專利名稱：利用rna干擾技術(shù)使杜氏藻累積高含量番茄紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物合成番茄紅素的方法，尤其是利用RNA干擾技術(shù)使杜氏藻 (Dunaliella)累積高含量的番茄紅素的方法。
背景技術(shù)：
番茄紅素(Lycopene)是一種脂溶性天然色素，其分子是由11個(gè)共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵組成的直鏈型碳?xì)浠衔铮瑢兕惡}卜素類。主要存在于番茄、西瓜、紅色葡萄柚等植物中。近十年來的研究表明，番茄紅素極強(qiáng)的抗氧化活性，其清除單線態(tài)氧的能力是維生素E的100倍、是β -胡蘿卜素的2. 2倍，清除羥自由基的效果比β -胡蘿卜素強(qiáng)32 倍，為目前自然界中被發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑之一。研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素具有優(yōu)越的生理功能，它不僅具有抗癌、抑癌的功效，而且對(duì)于預(yù)防心血管疾病、動(dòng)脈硬化等各種成人病、增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)以及延緩衰老等也有良好的效果。2009年全世界番茄紅素的總用量約2300 噸，據(jù)有關(guān)機(jī)構(gòu)預(yù)測，番茄紅素的需求量在未來數(shù)年仍將以約10%的速度增長。目前世界上番茄紅素的生產(chǎn)方法有天然提取法、化學(xué)合成法和發(fā)酵法三種。俄羅斯和美國羅氏藥業(yè)有化學(xué)合成的番茄紅素產(chǎn)品，生產(chǎn)成本較低，但其結(jié)構(gòu)為非全反式，生理功能差，而且人們對(duì)化學(xué)合成品毒副作用有相當(dāng)?shù)囊蓱]，因此化學(xué)合成番茄紅素很少用于藥物和食品添加劑。目前市場上的番茄紅素大多是從番茄中提取的天然產(chǎn)物，但由于番茄中番茄紅素的含量僅為0. 002%左右，提取難度大、成本高、純度低，而且大量種植番茄用于番茄紅素提取需要消耗很多的土地資源。利用微生物發(fā)酵法制備番茄紅素的研究方面也有一些報(bào)道，美國專利US3097146、 US3369974及中國專利200510090996. 0提出了利用三孢布拉氏霉菌發(fā)酵制備番茄紅素的方法，但這些方法均需要添加氨基吡啶等化學(xué)藥劑干擾霉菌的生物合成路徑來實(shí)現(xiàn)番茄紅素的積累，化學(xué)添加劑在產(chǎn)品中的殘留對(duì)人體的健康會(huì)產(chǎn)生不利影響。中國專利 20071012^95發(fā)明了一種利用細(xì)菌(龜裂鏈霉菌)發(fā)酵累積番茄紅素的方法，但由于受到其合成前體供應(yīng)量的限制，依照此方法生產(chǎn)番茄紅素產(chǎn)率僅在0. 4% 0. 7%細(xì)胞干重范圍，仍沒有實(shí)質(zhì)性的突破與提高。通過基因工程和代謝工程的方法來提高番茄中番茄紅素的含量方面也有一些有益的嘗試。如以色列Lycored Natural Product hdustries公司率先選育出番茄紅素含量為普通番茄4 5倍的雜交番茄。英國將細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶基因crtl導(dǎo)入番茄細(xì)胞中，培育出了番茄紅素含量為普通番茄3. 5倍的轉(zhuǎn)基因番茄新品種。這些研究雖然在一定程度上提高了原料中番茄紅素的含量，但總體水平仍很低。杜氏藻(Dimaliella)，為綠藻門多鞭藻科的一屬，是鹽生的、無細(xì)胞壁的單細(xì)胞綠藻，能高效率地生物合成β-胡蘿卜素，其中的鹽生杜氏藻(Dimaliella salina)細(xì)胞中累積β-胡蘿卜素的量最高可達(dá)干重的14%，是β-胡蘿卜素含量最高的生物體，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它生物。此外杜氏藻可以在露天開放環(huán)境下利用陽光和二氧化碳快速生長，其中鹽生杜氏藻的增殖速度達(dá)約IOg/(m2 天)，因此杜氏藻是生產(chǎn)天然β -胡蘿卜素的很好資源，全球有不少公司利用杜氏藻來生產(chǎn)胡蘿卜素，用作藥物或健康食品的成分。番茄紅素和胡蘿卜素都是類胡蘿卜素物質(zhì)，它們有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)，讓杜氏藻像生物合成胡蘿卜素那樣直接合成、累積番茄紅素的想法非常有吸引力的，因?yàn)槠駷橹故澜缟线€沒有發(fā)現(xiàn)過能夠以如此高的效率來合成、累積番茄紅素的生物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種使杜氏藻(Dimaliella)能夠累積高含量的番茄紅素的方法。植物生物合成β -胡蘿卜素途徑的相關(guān)研究表明，番茄紅素是生物合成β -胡蘿卜素的前體，番茄紅素在番茄紅素-β-環(huán)化酶(Lycopene β-cyclase, LycB)的催化作用
下，先將番茄紅素分子的兩個(gè)末端之一環(huán)化成Y-胡蘿卜素，然后再將另一端環(huán)化后形成胡蘿卜素，LycB是番茄紅素轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素的關(guān)鍵酶，如果沒有LycB的參與，番茄紅素就不能環(huán)化，生物合成胡蘿卜素的過程就會(huì)終止于番茄紅素合成階段。番茄果實(shí)中番茄紅素的累積研究證實(shí)，番茄紅素的累積是上游八氫番茄紅素合成酶基因(psy基因)和八氫番茄紅素脫氫酶基因(pds基因)表達(dá)增強(qiáng)及下游IycB基因表達(dá)減弱的結(jié)果，其調(diào)控方式為相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。杜氏藻生物合成β-胡蘿卜素的過程中，兩步環(huán)化反應(yīng)同樣都必需LycB參與才能完成，而LycB是IycvB基因表達(dá)的產(chǎn)物，因此，通過抑制杜氏藻的IycB基因的表達(dá)就可以實(shí)現(xiàn)番茄紅素在杜氏藻體內(nèi)不被轉(zhuǎn)化為胡蘿卜素而大量累積下來。抑制杜氏藻IycB基因表達(dá)的有效途徑是將杜氏藻基因組中的IycB基因敲除 (knock-out)或者使IycB基因沉默，也就是RNA干擾(RNA interference, RNAi)。本發(fā)明人在中國發(fā)明申請(qǐng)201110084892. 4中公開了一種通過敲除杜氏藻IycB基因使其能夠累積高含量的番茄紅素的方法，該方法實(shí)施后取得了非常好的效果，所獲得的敲除了 IycB基因的鹽生杜氏藻可以累積高達(dá)3. 5%細(xì)胞干重的番茄紅素，是番茄的1000倍以上。與基因敲除技術(shù)相比，RNA干擾技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于它不僅能夠有效地抑制特異序列的目的基因的表達(dá)、操作簡便、迅速，而且不會(huì)改變基因組的遺傳組成。本發(fā)明將通過構(gòu)建IycB基因的RNAi表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入杜氏藻中，并篩選得到能夠有效干擾IycB基因的表達(dá)、累積高含量番茄紅素的杜氏藻，使人類可以通過養(yǎng)殖杜氏藻的新途徑大量、方便地獲取天然番茄紅素。本發(fā)明的具體過程是第一步，杜氏藻細(xì)胞RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄得到杜氏藻cDNA庫。本發(fā)明所說的杜氏藻(Dimaliella)可以是鹽生杜氏藻(Dimaliella salina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)或雙杜氏藻(Dunaliella biocuiate)等，其中優(yōu)選累積β-胡蘿卜素能力更強(qiáng)的鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)，特別是鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)。第二步，RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建。1、以杜氏藻cDNA為模板擴(kuò)增目標(biāo)片段；杜氏藻的cDNA序列經(jīng)測序得到或來源于GenBank。
杜氏藻cDNA的測序按照基因工程領(lǐng)域常用的測序方法進(jìn)行，也可以將測序工作委托給專門提供測序服務(wù)的生物技術(shù)公司。根據(jù)杜氏藻cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，克隆目標(biāo)RNAi片段。本發(fā)明特別提出了特異性引物引物Y6-RNAi-F，序列為SEQ ID NO :2，引物Y6_RNAi_R，序列為SEQ ID NO :3。2、構(gòu)建質(zhì)粒并測序本操作中能采用的質(zhì)粒有很多選擇，這是本專業(yè)領(lǐng)域的研究人員所熟知的，下述操作中選擇了質(zhì)粒pMD 19-T，但本發(fā)明并不局限于它。按下列步驟構(gòu)建pMD19-T_RNAi9質(zhì)粒并測序(1)將目標(biāo)RNAi片段接入起始質(zhì)粒PMD19-T(2)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(3)菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子
(4)質(zhì)粒PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子(5)酶切檢測(6)序列測定本發(fā)明特別提出了一種目標(biāo)RNAi片段，其序列為SEQ ID NO :1。3、RNAi中間載體的構(gòu)建本操作中能采用的質(zhì)粒有很多選擇，這是本專業(yè)領(lǐng)域的研究人員所熟知的，下述操作中選擇了質(zhì)粒pHANNIBAL、pBS-KS (+)，但并不局限于它們。酶切上述步驟2得到的pMD19-T_RNAi9質(zhì)粒，得到pi正向片段，進(jìn)一步接入內(nèi)含子pHANNIBAL載體得到RNAi-pl質(zhì)粒，再酶切得到p2反向片段，p2反向片段再連接入RNAi-p 1質(zhì)粒得到RNAi-p 1-ρ2質(zhì)粒，在該中間載體上，干擾片段正向和反向插入到 pHANNIBAL載體內(nèi)含子兩側(cè)，并置于啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng)子和終止子OCS終止子之間，構(gòu)建了完整的干擾表達(dá)盒。酶切RNAi-pl_p2質(zhì)粒，回收4. 2kb的片段，插入到pBS_KS⑴載體的NotI酶切位點(diǎn)，得到PBS-RNAi質(zhì)粒。4、構(gòu)建RNAi表達(dá)載體在RNAi表達(dá)載體中包含用于篩選的篩選標(biāo)記基因，所述的篩選標(biāo)記基因是氯霉素抗性基因、阿特拉津抗性基因、熒光蛋白基因等，本發(fā)明優(yōu)選阿特拉津抗性基因。本操作中能采用的質(zhì)粒有很多選擇，這是本專業(yè)領(lǐng)域的研究人員所熟知的。下述操作中選擇了質(zhì)粒PCAMBIA1301，但并不局限于它。酶切pCAMBIA1301質(zhì)粒將潮霉素抗性基因(hpt)替換為1. 4kb的阿特拉津氯水解酶基因(atzA)，得到1301-atzA載體。用&icI/BamHI分別雙酶切pBS-RNAi和1301_atzA表達(dá)載體，分別回收4. 2kb和 12kb的片段，連接得到1301-pBS-RNAi表達(dá)載體，圖1是1301-pBS-RNAi表達(dá)載體圖譜，該載體具有卡那霉素抗性以及阿特拉津(atzA)正篩選標(biāo)記。第三步，RNAi表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化。將RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)杜氏藻細(xì)胞方法可以是電擊法、農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇(PEG)法、基因槍法、玻璃珠攪拌法等，這些方法是基因工程領(lǐng)域所常用的，這些方法在轉(zhuǎn)化效率方面有所不同，本發(fā)明優(yōu)選簡便高效電擊法。
用電擊法將RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)杜氏藻細(xì)胞在冰浴中以3kV/cm 8kV/cm電擊杜氏藻細(xì)胞懸浮液。在本發(fā)明中電擊法可以達(dá)到0. 05% 0. 2%的轉(zhuǎn)化效率。攜帶抗性標(biāo)記的的轉(zhuǎn)化株可以用抗性平板篩選，攜帶熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)化株用流式細(xì)胞鑒別分離儀器篩選。圖2是電轉(zhuǎn)化后利用阿特拉津抗性平板篩選轉(zhuǎn)化藻。第四步，PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。挑取單藻落擴(kuò)大到ImL培養(yǎng)，提取微藻基因組，進(jìn)行PCR鑒定。首先用引物對(duì)atzA-5/8鑒定正篩選標(biāo)記atzA基因，得到0. 8kb的特異性條帶，說明正篩選標(biāo)記atzA基因已經(jīng)插入到杜氏藻基因組中。然后用引物對(duì)Y6-RNAi-F/R進(jìn)一步做基因組PCR，鑒定干擾片段，得到大小約為0. 6kb，說明干擾片段已經(jīng)插入到杜氏藻基因組中。之所以可選用Y6-RNAi-F/R這對(duì)引物做篩選，原因是實(shí)驗(yàn)獲得的干擾片段來源于杜氏藻的cDNA序列，不包含內(nèi)含子序列。非轉(zhuǎn)化藻基因組中不能得到0.61Λ的條帶，或者可能得到大于0. 6kb的條帶。圖3是引物對(duì)atzA-5/8的PCR鑒定圖譜，結(jié)果顯示2、4、5藻株基因組存在抗性標(biāo)記atzA基因；圖4是引物對(duì)Y6-RNAi-F/R的PCR鑒定圖譜，結(jié)果顯示篩選得到的1、2、3、5、6、8藻株基因組存在干擾片段，證明RNAi表達(dá)載體得到成功轉(zhuǎn)化。將已PCR確認(rèn)RNAi陽性的杜氏藻進(jìn)行放大養(yǎng)殖，用高壓液相色譜(HPLC)檢測藻體中番茄紅素的含量，結(jié)果顯示，所得到的杜氏藻能夠累積高含量的番茄紅素。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過杜氏藻IycB基因的RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化株的篩選，得到IycB 基因被干擾的杜氏藻，該杜氏藻的IycB基因的表達(dá)被抑制，其生物合成β-胡蘿卜素的過程被阻止于番茄紅素階段，進(jìn)而在其生物體內(nèi)大量累積番茄紅素，該累積過程是藻體自然的生物代謝過程，無需額外添加任何化學(xué)抑制劑。由本發(fā)明得到的IycB基因表達(dá)受RNA干擾的杜氏藻，在3. Omol/L鹽濃度、氮缺乏、強(qiáng)光脅迫下養(yǎng)殖就可以大量累積番茄紅素，HPLC 檢測結(jié)果顯示，其番茄紅素的含量增加到起始杜氏藻的14 16倍。本發(fā)明成果將為人類大量、廉價(jià)地獲取番茄紅素提供全新的解決方案。本發(fā)明所提出的特異性引物Y6-RNAi_F和Y6_RNAi_R用于克隆杜氏藻IycB基因 RNA干擾的目標(biāo)片段，由此得到的RNAi目標(biāo)片段有很好的干擾效果，引物Y6-RNAi-F的序列為 SEQ ID NO :2，引物 Y6-RNAi-R 的序列為 SEQ ID NO :3?？寺〉玫降柠}生杜氏藻RNAi目標(biāo)片段序列為SEQ ID NO :1，該鹽生杜氏藻是商業(yè)化生產(chǎn)β-胡蘿卜素的最常用的杜氏藻品種，在強(qiáng)光、高鹽等脅迫環(huán)境下能夠累積胡蘿
卜素的量最高可達(dá)到生物體干重的10% 14%，因此，該RNAi目標(biāo)片段應(yīng)用于使鹽生杜氏藻IycB基因沉默，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
圖1是1301-pBS-RNAi表達(dá)載體圖譜。圖2是電轉(zhuǎn)化后利用阿特拉津抗性平板篩選轉(zhuǎn)化藻。圖3是引物對(duì)atzA-5/8的PCR鑒定圖譜，M為NTKV_3marker，1為陰性對(duì)照，2-5 為不同單藻落，6為陽性對(duì)照。圖4是引物對(duì)Y6-RNAi-F/R的PCR鑒定圖譜，M為NTKV_3marker，1-8為不同單藻落，9為陰性對(duì)照，10為陽性對(duì)照。
圖5是鹽生杜氏藻Y6中類胡蘿卜素成分的HPLC分析，峰I為β -胡蘿卜素，峰II
為番茄紅素。圖6是經(jīng)RNA干擾獲得的1-Α4藻中類胡蘿卜素成分的HPLC分析，峰I為β -胡蘿卜素，峰II為番茄紅素。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所涉及的方法如無特殊說明均為該技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)方法，所用的酶制劑如無特別說明均為TaKaRa公司的產(chǎn)品，所涉及的引物的DNA序列在序列中表相應(yīng)列
出ο實(shí)施例一、鹽生杜氏藻RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建1、鹽生杜氏藻RNA提取與反轉(zhuǎn)錄鹽生杜氏藻Υ6為中國商業(yè)化生產(chǎn)生產(chǎn)β-胡蘿卜素的常用的杜氏藻品種。采用TRIzoI試劑提取鹽藻細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA庫。反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa 公司的 M-MLV 型 cDNA Synthesis Kit。2、表達(dá)載體1301-pBS-RNAi的構(gòu)建(1)以鹽生杜氏藻cDNA為模板擴(kuò)增目標(biāo)片段根據(jù)GenBank報(bào)道的cDNA序列(登錄號(hào)EU327876)設(shè)計(jì)特異性引物Y6_RNAi_F、 Y6-RNA1-R,從鹽生杜氏藻cDNA中克隆目標(biāo)片段RNAi9。(2)構(gòu)建 pMD19-T-RNAi9 質(zhì)粒并測序A.將RNAi9目的片段接入pMD19_T載體酶連體系如下a) RNAi9 目的片段4. 8 μ Lb) pMD19-T 載體0. 4 μ Lc)T4 連接酶0.2yLd) IOXligation buffer 0. 6 μ L總體系6yL上述體系16 °C連接過夜B.轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞C.菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子D.質(zhì)粒PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子E. Xbal/Clal、EcoRI/XhoI 酶切檢測F.序列測定對(duì)經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定均正確的菌株測序。C3)pKS_RNAi中間載體的構(gòu)建用堿裂解法提取pMD 19-T-RNAi9質(zhì)粒及pHANNIBAL質(zhì)粒載體，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度。首先用^(bal/Call雙酶切以上兩種質(zhì)粒，將膠回收得到的Pl正向片段與 pHANNIBAL載體連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR、酶切鑒定篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子RNAi-pl質(zhì)粒，再用BioI/ EcoRI雙酶切pMD19-T-RNAi9和RNAi-pl，回收0. 6kb的p2反向片段連接到RNAi-pl中，得到RNAi-pl-p2質(zhì)粒。在該中間載體上，干擾片段正向和反向插入到pHANNIBAL載體內(nèi)含子兩側(cè)，并置于CaMV35S啟動(dòng)子和OCS終止子之間，構(gòu)建了完整的干擾表達(dá)盒。凍融法回收酶切得到的基因片段a.酶切產(chǎn)物用0. 7%的瓊脂糖凝膠電泳分離b.在紫外燈下切下目的條帶，置于大小合適的封口膜上，_20°C放置30minc.擠膠，吸取DNA溶液收集于1. 5mL離心管中d.加等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min離心IOmine.上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，加2. 5倍體積的預(yù)冷乙醇、0.4倍體積的醋酸鈉，-20°C 靜置5h以上f. 14000r/min離心lOmin，沉淀用預(yù)冷的75%乙醇洗滌，離心，干燥，DNA沉淀溶于適量TE中，取0. 5 μ L電泳確定其濃度(4)構(gòu)建 pBS-RNAi 載體NotI酶切RNAi-pl_p2質(zhì)粒，回收4. 2kb的片段，插入到pBS_KS (+)載體的NotI酶切位點(diǎn)，得到pBS-RNAi質(zhì)粒。(5)構(gòu)建 1301-pBS-RNAi 表達(dá)載體以pCAMBIA1301質(zhì)粒為骨架構(gòu)建表達(dá)載體，首先用BioI限制性內(nèi)切酶將潮霉素抗性基因(hpt)替換為1.41Λ的阿特拉津氯水解酶基因(atzA)，得到1301_atzA載體。用&icI/BamHI分別雙酶切pBS-RNAi和1301-atzA表達(dá)載體，分別回收4. 2kb和 12kb的片段，連接得到1301-pBS-RNAi表達(dá)載體，其圖譜見圖2。該載體具有卡那霉素抗性以及阿特拉津(atzA)正篩選標(biāo)記。利用PCR、酶切驗(yàn)證載體的正確性。3、電擊轉(zhuǎn)化法、篩選電擊緩沖液0. 28mol/L NaCl、5mmol/L KCl、25mmol/L CaCl2,20mmol/L H印es、 0. 2mol/L 甘露醇、0. 2mol/L 山梨醇、O. 05% Tween_20、0· 4mol/L 甘油。電擊轉(zhuǎn)化步驟a.培養(yǎng)鹽生杜氏藻至對(duì)數(shù)生長期(1.0\10、611/!1^)，41，400017/1^11離心5111士11，
收集細(xì)胞。b.冰上操作，ImL電擊緩沖液懸浮細(xì)胞，洗滌2次。c.重懸至細(xì)胞密度為l.OX 107cell/mL，取90 100 μ L重懸藻液，加終濃度為 IOng/ μ L的載體，混勻，冰浴IOmin0d. 6kV/cm電擊，冰浴lOmin，加入ImL新鮮培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)12he.光暗=14 10液體培養(yǎng)Mh，最后鋪板于含0. 2 μ g/mL阿特拉津抗性的固體平板上培養(yǎng)至長出單藻落。4、PCR 鑒定挑取單藻落擴(kuò)大到ImL培養(yǎng)，然后用簡易CTAB法提取藻基因組，PCR篩選引物分別為atzA-5，序列 SEQ ID NO 4atzA-8，序列 SEQ ID NO 5MD-RNAi-F，序列 SEQ ID NO 6MD-RNAi-R，序列 SEQ ID NO 7
圖4、5分別顯示1301-pBS-RNAi表達(dá)載體后得到的轉(zhuǎn)化藻株的PCR檢測結(jié)果，篩選得到的藻株基因組存在atzA基因和RNAi片段，證明1301-pBS-RNAi表達(dá)載體得到成功轉(zhuǎn)化。5、轉(zhuǎn)化藻類胡蘿卜素的提取及HPLC分析經(jīng)上述電轉(zhuǎn)化、篩選、PCR鑒定操作步驟后，得到到IycB基因表達(dá)被干擾的鹽生杜氏藻1-A4，在3mol/L氯化鈉、氮缺乏、高光誘導(dǎo)條件下養(yǎng)殖該藻，同時(shí)以鹽生杜氏藻Y6為對(duì)照。按以下方式分離藻體、提取番茄紅素，利用HPLC定量檢測番茄紅素的含量，以確認(rèn)其是否能夠累積高含量的番茄紅素。微藻類胡蘿卜素提取方法a.取藻液15mL，4000r/min離心5min，傾去上清液。b.加2mL丙酮重懸藻泥，-20°C黑暗靜置2h，充分萃取。c.在 4°C下，6000r/min，離心 lOmin。d.取上清，0.45 μ m膜過濾，取20 μ L上樣。HPLC 條件色譜柱Comatex C18(5ym, Φ 4. 6 X 250mm)柱溫30°C、流速lmL/min檢測波長502nm流動(dòng)相A 乙腈和水(9:1，體積比)流動(dòng)相B:乙酸乙酯進(jìn)樣量20yL梯度0 16min B:0 60%16 30minB 60%30 35minB :60% 100%標(biāo)樣β -胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品用三氯甲烷溶解，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品用二氯甲烷溶解HPLC分析杜氏藻提取樣品的β-胡蘿卜素和番茄紅素的含量，附圖6、圖7是HPLC 分析的圖譜。HPLC分析結(jié)果顯示1-Α4的番茄紅素含量占總類胡蘿卜素的42. 7士3. 5%，遠(yuǎn)高于 Υ6的2. 9%，是Υ6的14. 74倍；按干重計(jì)算，1_Α4的番茄紅素含量為2. 7 士 0. 6%，超過番茄的750倍以上。
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權(quán)利要求
1.一種使杜氏藻(Dimaliella)累積高含量番茄紅素的方法，其特征是通過RNA干擾技術(shù)使杜氏藻的番茄紅素-β-環(huán)化酶(LycB)基因的表達(dá)被抑制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾杜氏藻的番茄紅素環(huán)化酶基因的表達(dá)的方法，其特征是包括以下步驟第一步，提取杜氏藻RNA，反轉(zhuǎn)錄得到杜氏藻cDNA庫。第二步，克隆目標(biāo)RNA干擾片段，構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建。第三步，RNAi表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化。第四步，PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的杜氏藻的RNA干擾表達(dá)載體，其特征在于含有氯霉素抗性基因或阿特拉津抗性基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的杜氏藻的RNA干擾表達(dá)載體，其特征在于干擾片段分別正向和反向插入到載體內(nèi)含子的兩側(cè)，并置于CaMV35S啟動(dòng)子和OCS終止子之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述目標(biāo)RNA干擾片段的克隆，其特征在于所采用的引物的序列為 SEQID NO 2 禾口 SEQ ID NO :3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的杜氏藻是以下杜氏藻的任何一種鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)、雙杜氏藻(Dunaliella biocuiate)。
7.根根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的杜氏藻是鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)或巴 1 (Dunaliella bardawil)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的杜氏藻是鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的RNA干擾，其特征在于目標(biāo)RNA干擾目標(biāo)片段序列為 SEQ ID NO :1ο
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的RNA干擾，其特征在于目標(biāo)RNA干擾目標(biāo)片段序列為SEQ IDNO 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物合成番茄紅素的方法，特別是利用RNA干擾技術(shù)使杜氏藻(Dunaliella)能夠累積高含量番茄紅素的方法。根據(jù)杜氏藻cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，克隆目標(biāo)RNA干擾片段，然后構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化進(jìn)杜氏藻細(xì)胞，經(jīng)篩選和PCR鑒定獲取了RNA干擾的杜氏藻，該杜氏藻的番茄紅素-β-環(huán)化酶基因的表達(dá)被抑制，細(xì)胞生物合成β-胡蘿卜素的過程被阻止于番茄紅素階段，在3.0mol/L鹽濃度、氮缺乏及強(qiáng)光脅迫條件下能夠在生物體內(nèi)大量累積番茄紅素，其番茄紅素的含量增加到起始杜氏藻的14～16倍。本發(fā)明的方法是大量、廉價(jià)地獲取天然番茄紅素的新途徑。
文檔編號(hào)C12P23/00GK102251007SQ20111014181
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者劉鑫, 李伯平, 陳喜文, 陳德富 申請(qǐng)人:南開大學(xué)