專利名稱：黃瓜亞硝酸鹽主效qtl緊密連鎖的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃瓜育種及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是選擇利用與黃瓜亞硝酸鹽主效 QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，以提高黃瓜品質(zhì)育種效率。
背景技術(shù)：
亞硝酸鹽是影響蔬菜質(zhì)量的重要因素之一，在人體內(nèi)會(huì)引起高鐵血紅蛋白癥，還能與人體次級(jí)胺結(jié)合，形成亞硝胺，有致癌作用(張夫道，200 。有研究表明，中國大部分地區(qū)蔬菜中亞硝酸鹽的污染已不容忽視。蔬菜中亞硝酸鹽含量國家標(biāo)準(zhǔn)，以NaNO2彡4. Omg kg-1 (GB184061-2001)。為了人民群眾的安全健康，應(yīng)加快選育低亞硝酸鹽含量的黃瓜品種。但是黃瓜中亞硝酸鹽含量的測定，要等果實(shí)發(fā)育到成熟期才能進(jìn)行；且測量方法比較繁瑣；況且表現(xiàn)型與基因型之間缺乏明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系，選擇效率不高。近年來分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，有效地解決了這一問題。通過構(gòu)建遺傳連鎖圖譜和數(shù)量位點(diǎn)(QTL)分析，能夠檢測到與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記。使用與這一特定親本的亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以對(duì)該特定親本的后代或其衍生品種(品系)在苗期進(jìn)行早世代篩選，淘汰高亞硝酸鹽的品種(品系)，節(jié)約生產(chǎn)成本， 提高育種效率。黃瓜分子標(biāo)記成功申請(qǐng)專利已有很多先例。例如徐向麗等發(fā)明了一種與黃瓜雌性性狀相關(guān)的分子標(biāo)記(公告號(hào)CN101113469)，潘俊松發(fā)明了與黃瓜單性花基因M共分離的分子標(biāo)記(公告號(hào)CN101580876)，劉龍洲等發(fā)明了與黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記(公告號(hào)CN101240342)，關(guān)媛等發(fā)明了與黃瓜有毛基因Gl緊密連鎖的分子標(biāo)記 (公告號(hào):CN101250523)。D0327是東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組選育的優(yōu)良親本(果皮綠色均勻、光皮、無刺瘤、果柄極短)，其亞硝酸鹽含量經(jīng)3年5點(diǎn)測驗(yàn)低于4. Omg · kg—1。目前尚未有與其主效QTL相連鎖分子標(biāo)記的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種方法，用以檢測與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，并通過這些分子標(biāo)記來預(yù)測黃瓜亞硝酸鹽的水平，提高育種速度和加快育種進(jìn)程。本發(fā)明提供的與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得a亞硝酸鹽含量低的黃瓜品種D0327 (2. 56mg · kg—1)作父本與亞硝酸鹽含量高的黃瓜品種1058(8. 92mg · kg—1)作母本進(jìn)行雜交，得到雜種F1 ；b由雜種F1代自花授粉獲得F2代；c分離每個(gè)單株黃瓜葉片的DNA，采用簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，6 %丙烯酰胺凝膠上電泳分離，獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)；
d基于遺傳連鎖交換定律，對(duì)分子標(biāo)記分析資料構(gòu)建黃瓜遺傳連鎖圖；e在果實(shí)收獲以后，測定F2代每個(gè)單株果實(shí)的亞硝酸鹽，2. 6mg · kg-1以上為高亞硝酸鹽型，2. 6mg · kg-1以下為低亞硝酸鹽型，f將F2代每個(gè)單株果實(shí)的亞硝酸鹽與黃瓜遺傳連鎖圖譜進(jìn)行連鎖和QTL分析，將 LOD彡3. 0作為QTL存在的闕值，確定與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL連鎖的分子標(biāo)記CSWTA17。與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng)用包括將分子標(biāo)記SCSWTA17 應(yīng)用于黃瓜品種和品系的基因檢測，以判斷該品種和品系亞硝酸鹽的水平。a以D0327及其衍生品種或品系為父母本與其他黃瓜品種雜交并繁衍至F2以上，b對(duì)通過步驟a獲得黃瓜單個(gè)植株，分離葉片DNA，檢測分離的DNA中是否存在與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，如果分子標(biāo)記出現(xiàn)，則可預(yù)測黃瓜亞硝酸鹽含量在2. 6mg · kg-1以下。所用D0327及其衍生品種或品系，是指以D0327為親本，通過常規(guī)雜交方法獲得的黃瓜品種或品系。本發(fā)明能夠克服黃瓜亞硝酸鹽含量只能在果實(shí)成熟期進(jìn)行檢測的缺點(diǎn)，在苗期就能夠通過分子標(biāo)記對(duì)黃瓜品種和品系的亞硝酸鹽水平進(jìn)行預(yù)測和篩選，淘汰高含量植株，減少人力和物力的浪費(fèi)，提高育種效率。
附圖1是構(gòu)建的黃瓜遺傳連鎖圖，標(biāo)記間的距離已用數(shù)字標(biāo)出。此連鎖組共含有 4個(gè)SSR標(biāo)記，亞硝酸鹽QTL記為Ni，位于連鎖組的CSWTA04-CSWTA17區(qū)間內(nèi)，距標(biāo)記的最近距離1. 8cM。
具體實(shí)施例方式實(shí)例與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲得(I)F2群體的構(gòu)建及亞硝酸鹽含量的測定采用亞硝酸鹽含量低的黃瓜品種D0327 (2. 56mg · kg—1)作父本與亞硝酸鹽含量高的黃瓜品種1058(8. 92mg · kg—1)作母本進(jìn)行雜交，得到雜種F1 ；由雜種F1代自花授粉獲得 F2代；產(chǎn)生240個(gè)單株。摘取相同開花期相同節(jié)位的成熟商品瓜，洗凈吸干水分后切段，用勻漿機(jī)攪碎。準(zhǔn)確稱取5. Og,裝入25毫升刻度試管中，加去離子水IOml，蓋上玻璃塞，置于沸水浴中提取30 分鐘，冷卻后過濾并用去離子水定容至25ml。吸取提取液2. Oml，加1 %磺胺溶液4ml，搖勻。 反應(yīng)5min后，加4. OmlO. 02%鹽酸萘乙二胺后搖勻，室溫下放置30min后在540nm的波長下比色。比色階段進(jìn)行三次重復(fù)。(2)分子標(biāo)記分析，遺傳圖譜構(gòu)建及QTL分析選取在父母本間具有擴(kuò)增多態(tài)性的SSR引物對(duì)240個(gè)單株進(jìn)行分析，根據(jù)SSR條帶在群體中的分離情況，將有母本類型條帶的個(gè)體記為“A”，有父本類型條帶的個(gè)體記為 “B”，雜合類型條帶的個(gè)體記為“H”，缺失不清的記為“_”。
利用Mapmaker/EXP3. 0作圖軟件，構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜。應(yīng)用Group命令進(jìn)行連鎖分析和分組(L0D = 5. 0)，連鎖標(biāo)記少于8個(gè)的用Compare命令進(jìn)行優(yōu)化排序，多于8 個(gè)的用Ripple命令排序，錯(cuò)誤檢測水平設(shè)為1 %，利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳圖距(cM)。將LOD彡3. O作為QTL存在的闕值，用WinQTLcartograph V2. O進(jìn)行QTL定位。與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記CSWTA17 采用引物CSWTA17進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增在6%的聚丙烯凝膠(100毫升聚丙烯凝膠含有5. 7克丙烯酰胺，0. 3克雙丙酰胺)電泳上分離后，獲得分子標(biāo)記，所得片段為198bp。
權(quán)利要求
1.與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得的a亞硝酸鹽含量低的黃瓜品種D0327(2.56mg· kg—1)與亞硝酸鹽含量高的黃瓜品種 1058(8. 92mg · kg-1)作母本進(jìn)行雜交，得到雜種F1 ； b由雜種F1代自花授粉獲得F2代；c分離每個(gè)單株黃瓜葉片的DNA，采用簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，6% 丙烯酰胺凝膠上電泳分離，獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)；d基于遺傳連鎖交換定律，對(duì)分子標(biāo)記分析資料構(gòu)建黃瓜遺傳連鎖圖； e在果實(shí)收獲以后，測定F2代每個(gè)單株果實(shí)的亞硝酸鹽，2. 6mg -kg-1以上為高亞硝酸鹽型，2. 6mg · kg-1以下為低亞硝酸鹽型，f將F2代每個(gè)單株果實(shí)的亞硝酸鹽與黃瓜遺傳連鎖圖譜進(jìn)行連鎖和QTL分析，將 LOD彡3. 0作為QTL存在的闕值，確定與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL連鎖的分子標(biāo)記CSWTA17。
2.權(quán)利要求1所述與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于用黃瓜葉片，采用引物CSWTA17進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增在6 %的聚丙烯凝膠(100毫升聚丙烯凝膠含有 5. 7克丙烯酰胺，0. 3克雙丙酰胺)電泳上分離后，獲得分子標(biāo)記，所得產(chǎn)物為198bp。
3.如權(quán)利1和2所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于a以D0327及其衍生品種或品系為父母本與其他黃瓜品種雜交并繁衍至F2以上， b對(duì)通過步驟a獲得的黃瓜單個(gè)植株，分離葉片DNA，檢測分離的DNA中是否存在與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，如果分子標(biāo)記出現(xiàn)，則可預(yù)測黃瓜亞硝酸鹽在 2. 6mg · kg-1 以下。
4.根據(jù)權(quán)利3所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于將分子標(biāo)記用于黃瓜品種或品系的基因檢測，以判斷該品種或品系的亞硝酸鹽是否在2. 6mg · kg-1以下。
5.根據(jù)權(quán)利3和4所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所用D0327及其衍生品種或品系，是指以D0327為親本，通過常規(guī)雜交方法獲得的黃瓜品種或品系。
全文摘要
本發(fā)明是一種黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記方法，屬于黃瓜育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。將亞硝酸鹽含量低的黃瓜品種D0327(2.56mg·kg-1)作父本與亞硝酸鹽含量高的黃瓜品種1058(8.92mg·kg-1)作母本進(jìn)行雜交，對(duì)F2的每個(gè)單株的基因型與每個(gè)單株的果實(shí)亞硝酸鹽數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳連鎖分析，獲得與D0327亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記CSWTA17。通過檢測D0327及其衍生品種(品系)的DNA是否含有分子標(biāo)記CSWTA17，可預(yù)測亞硝酸鹽水平，從而加快低亞硝酸鹽黃瓜新品種的選育速度。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102311949SQ20101022182
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者周秀艷, 王桂玲, 秦智偉 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)