相 比，其與受體的親和力更高，且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于修飾，免疫原性低。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1是本發(fā)明磁性巧光多模態(tài)探針的實(shí)施過(guò)程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更進(jìn)一步的解釋。
[0024] -種磁性巧光多模態(tài)納米生物探針及其制備與應(yīng)用，特異性祀向肝癌細(xì)胞，包括 二氧化娃將磁性納米粒子與巧光染料的共包埋功能化修飾氨基，核酸適體與磁性巧光探針 共價(jià)偶聯(lián)同時(shí)特異性祀向肝癌細(xì)胞。所述的磁性納米粒子為尺寸為十納米順磁性氧化鐵， 所述的巧光染料為異硫氯酸巧光素，所述的包埋劑二氧化娃為四乙基原娃酸鹽和3-氨丙基 Ξ乙氧基硅烷水解得到。該探針合成方法簡(jiǎn)便，材料易得，巧光性能穩(wěn)定，為肝癌的早期診 斷奠定了基礎(chǔ)。
[0025] 具體制備步驟為：
[00%]步驟一、巧光素與氨基化娃源偶聯(lián)(門TC-APTES)
[0027] A:稱取20mg門TC，加入lOmL無(wú)水乙醇，立即加入50化1 APTES于上述溶液中。在室 溫條件下避光反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后4°C避光保存；
[0028] 步驟二、二氧化娃保護(hù)層的制備(Fe3〇4@Si化）
[00巧]B1:取lOmL無(wú)水乙醇，加入10化1 TE0S，振蕩1分鐘混合均勻。
[0030] B2:取lOmL無(wú)水乙醇，加入ImL水，再加入ImL氨水，振蕩1分鐘混合均勻。然后加入 60化L 2mg/mL化3化溶液，振蕩充分混合均勻。
[0031 ] 將B2在超聲環(huán)境下，逐滴加入B1，（標(biāo)注為C)，振蕩均勻，繼續(xù)超聲反應(yīng)1小時(shí)。
[0032] 步驟 Ξ、磁性巧光探針(Fe3〇4@Si〇2(FITC))
[0033] 取50化LA，振蕩1分鐘混合均勻。C在超聲環(huán)境下，逐滴加入A，再加入30化L TE0S， 振蕩均勻，繼續(xù)超聲反應(yīng)2小時(shí)。注意超聲溫度不高于40°C，整個(gè)反應(yīng)需在避光條件下進(jìn)行。
[0034] 所述的磁性巧光探針，所述二氧化娃包埋的磁性采用W下步驟制備得到：
[00巧]步驟一、取20mg FITC溶于lOmL無(wú)水乙醇，加入50化1 APTES，混勻，置室溫避光反 應(yīng)2地；
[0036] 步驟二、取lOmL無(wú)水乙醇，加入10化1 TE0S，振蕩，混勻；
[0037] 步驟Ξ、取1 OmL無(wú)水乙醇，加入ImL水，再加入ImL氨水，振蕩1分鐘混合均勻。然后 加入60化L 2mg/mL化3化溶液，振蕩充分混合均勻；
[0038] 步驟四、向步驟Ξ得到的溶液中逐滴加入步驟二溶液，混勻，超聲反應(yīng)化；
[0039] 步驟五、在超聲條件下，向步驟四逐滴加入5(Κ)化步驟一溶液，混勻，置室溫避光反 應(yīng)化；
[0040] 步驟六、在超聲條件下，向步驟四逐滴加入30化1 TEOS，置室溫避光反應(yīng)化；
[0041] 步驟屯、分別用乙醇，水，pH 7.4的PBS離屯、，洗涂分離，去除未反應(yīng)試劑并于pH 7.4的PBS中4°C條件下保存；
[0042] 步驟八、向步驟屯中分別加入2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (l-(3-Dimethylaminop;ropyl)-3-ethylca;rbodiimide hy化ochloride，邸C)和N-徑基班巧 酷亞胺（N-Hyh(Mysuccinimide，畑S)，活化15min，加入100μΙ ΙμΜ的核酸適體TLSlla，室溫 反應(yīng)化后，離屯、，pH 7.4的PBS洗涂Ξ次并于抑7.4的PBS 4°C保存，備用。
[0043] 其中，步驟一至八的反應(yīng)溫度均不超過(guò)40°C。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 本發(fā)明磁性巧光多模態(tài)探針實(shí)施過(guò)程如圖1所示。
[0046] 本實(shí)施例設(shè)及的PBS為抑7.4,無(wú)水乙醇均為優(yōu)級(jí)純;使用的順磁性氧化鐵購(gòu)自南 京東納生物科技有限公司；四乙基原娃酸鹽(Tetraethylo;rthosilicate，TEOS)和3-氨丙基 ^乙氧基硅烷（3-日111；[]1〇口1'〇口71)化161:11〇巧3；[1日]16,4?了65)購(gòu)自美國(guó)5;[卵日-41化;[。11公司； 化Slla Aptamer序列購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0047] 所述的磁性巧光探針，所述二氧化娃包埋的磁性采用St6ba·法制備得到：
[004引步驟一、取20mg FITC溶于lOmL無(wú)水乙醇，加入50化1 APTES，混勻，置室溫避光反 應(yīng)2地；
[0049] 步驟二、取lOmL無(wú)水乙醇，加入10化1 TE0S，振蕩，混勻；
[0050] 步驟Ξ、取lOmL無(wú)水乙醇，加入ImL水，再加入ImL氨水，振蕩1分鐘混合均勻。然后 加入60化L 2mg/mL化3化溶液，振蕩充分混合均勻；
[0051] 步驟四、向步驟Ξ得到的溶液中逐滴加入步驟二溶液，混勻，超聲反應(yīng)化；
[0052] 步驟五、在超聲條件下，向步驟四逐滴加入5(Κ)化步驟一溶液，混勻，置室溫避光反 應(yīng)化；
[0053] 步驟六、在超聲條件下，向步驟四逐滴加入30化1 TE0S，反應(yīng)化；
[0054] 步驟屯、分別用乙醇，水，pH 7.4的PBS離屯、，洗涂分離，去除未反應(yīng)試劑并于pH 7.4的PBS中4°C條件下保存；
[0055] 步驟八、向步驟屯中分別加入2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (l-(3-Dimethylaminop;ropyl)-3-ethylca;rbodiimide hy化ochloride，邸C)和N-徑基班巧 酷亞胺（N-Hyd;roxysuccinimide，NHS)，活化15min，加入100μLlμM的核酸適體（TLSlla Aptamer)，室溫反應(yīng)化后，離屯、，pH 7.4的PBS洗涂Ξ次并于抑7.4的PBS 4°C保存，備用。 [0化6] 其中，步驟一至八的反應(yīng)溫度均不超過(guò)4(TC。
[0化7] 步驟九、將0.5ml 12化g/ml磁性巧光探針與2 X 105個(gè)化pG2肝癌細(xì)胞共解育Ξ小 時(shí)，祀向識(shí)別肝癌細(xì)胞同時(shí)用于細(xì)胞成像和核磁共振成像。
[0058] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不W上述實(shí)施方式為 限，但凡本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所掲示內(nèi)容所作的等效修飾或變化，皆應(yīng)納入權(quán) 利要求書中記載的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種磁性熒光多模態(tài)納米生物探針，其特征在于，該探針以順磁性四氧化三鐵核心， 二氧化硅為外殼，形成二氧化硅同時(shí)包裹順磁性四氧化三鐵和異硫氰酸熒光素 FITC的殼核 結(jié)構(gòu)，其中熒光素 FITC和3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES共價(jià)偶聯(lián)形成FITC-APTES同時(shí)被包 埋于二氧化硅中，進(jìn)而得到尺寸均一的磁性熒光探針，再偶聯(lián)上肝癌靶向識(shí)別核酸適體 TLS11 a得到磁性熒光多模態(tài)探針。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性熒光多模態(tài)納米生物探針，其特征在于，所述的生物探針 核為順磁性四氧化三鐵，粒徑為8-12nm，殼為二氧化硅，殼層厚度40-90nm，殼層厚度調(diào)控根 據(jù)二氧化硅前驅(qū)體TEOS和APTES的用量。3. -種如權(quán)利要求1所述的磁性熒光多模態(tài)納米生物探針的制備方法，其特征在于，以 順磁性四氧化三鐵為核心，SiO 2為外殼同時(shí)將順磁性四氧化三鐵和異硫氰酸熒光素包裹， 偶聯(lián)上肝癌靶向識(shí)別核酸適體TLSlla得到尺寸均一磁性熒光多模態(tài)探針，該探針同時(shí)具有 異硫氰酸熒光素的熒光性質(zhì)和順磁性四氧化三鐵的順磁性性質(zhì)； 具體步驟為： 步驟一，熒光素與氨基化硅源偶聯(lián)得到熒光素異硫氰酸熒光素-3-氨丙基三乙氧基硅 烷FITC-APTES:向FITC乙醇溶液中加入APTES，室溫避光反應(yīng)充分得到FITC-APTES; 步驟二，制備Fe3O4OSiO2:在超聲環(huán)境下，向堿性Fe3O 4乙醇溶液中逐滴加入TEOS乙醇溶 液，超聲反應(yīng)充分得到Fe3O4OSiO2; 步驟三，制備Fe3〇4@Si02(FITC):Fe3〇4@Si0 2在超聲環(huán)境下，逐滴加入FITC-APTES，再加 入TE0S，振蕩均勻，繼續(xù)超聲反應(yīng)充分得到Fe3〇4@Si02(FITC); 步驟四，耦聯(lián)核酸適體1'1^11&制備磁性熒光多模態(tài)探針：向含有?63〇4略10 2$11'〇的磷 酸緩沖鹽溶液PBS中分別加入EDC和NHS進(jìn)行活化，活化后再加入核酸適體TLSl Ia，室溫反應(yīng) 充分后，離心，PBS洗滌后得到磁性熒光多模態(tài)探針。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的磁性熒光多模態(tài)納米生物探針的制備方法，其特征在于，所述 的超聲反應(yīng)溫度小于等于40°C，整個(gè)反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。5. -種如權(quán)利要求1所述的磁性熒光多模態(tài)納米生物探針的應(yīng)用，其特征在于該探針 應(yīng)用在靶向識(shí)別肝癌細(xì)胞，并應(yīng)用于肝癌細(xì)胞的光學(xué)成像、細(xì)胞成像和核磁共振成像。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的磁性熒光多模態(tài)納米生物探針的應(yīng)用，其特征在于該磁性熒 光探針用于細(xì)胞成像的最優(yōu)濃度為60yg/2 X IO5細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】A61K49/08GK105920620SQ201610451236
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月21日
【發(fā)明人】劉松琴, 魏珍珍
【申請(qǐng)人】東南大學(xué)