專利名稱：一種高效殺蟲真菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物防治領(lǐng)域，具體地涉及一種高效殺蟲真菌及其用途。
技術(shù)背景
農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園藝等植物以及牧草、草坪經(jīng)常遭受病蟲害侵襲，其中金龜子類 害蟲的為害十分嚴(yán)重，且缺乏高效的治理方法。我國(guó)金龜子種類多，1500種，分布廣， 其主要為害在幼蟲階段，由于幼蟲整個(gè)生活歷期全在土壤中，隱蔽性強(qiáng)，食量巨大，啃 食植物根、根莖或根系，造成嚴(yán)重減產(chǎn)或植株損害。一般年份造成10-30%的農(nóng)作物損 失，有的區(qū)域嚴(yán)重?fù)p失至50-80%，甚至絕收。長(zhǎng)期以采用化學(xué)農(nóng)藥防治，使其抗藥性 明顯增加，一般農(nóng)藥很難達(dá)到有效治理，有時(shí)不得不使用高毒農(nóng)藥，造成殘留和環(huán)境污 染，成為阻礙農(nóng)產(chǎn)品出口創(chuàng)匯的障礙，也直接威脅著人民的健康生活。近年我國(guó)加大農(nóng) 藥殘留與環(huán)境污染治理，以保障農(nóng)產(chǎn)品安全和環(huán)境生態(tài)平衡，原先使用的高毒性農(nóng)藥已 經(jīng)被禁用或限用，尚無(wú)有效的高效低毒農(nóng)藥。隨著人們生活水平的提高，對(duì)有機(jī)和無(wú)公 害農(nóng)產(chǎn)品需求日益增加，發(fā)展和應(yīng)用生物農(nóng)藥等無(wú)公害的植保技術(shù)成為生產(chǎn)急需解決的 問題。
與化學(xué)農(nóng)藥相比，生物農(nóng)藥在植物病害蟲防治中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如對(duì)不同目標(biāo) 害蟲的特效性，田間持效性，害蟲不易產(chǎn)生抗藥性，對(duì)天敵、人畜安全性及與環(huán)境兼容 性等，因而能夠在有效控制病蟲害的同時(shí)，維護(hù)生態(tài)食物鏈和環(huán)境平衡，成為近年的研 究與開發(fā)熱點(diǎn)。
利用對(duì)害蟲有控制作用的天然生物資源，是解決上述問題的重要途徑。綠僵菌 是一類最有潛力作為生物農(nóng)藥的昆蟲病原真菌，李增智等的綜述中報(bào)告有200多種昆蟲 曾徑被綠僵菌侵染。綠僵菌由于能在自然土壤環(huán)境下長(zhǎng)期存活，可有效地控制地下害蟲 暴發(fā)和為害。綠僵菌作為生物農(nóng)藥資源，其優(yōu)點(diǎn)是源于自然環(huán)境生物，對(duì)特定的病蟲草 害具有特效控制作用，對(duì)非靶生物安全性高，無(wú)污染無(wú)殘留，與環(huán)境友好兼容，適用于 農(nóng)作物無(wú)公害生產(chǎn)過程，加上可利用工業(yè)發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行規(guī)?；敝成a(chǎn)，極具市場(chǎng)開發(fā) 潛力。
綠僵菌基于對(duì)害蟲的體壁接觸侵染機(jī)制和在田間土壤中長(zhǎng)期存活的特性，在防 治地下害蟲尤其是金龜類害蟲方面有獨(dú)特潛力和明顯優(yōu)勢(shì)。但不同菌株對(duì)不同害蟲種 類的毒力有較強(qiáng)專一性。地下害蟲種類繁多、生活歷期長(zhǎng)和抗藥性強(qiáng)，加之土壤環(huán)境復(fù) 雜，要得到真正有防治應(yīng)用潛力的菌株必須經(jīng)過人工篩選和改良菌株。發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人提出并完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供一種能夠有效防治金龜類地下害蟲、與環(huán)境友好兼容的高 效殺蟲真菌綠僵菌菌株MBJQH2-2。
本發(fā)明的再一目的是提供上述綠僵菌菌株MBJQH2-2的培養(yǎng)方法。3
本發(fā)明的再一目的是提供上述綠僵菌菌株MBJQH2-2的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一目的是提供一種金龜子類地下害蟲的生物殺蟲劑。
本發(fā)明的發(fā)明人分別從河北、山東、江蘇、北京、貴州等地的農(nóng)田或林地采集 到土壤和感染綠僵菌病癥的蠐螬蟲尸，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行微生物分離、純化，保存純化的 綠僵菌菌種在PDAY試管培養(yǎng)基中，共得到12個(gè)菌株。將純化的菌種接種在PDAY平板 培養(yǎng)基上，于25士 1°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-12天，收集分生孢子粉，進(jìn)行生物測(cè)定，根據(jù)蠐 螬最終死亡率篩選得到3個(gè)具有較高毒力作用的菌株。將這3個(gè)菌株反復(fù)接種蠐螬蟲體 并從病蟲上再分離純化及生物學(xué)測(cè)定選擇，得到系列復(fù)壯菌株。先后從不同田間環(huán)境采 集到不同種類的蠐螬，分別是花生田暗黑鰓金龜、大黑鰓金龜和銅綠麗金龜，2種草坪金 龜，1種果樹金龜，1種高原灌木金龜，用上述相同方法進(jìn)行生物測(cè)定，比較復(fù)壯菌株與 原來(lái)初始菌株的殺蟲活性，最終篩選出高效菌株Metarhizium anisopliae MBJQH2-2。該 綠僵菌菌株MBJQH2-2 (Metarhizium anisopliae)于2010年10月27日保存于中國(guó)普通微 生物菌種保藏中心(保藏中心地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所，郵編100101)，其保藏編號(hào)是CGMCC No.4275。
所述菌株的ITSl-5.8S_r^2 rDNA區(qū)域的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示CCG AGTTAAGGGAAACCGACTTCCACTCCCACCCCTGTGATTATACCTTTAATTGTTGCTTC GGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTT CTGAGTGGTTAAAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGG CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTT CGAGCGTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCTGCGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGG CTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCT CTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGCCGTAAAAC CCCCCAACTTTTTATA
為了將本菌株用于害蟲防治，本發(fā)明還提供了上述綠僵菌MBJQH2-2菌株的大 量培養(yǎng)方法，其步驟包括
1)液體種子培養(yǎng)配制液體培養(yǎng)基，其中含蔗糖3%，酵母浸出粉1%。將菌種 孢子接種到裝有培養(yǎng)基的搖瓶中，接種量為2-3X IO5孢子/mL，于25士 1°C、2OOrpm搖 床上培養(yǎng)48h。
幻液體放大培養(yǎng)配制液體培養(yǎng)基，其中含蔗糖2%，玉米粉1%，酵母1%， 磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，硫酸銅0.001%。將液體種子接種發(fā)酵罐中，按體積 比接種量為2-5%，控制溫度25 士 1°C、轉(zhuǎn)速50-280rpm，16h后開始通氣，通氣量0.7 1，發(fā)酵培養(yǎng)48-60h。
3)固體發(fā)酵培養(yǎng)配制固體培養(yǎng)基，其中含谷殼或碎麥秸35-55%，麥麩或谷 糠40-50，粳米粉5-25%。所用容器可以是篩筐、透氣袋子或罐頭瓶等。將液體培養(yǎng) 物接種到滅菌的固體培養(yǎng)基中，接種量為體積重量比0.8-1，基料適宜厚度5-8cm，于 25士 1°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)10-14天，干燥后用振篩法或旋風(fēng)法分離收集孢子粉，即得到發(fā)酵產(chǎn)品 ο
本發(fā)明還提供了上述綠僵菌MBJQH2-2菌株的應(yīng)用，本發(fā)明的綠僵菌MBJQH2-2孢子可以制成粉劑、顆粒劑的形式投撒到蟲害發(fā)生區(qū)。優(yōu)選，在使用前將 上述綠僵菌MBJQH2-2孢子粉用泥土或工業(yè)無(wú)機(jī)填充料如硅藻土、高嶺土等進(jìn)行稀釋分 散，制成含孢量每克10-20億孢子的粉劑，然后投撒到地下害蟲發(fā)生的區(qū)域?；蛘?，在 使用前將孢子粉按照可濕性粉劑加工方法，制成含孢量每克20-100億孢子的可濕性粉 劑，兌水后噴灑或澆淋到地下害蟲發(fā)生的區(qū)域?；蛘撸谑褂们皩㈡咦臃郯凑疹w粒劑的 加工方法，制成含孢量每克2-10億孢子的顆粒劑，然后投撒到地下害蟲發(fā)生的區(qū)域。其 中，在播種時(shí)和作物生長(zhǎng)期間均可使用本發(fā)明的綠僵菌MBJQH2-2菌株制劑，由于金龜 類地下害蟲生活期長(zhǎng)，從初春到深秋的作物生長(zhǎng)期內(nèi)均可能造成危害。因此，根據(jù)本發(fā) 明的金龜子類地下害蟲的生物殺蟲劑，其包括上述綠僵菌菌株MBJQH2-2的孢子粉。
綠僵菌是一類昆蟲病原真菌，通過附著于昆蟲表皮、產(chǎn)生芽管穿透蟲體表皮侵 入，消耗蟲體營(yíng)養(yǎng)，自身快速繁殖，產(chǎn)生毒素，造成蟲體組織損害和病變死亡。高濕度 利于綠僵菌孢子的萌發(fā)和侵入，把握傍晚和雨前時(shí)機(jī)用菌可提高防治效果。同時(shí)綠僵菌 在土壤中有較長(zhǎng)的存活能力，可在植物被明顯危害期之前使用，使用后數(shù)月和翌年可保 持一定的防效。
本發(fā)明的綠僵菌菌株源于自然歸于自然、與環(huán)境友好兼容、無(wú)污染無(wú)殘留，對(duì) 金龜類地下害蟲有獨(dú)特的高效控制作用，可作為無(wú)公害新型農(nóng)藥，用于農(nóng)作物、果樹、 林木、草坪等地下害蟲的無(wú)害化生產(chǎn)過程。通過田間防治試驗(yàn)證明具有良好的防治效 果，對(duì)幾種重要種類金龜幼蟲防效達(dá)到60-70%。
圖1為M.anisopliae MBJQH2-2菌株的分生孢子形態(tài)。
圖2為M.anisopliae MBJQH2-2菌株的基因組DNA的電泳圖。
圖 3 為 M.anisopliae MBJQH2-2 菌株的 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 片段。
圖4為被綠僵菌MBJQH2-2侵染致病的金龜子幼蟲，左健康蟲；右罹病 蟲。
綠僵菌菌株MBJQH2_2 (Metarhizium anisopliae)于 2OlO 年 10 月 27 日保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(保藏中心地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中國(guó)科學(xué)院微 生物研究所，郵編100101)，其保藏編號(hào)是CGMCC No.4275。
具體實(shí)施方式
結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1綠僵菌MBJQH2-2菌株的分離、純化
分別從河北、山東、江蘇、北京、貴州等地的農(nóng)田或林地采集到土壤和感染綠 僵菌病癥的蠐螬蟲尸，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行微生物分離、純化。
分離、純化步驟為小心挑取蟲尸上的菌體，接種到選擇性培養(yǎng)基上，在25°C 溫度下培養(yǎng)7天，分辨菌落并轉(zhuǎn)移到新的選擇性培養(yǎng)基平皿上，在25°C溫度下培養(yǎng)14天 以上，待菌落完全產(chǎn)孢后，轉(zhuǎn)移到菌種培養(yǎng)基試管中，在25°C溫度下培養(yǎng)14天后，于 4°C冰箱冷藏保存。
保存純化的綠僵菌菌種在PDAY試管培養(yǎng)基中，共得到12個(gè)菌株。將純化的5菌種接種在PDAY平板培養(yǎng)基上，于25士 1°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-12天，收集分生孢子粉， 進(jìn)行生物測(cè)定。測(cè)定方法是將孢子粉定量加入到土壤中，混拌均勻，形成每克土壤含 2X IO7孢子的混合菌土，從田間采集蠐螬并放入上述菌土中，每菌株處理20只蠐螬，3 次重復(fù)，于23-26°C培養(yǎng)20天，根據(jù)蠐螬最終死亡率篩選得到3個(gè)具有較高毒力作用的菌 株。將這3個(gè)菌株反復(fù)接種蠐螬蟲體并從病蟲上再分離純化，得到復(fù)壯菌株。先后從不 同田間環(huán)境采集到不同種類的蠐螬，分別是花生田暗黑鰓金龜、大黑鰓金龜和銅綠麗金 龜，2種草坪金龜，1種果樹金龜，1種高原灌木金龜，用上述相同方法進(jìn)行生物測(cè)定， 比較復(fù)壯菌株與原來(lái)初始菌株的殺蟲活性，最終篩選出高效菌株Metarhizium anisopliae MBJQH2-2。綠僵菌菌株 MBJQH2-2 (Metarhizium anisopliae)于 2010 年 10 月 27 日保存 于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(保藏中心地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中國(guó)科學(xué) 院微生物研究所，郵編100101)，其保藏編號(hào)是CGMCC No.4275。
實(shí)施例2菌株的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征
配制PDAY培養(yǎng)基，其組分和配制方法為將新鮮土豆200g加水約IOOOmL煮開 15min,用紗布過濾后留液體，加葡萄糖20g、酵母浸出粉相、瓊脂15g，加熱使瓊脂完 全融化，定量至IOOOmL,分裝到三角瓶中，置于高壓蒸氣滅菌器中121°C保持20η ι， 待涼至約60°C時(shí)倒入培養(yǎng)皿中，制成平板待用。
在PDAY平板培養(yǎng)基上接種分生孢子，25°C培養(yǎng)2d，肉眼觀察可見菌落，菌落 菌絲呈白色絨毛狀，繼續(xù)培養(yǎng)3-4d，可見菌落擴(kuò)大生長(zhǎng)，表面有綠色孢子產(chǎn)生，顏色由 淺綠色逐漸變?yōu)樯铋蠙炀G色。
在凹型載玻片的小室內(nèi)滴一滴滅菌的PDAY培養(yǎng)基，接種分生孢子，25°C培養(yǎng) 3-4d，于顯微鏡下觀察，可見分生孢子梗單生，瓶梗柱狀單生。分生孢子短柱形中部略 窄但不明顯，兩端鈍圓或略尖，大小5-8Χ2-3μιη，在瓶梗上首尾相連著生成長(zhǎng)鏈，如 圖1所示。
實(shí)施例3菌株的核糖體ITS區(qū)核苷酸序列特征
配制LM培養(yǎng)基，其組分和配制方法為稱取蔗糖20g、蛋白胨5g，加水至 IOOOmL,分裝至三角瓶，置于高壓蒸氣滅菌器中121°C保持20η ι，放涼至室溫備用。
接種分生孢子至上述培養(yǎng)基中，接種量為2-3Χ105孢子/mL，于25士 1°C、 200rpm搖床上培養(yǎng)48h，用濾紙過濾后留菌絲，擠干水分備用。
用CTAB法提取基因組DNA。按常規(guī)DNA提取操作進(jìn)行，得到基因組DNA， 如圖2所示。
以 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 區(qū)域引物 1 5 ‘-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC 和引 物2 5 ‘-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增的DNA片段，如圖3，將片段進(jìn)行核苷酸序列檢測(cè)，得到菌株ITSlUS-ITMrDNA區(qū)域的核苷酸序列，如 SEQI D No. 1 所示。
實(shí)施例4菌株的發(fā)酵培養(yǎng)
按以下步驟進(jìn)行
1)液體種子培養(yǎng)配制液體培養(yǎng)基，其組分和配制方法為稱取蔗糖30g、酵母 浸出粉10g，加水至lOOOmL，分裝至三角瓶，置于高壓蒸氣滅菌器中121°c保持20η ι， 放涼至室溫備用。將菌種孢子接種到裝有培養(yǎng)基的搖瓶中，接種量為3X IO5孢子/mL，于25 士 1 °C、200rpm搖床上培養(yǎng)48h。
幻液體放大培養(yǎng)配制液體培養(yǎng)基，其組分和配制方法為按以下比例稱取蔗 糖20g、玉米粉10g、酵母10g、磷酸氫二鉀lg、硫酸鎂0.5g、硫酸銅O.Olg，加水至 lOOOmL。于發(fā)酵罐中通高壓蒸氣至121°C保持20η ι，放涼至室溫備用。將1)培養(yǎng)的 液體種子接種發(fā)酵罐中，按體積比2%接種，控制溫度25士 1°C，轉(zhuǎn)速150-200rpm，16h 后開始通氣，通氣量0.7 1，發(fā)酵培養(yǎng)54h。
3)固體發(fā)酵培養(yǎng)配制固體培養(yǎng)基，其組分和配制方法為按以下比例稱取谷殼 350g、麥麩550g、粳米粉100，混合均勻后分裝到罐頭瓶中，裝量高度6cm，以透氣膜封 蓋，置于高壓蒸氣滅菌器中121°C保持20η ι，放涼至室溫備用。將幻的液體培養(yǎng)物接 種到滅菌的固體培養(yǎng)基中，接種量為體積重量比0.8，于25士 1°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)14天。
4)干燥后用振篩法或旋風(fēng)法分離收集孢子粉，即得到發(fā)酵產(chǎn)品。
實(shí)施例5菌株對(duì)金龜子卵孵化的抑制作用效果
6月下旬，分別從田間采集到銅綠麗金龜和大黑鰓金龜成蟲，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼 養(yǎng)，待其產(chǎn)卵，取3-5日齡的卵進(jìn)行生物測(cè)定。測(cè)定方法為將發(fā)酵培養(yǎng)得到的孢子粉用 0.05%的TW80水溶液配制成5 X IO7孢子/mL的孢子懸浮液，將蟲卵浸沒在孢子懸浮液 中20sec，取出后立即置于濾紙吸去多余水分，埋于含水量17%的滅菌土壤中。每處理 30只蟲卵，3次重復(fù)，以TW80水溶液為空白對(duì)照。于23-26°C室溫孵化12天，根據(jù)孵 化的幼蟲數(shù)比較確定菌株對(duì)蟲卵的抑制作用。結(jié)果見表1，證明菌株能抑制一定比例的蟲 卵孵化。
表1綠僵菌MBJQH2-2對(duì)兩種金龜子卵孵化的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種高效殺蟲真菌綠僵菌菌株MBJQH2-2，Metarhizium anisopliae,其保藏編號(hào) 為CGMCC No.4275。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠僵菌菌株MBJQH2-2，其特征在于，所述菌株的 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA區(qū)域的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
3.權(quán)利要求1所述綠僵菌菌株MBJQH2-2的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括 以下步驟1)液體種子培養(yǎng)配制液體培養(yǎng)基，其中含蔗糖3%，酵母浸出粉1%，將菌種孢子 接種到裝有培養(yǎng)基的搖瓶中，接種量為2-3X IO5孢子/mL，于25士 1°C、200rpm搖床上 培養(yǎng)48h ；2)液體放大培養(yǎng)配制液體培養(yǎng)基，其中含蔗糖2%，玉米粉1%，酵母1%，磷酸 氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，硫酸銅0.001%，將液體種子接種發(fā)酵罐中，按體積比接種 量為2-5%，控制溫度25士 1°C、轉(zhuǎn)速50-280rpm，16h后開始通氣，通氣量0.7 1，發(fā) 酵培養(yǎng)48-60h ；3)固體發(fā)酵培養(yǎng)配制固體培養(yǎng)基，其中含谷殼或碎麥秸35-55%，麥麩或谷糠 40-50%,粳米粉5-25%，將液體培養(yǎng)物接種到滅菌的固體培養(yǎng)基中，接種量為體積重 量比0.8-1，基料適宜厚度5-8cm，于25士 1°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)10-14天，干燥后用振篩法或 旋風(fēng)法分離收集孢子粉，即得到發(fā)酵產(chǎn)品。
4.權(quán)利要求1所述綠僵菌菌株MBJQH2-2對(duì)金龜子類地下害蟲的殺蟲作用。
5.—種金龜子類地下害蟲的生物殺蟲劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的綠僵菌 菌株MBJQH2-2的孢子粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物殺蟲劑，其特征在于，所述殺蟲劑為粉劑或顆粒劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物防治領(lǐng)域，具體地涉及一種高效殺蟲真菌及其用途。本發(fā)明提供一種能夠有效防治金龜類地下害蟲、與環(huán)境友好兼容的高效殺蟲真菌綠僵菌菌株MBJQH2-2，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4275。本發(fā)明的綠僵菌菌株源于自然歸于自然、與環(huán)境友好兼容、無(wú)污染無(wú)殘留，對(duì)金龜類地下害蟲有獨(dú)特的高效控制作用，可作為無(wú)公害新型農(nóng)藥，用于農(nóng)作物、果樹、林木、草坪等地下害蟲的無(wú)害化生產(chǎn)過程。通過田間防治試驗(yàn)證明具有良好的防治效果，對(duì)幾種重要種類金龜幼蟲防效達(dá)到60-70％。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102021122SQ201010538328
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者農(nóng)向群, 劉春琴, 張澤華, 王廣君 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所