L-半胱氨酸生產(chǎn)菌以及l(fā)-半胱氨酸的生產(chǎn)方法

專利名稱：L-半胱氨酸生產(chǎn)菌以及l(fā)-半胱氨酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-半胱氨酸或其關(guān)聯(lián)物質(zhì)的生產(chǎn)方法，具體來說涉及適于生產(chǎn)L-半 胱氨酸或其關(guān)聯(lián)物質(zhì)的細(xì)菌、以及使用該細(xì)菌的L-半胱氨酸或其關(guān)聯(lián)物質(zhì)的生產(chǎn)方法。 L-半胱氨酸以及其關(guān)聯(lián)物質(zhì)可以在醫(yī)藥品、化妝品以及食品領(lǐng)域中被利用。
背景技術(shù)：
L-半胱氨酸可以通過從毛發(fā)、角、羽毛等含有角蛋白質(zhì)的物質(zhì)中提取而獲得，或者 以DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸為前體通過細(xì)菌酶轉(zhuǎn)化而獲得。此外，還計劃使用新型酶通 過固定化酶方法大量生產(chǎn)L-半胱氨酸。還嘗試通過使用細(xì)菌的發(fā)酵方法來生產(chǎn)L-半胱氨酸。例如，本發(fā)明人公開的使 用下述埃希氏菌屬細(xì)菌的L-半胱氨酸的生產(chǎn)方法，所述埃希氏菌屬細(xì)菌的L-半胱氨酸分 解系統(tǒng)受到了抑制、并且攜帶且降低了 L-半胱氨酸反饋抑制的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(serine acetyltransferase (EC 2. 3. 1. 30)，下面也稱為“SAT”)(專利文獻(xiàn)1)。此外，作為通過抑制 L-半胱氨酸分解系統(tǒng)從而提高了 L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌，已知的有使胱硫醚- β -裂 解酶(專利文獻(xiàn)1)、色氨酸酶(專利文獻(xiàn)2、、0_乙酰絲氨酸巰基水解酶B (專利文獻(xiàn)3)的 活性降低或缺失的棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏屬細(xì)菌。此外，還已知使用下述細(xì)菌的L-半胱 氨酸制造方法，所述細(xì)菌中，利用編碼具有降低L-半胱氨酸反饋抑制的特定突變的SAT的 DNA序列，使L-半胱氨酸物質(zhì)代謝擺脫了調(diào)控(專利文獻(xiàn)4)。還已知編碼YdeD蛋白質(zhì)的ydeD基因(非專利文獻(xiàn)1)以及編碼YfiK蛋白質(zhì)的 yfiK基因(專利文獻(xiàn)幻與L-半胱氨酸途徑的代謝產(chǎn)物的分泌有關(guān)。此外，已知通過增強(qiáng)作 為編碼適于分泌針對細(xì)胞的有毒物質(zhì)的蛋白質(zhì)的基因的mar-基因座、acr-基因座、cmr-基 因座、mex-基因座、bmr-基因座、qacA-基因座(專禾丨J文獻(xiàn)6)、或emrAB、emrKY、yojIH、 acrEF、bcr或者cusA基因(專利文獻(xiàn)7)的表達(dá)來提高L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的技術(shù)。此外，作為L-半胱氨酸生產(chǎn)菌，已知有增強(qiáng)了由cysB基因編碼的半胱氨酸調(diào)節(jié)子 的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的活性的大腸桿菌(專利文獻(xiàn)8)。另一方面，在L-氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，不僅L-氨基酸向細(xì)胞外的分泌，L-氨基 酸的攝入也是很重要的。微生物在各自的生長繁育的環(huán)境中，具有從環(huán)境中向細(xì)胞內(nèi)攝 入多種氨基酸并加以利用的能力。例如大腸桿菌(E. coli)，其具有許多轉(zhuǎn)運體，預(yù)計也應(yīng) 當(dāng)具有相當(dāng)多的與L-氨基酸的攝入相關(guān)的轉(zhuǎn)運體。在預(yù)測具有“膜轉(zhuǎn)運蛋白(membrane tranporter protein) ”功能的物質(zhì)中，估計其中的14%與氨基酸的轉(zhuǎn)運相關(guān)(非專利文 獻(xiàn)2)。但是，由于在轉(zhuǎn)運體中通常存在著多種基質(zhì)特異性的各種種內(nèi)同源物(〃，口夂， paralogue)，另外功能性的重復(fù)(對于同一基質(zhì)存在多個攝入系統(tǒng))也較多，因此對轉(zhuǎn)運體 的功能的鑒定是非常困難的(非專利文獻(xiàn)3)。如上所述，轉(zhuǎn)運體的功能、生理上的作用是非 常復(fù)雜的。因此，就從同源性、表型出發(fā)簡單地推定轉(zhuǎn)運體的性質(zhì)而言，有時具有不能反應(yīng) 出實際的轉(zhuǎn)運體的生理功能的情況。例如，無法預(yù)測在對多種基質(zhì)的輸送中哪一種輸送是 具有生理上重要功能的等。此外，相反，即使了解了輸送某種物質(zhì)的過程，還具有存在其他多個同樣轉(zhuǎn)運該物質(zhì)的因子的可能性。因此，就用于氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)的微生物的修飾而言， 利用轉(zhuǎn)運體作為目標(biāo)并不容易。此外，在細(xì)菌的L-半胱氨酸以及其關(guān)聯(lián)化合物中，涉及到胱氨酸的攝入系統(tǒng)的有 如下所示的幾種看法，但基本上沒有與L-半胱氨酸、S-硫代半胱氨酸(S- 7 > 7才〉7 f ^ S-sulfocysteine)的攝入相關(guān)的有力的見解。推測在大腸桿菌中存在動力學(xué)特性(Kinetics)不同的至少2種胱氨酸攝入系統(tǒng) (非專利文獻(xiàn)4)。在體外(in vitro)的實驗體系中顯示出FliY與胱氨酸相結(jié)合(非專利 文獻(xiàn)幻，fliY基因和與其鄰近的yecC，yecS, yecO形成操縱子，推測其作為ABC轉(zhuǎn)運體發(fā) 揮功能(非專利文獻(xiàn)6)。但是，它們是否在大腸桿菌中起生理上攝入胱氨酸的功能，目前尚 未通過實驗直接揭示出來。同樣地，在沙門氏菌(Salmonella)屬的細(xì)菌中，預(yù)計也存在動力學(xué)上不同的3種 胱氨酸攝入系統(tǒng)(非專利文獻(xiàn)7)，但目前還沒有鑒定出與此相關(guān)的蛋白質(zhì)、以及編碼它們 的基因。另外，已有報道稱在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中具有3種胱氨酸攝入系 統(tǒng)(YckKJI，YtmJKLMN, YhcL)，在該3種系統(tǒng)缺損的情況下，將胱氨酸作為唯一硫源時，該細(xì) 菌不能生長繁育(非專利文獻(xiàn)8)。有報道稱大腸桿菌的YdjN與涉及枯草芽孢桿菌的胱氨酸攝入的TcyP具有45 %的 同源性(非專利文獻(xiàn)8)，但實際上，無法確認(rèn)其是否具有胱氨酸攝入活性。 在發(fā)酵乳桿菌(Lactobai 1 Ius fermentum) BRl 1中，已知了由bspA編碼胱氨酸攝 入系統(tǒng)(Turner et al. J. Bacteriol. 181. 2192-2198 (1999))。此外，推測在侵肺軍團(tuán)菌 (Legionella pneumophila)中存在動力學(xué)上不同的2種半胱氨酸攝入系統(tǒng)(非專利文獻(xiàn) 9)，但尚未確定基因以及蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1特開平11-155571號專利文獻(xiàn)2特開2003-169668專利文獻(xiàn)3特開2005-245311專利文獻(xiàn)4特表2000-504926專利文獻(xiàn)5特開2004-49237專利文獻(xiàn)6美國專利第5972663號專利文獻(xiàn)7特開2005-287333專利文獻(xiàn)8國際公開小冊子第01/27307號
非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 Dabler et al. , Mol. Microbiol. 36. 1101-1112(2000)非專利文獻(xiàn)2 Paulsen et al.，J. Mol. Biol. 277. 573-592 (1998)非專利文獻(xiàn)3 Hosie et al.，Res. Microbiol. 152. 259-270(2001)非專利文獻(xiàn)4 Berger et al.，J. Biol. Chem. 247. 7684-7694(1972)非專利文獻(xiàn)5 Butler et al.，Life Sci. 52. 1209-1215(1993)非專利文獻(xiàn)6 Hosie et al.，Res. Microbiol. 152. 259-270(2001)非專利文獻(xiàn)7 Baptist et al. , J. Bacteriol. 131. 111-118(1977)
非專利文獻(xiàn) 8 Burguiere et al.，J. Bacteriol. 186. 4875-4884(2004)非專利文獻(xiàn) 9 Ewann et al.，Appl. Environ. Microbiol. 72. 3993-4000(2006)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的課題是開發(fā)使細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力提高的新型技術(shù)，提供L-半 胱氨酸生產(chǎn)菌、以及使用該細(xì)菌的L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前體、或 者它上述物質(zhì)的混合物的生產(chǎn)方法。解決問題的方法本發(fā)明人等為了解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過修飾細(xì)菌使得ydjN 基因編碼的蛋白質(zhì)的活性降低，可以提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力；還發(fā)現(xiàn)通過修飾細(xì)菌使 得上述蛋白質(zhì)和fliY基因編碼的蛋白質(zhì)的活性降低，可以進(jìn)一步提高L-半胱氨酸的生產(chǎn) 能力，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明如下所述。(1) 一種屬于腸桿菌科的細(xì)菌，其具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，并且經(jīng)過了修飾從 而使得YdjN蛋白質(zhì)的活性降低。(2)上述的細(xì)菌，其中，所述YdjN蛋白質(zhì)為具有SEQ ID N0:2或4的氨基酸序列 的蛋白質(zhì)或者該蛋白質(zhì)的變體。(3)上述的細(xì)菌，其中，還經(jīng)過了修飾從而使得FliY蛋白質(zhì)的活性降低。(4)上述的細(xì)菌，其中，所述FliY蛋白質(zhì)為具有SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列 的蛋白質(zhì)或者該蛋白質(zhì)的變體。(5)上述的細(xì)菌，其中，所述YdjN蛋白質(zhì)或FliY蛋白質(zhì)活性是是通過降低編碼所 述YdjN蛋白質(zhì)或FliY蛋白質(zhì)的ydjN基因或fliY基因的表達(dá)量，或者破壞所述基因而降 低的。(6)上述的細(xì)菌，其中，所述ydjN基因是下述(a) (c)中的任一種DNA (a)含有SEQ ID NO :1或3的堿基序列的DNA ；(b)與SEQ ID NO :1或3的堿基序列的互補(bǔ)序列或能夠由所述堿基序列制備的探 針在嚴(yán)格條件下雜交的DNA ；(c)與SEQ ID NO :1或3的堿基序列具有95%以上的同一性的DNA。(7)上述的細(xì)菌，其中，所述fliY基因是下述(d) (f)中的任一種DNA (d)含有SEQ ID NO :5或7的堿基序列的DNA ；(e)與SEQ ID NO :5或7的堿基序列的互補(bǔ)序列或能夠由所述堿基序列制備的探 針在嚴(yán)格條件下雜交的DNA ；(f)與SEQ ID NO :5或7的堿基序列具有95%以上的同一性的DNA。(8)上述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還具有下述性質(zhì)中的至少一種i)經(jīng)過修飾從而使得絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性提高；ii)經(jīng)過修飾從而使得yeaS基因的表達(dá)增強(qiáng)；iii)經(jīng)過修飾從而使得3-磷酸甘油酸脫氫酶(phosphoglyceratedehydrogenase) 活性提高；
iv)經(jīng)過修飾從而使得硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)(transport system)的活性 增強(qiáng)。(9)上述的細(xì)菌，其中，所述細(xì)菌為屬于泛菌屬的細(xì)菌。(10)上述的細(xì)菌，其中，所述細(xì)菌為Pantoea ananatis。(11)上述的細(xì)菌，其中，所述細(xì)菌為大腸桿菌。(12) 一種L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前體、或者上述物質(zhì)的 混合物的生產(chǎn)方法，該方法中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌，并從所述培養(yǎng)基中收集L-半胱 氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前體、或者上述物質(zhì)的混合物。發(fā)明效果通過本發(fā)明可以提高屬于腸桿菌科的細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力。此外，通過本 發(fā)明，可以更高效地生產(chǎn)L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前體、或者它們的 混合物。


圖1為顯示在大腸桿菌MG1655中S-硫代半胱氨酸的攝入的圖。圖2為顯示在大腸桿菌MG1655中胱氨酸的攝入的圖。圖3為顯示在大腸桿菌MG1655中半胱氨酸的攝入的圖。圖4為顯示基于P. ananatis ydjN的S-硫代半胱氨酸的攝入的圖。圖5為顯示基于大腸桿菌fliY的缺損的胱氨酸的攝入的圖。圖6為顯示基于大腸桿菌fliY的強(qiáng)化的胱氨酸的攝入的圖。圖7為顯示基于大腸桿菌fliY的缺損的半胱氨酸的攝入的圖。圖8為顯示啟動子Pnlp的序列的圖。發(fā)明的
具體實施例方式<1>本發(fā)明的細(xì)菌本發(fā)明的細(xì)菌為具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，并且經(jīng)過了修飾使得YdjN蛋白質(zhì)活 性降低的屬于腸桿菌科的細(xì)菌。本發(fā)明細(xì)菌優(yōu)選的方式為，經(jīng)過了修飾使得上述蛋白質(zhì)以 及FliY蛋白質(zhì)的活性降低的細(xì)菌。YdjN蛋白質(zhì)以及FliY蛋白質(zhì)是由fliY以及ydjN基因 編碼的。所述蛋白質(zhì)以及基因?qū)⒃谝韵逻M(jìn)行詳述。L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力是指，當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌時，在培養(yǎng)基中或 者菌體內(nèi)生成L-半胱氨酸，并且積累達(dá)到可以從培養(yǎng)基中或者菌體中回收的水平的能力。 此外，具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌是指，與野生株或者親本株相比可以生產(chǎn)更多L-半 胱氨酸并使其在培養(yǎng)基中積累的細(xì)菌，優(yōu)選可以生產(chǎn)并在培養(yǎng)基中積累0. 3g/L以上，更優(yōu) 選為0. 4g/L，特別優(yōu)選為0. 5g/L以上的量的L-半胱氨酸的微生物。微生物生產(chǎn)的L-半胱氨酸在培養(yǎng)基中通過二硫鍵一部分轉(zhuǎn)化為L-胱氨酸。此外， 如下述一樣，有時L-半胱氨酸通過和培養(yǎng)基中含有的硫代硫酸反應(yīng)生成S-硫代半胱氨酸 (Szczepkowski T.W.，Nature，vol. 182(1958))。進(jìn)一步，細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)生成的L-半胱氨酸 有時還和細(xì)胞中存在的酮或醛，例如與丙酮酸縮合，以硫代半酮縮醇( S ★才*々一>， hemithioketal)為中間體生成噻唑烷(千r V 'J ” >，thiazolidine)衍生物(參考日本 專利第四92010)。這些噻唑烷衍生物以及硫代半酮縮醇有時作為平衡混合物存在。因此，L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，不僅限于在培養(yǎng)基中或者菌體內(nèi)積累L-半胱氨酸的能力，是指在培 養(yǎng)基中積累除L-半胱氨酸之外，還包括L-胱氨酸、其衍生物或前體，或者它們的混合物的 能力。作為所述L-半胱氨酸或L-胱氨酸的衍生物，可以列舉出，例如S-硫代半胱氨酸、噻 唑烷衍生物以及硫代半酮縮醇等。此外，作為L-半胱氨酸或L-胱氨酸的前體，可以列舉出 例如作為L-半胱氨酸的前體的0-乙酰絲氨酸。L-半胱氨酸或L-胱氨酸的前體中，也可以包括前體的衍生物，可以列舉出例如作 為0-乙酰絲氨酸的衍生物的N-乙酰絲氨酸。0-乙酰絲氨酸(0AQ為L-半胱氨酸生物合成的前體物質(zhì)。OAS為細(xì)菌、植物的代 謝物質(zhì)，通過絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)的酶反應(yīng)，通過L-絲氨酸的乙?；a(chǎn)生。OAS在細(xì) 胞內(nèi)還可以轉(zhuǎn)化為L-半胱氨酸。作為具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌，可以為天然具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的 細(xì)菌，但也可以是如下所述的細(xì)菌通過利用突變方法、重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾而具有了 L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌。而且，在本發(fā)明中的L-半胱氨酸，如果沒有特殊提及，是指 還原型L-半胱氨酸、L-胱氨酸、或者上述那樣的衍生物、或者它們的混合物。作為在本發(fā)明中使用的細(xì)菌，只要是具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌即可，沒有 特殊限制，可以是屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、歐文氏 菌屬、沙門氏菌屬、摩根氏菌屬等腸桿菌科的細(xì)菌。具體地說，可以使用按照NCBI (美國國 家生物技術(shù)信息中心，National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中記載 的分類屬于腸桿菌禾斗的細(xì)菌(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/Browser/wwwtax. cgiyyid = 91347)。作為用于修飾的腸桿菌科的親本株，其中優(yōu)選使用埃希氏菌屬細(xì)菌、腸 桿菌屬細(xì)菌、泛菌屬細(xì)菌、歐文氏菌屬、腸桿菌屬、或克雷伯氏菌屬。對于埃希氏菌屬細(xì)菌，沒有特別限制，具體而言，可以使用Neidhardt等的著 作(Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutantderivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/SecondEdition, American Society for Microbiology Press，Washington，D. C.)列出的細(xì)菌。在這些細(xì)菌中，例 如可列舉大腸桿菌。作為大腸桿菌，具體地可列舉源自原型野生型K12菌株的大腸桿菌 W3110(ATCC 27325)和大腸桿菌 MG1655 (ATCC 47076)。這些菌株可從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址12301 ParklawnDrive， Rockville, Maryland 20852 P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, UnitedStates of America)通過分售獲得。即，對每種菌株都給予了登錄號，可以使用這些號碼通過分售獲得 菌株(參考http://www.atcc. org/)。美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中列出了每種菌株 的對應(yīng)登錄號。腸桿菌屬細(xì)菌的實例可以列舉出成團(tuán)腸桿菌(Enterobacteragglomerans)和 產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等、泛菌屬細(xì)菌的實例可以列舉出Pantoea ananatis。而且，近年來，成團(tuán)腸桿菌根據(jù)其16S rRNA的堿基序列的解析，被重新分類為成 團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)或Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。在 本發(fā)明中，只要是被分類為腸桿菌科的細(xì)菌，無論是屬于腸桿菌屬或者泛菌屬中任一屬的 細(xì)菌均可。
特別地，泛菌屬細(xì)菌、歐文氏菌屬細(xì)菌和腸桿菌屬細(xì)菌是分類為Y-變形細(xì)菌 (γ -Proteobacteria)的細(xì)菌，它們在分類學(xué)上的親緣關(guān)系非常近(J GenAppl Microbiol 1997 Dec ;43 (6)355-361、International Journal of SystematicBacteriology, Oct. 1997，pl061-1067)。近年來，依據(jù)DNA-DNA雜交實驗等，屬于腸桿菌屬的細(xì)菌中，有些 1^^ j^SS lif (Pantoeaagglomerans) 5 Pantoea dispersa ^ (International Journal of SystematicBacteriology, July 1989 ;39 (3) · p. 337-345)。 此夕卜，屬 于歐文氏菌屬的細(xì)菌中，有些被重新分類為菠蘿泛菌(Pantoea ananas)、斯氏泛菌 (Pantoeastewartii) ( International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993 ；43(1). p. 162-173)。腸桿菌屬細(xì)菌的實例包括成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)和產(chǎn)氣腸桿 菌(Enterobacter aerogenes)。具體地，可以使用歐州專利申請公開952221號說明書示例 的菌株。作為腸桿菌屬的代表性菌株，可以列舉出成團(tuán)腸桿菌ATCC12287株。作為泛菌屬細(xì)菌的代表性菌株，可以列舉出Pantoea ananatis,斯氏泛菌 (Pantoea stewartii) 1 ^^1 lif (Pantoea citrea)。 1 Pantoea ananatis 具體地可以列舉出Pantoea ananatis AJ13355株、SC17株、以及SC17 (0)株。SC17株是 以作為低PH下能夠在含L-谷氨酸和碳源的培養(yǎng)基中增殖的菌株從靜R縣磐田市的土壤中 分離出來的菌株AJ13355(FERMBP-6614)為起始，作為粘液質(zhì)低生產(chǎn)突變株選擇出來的菌 株(美國專利第6，596，517號)。SC17(0)株是為了對Pantoea ananatis進(jìn)行基因破壞， 作為對λ Red基因產(chǎn)物具有抗性的菌株而構(gòu)建的菌株(W02008/075483)。SC17株已于平 成21年2月4日(2009年)保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心 (地址郵政編碼305-8566日本茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，并給予保藏號 FERM ABP-11091 ο此外，SC17(0)株已于2005年9月21日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物 保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika)地址為俄羅斯莫斯科(Russia, 117545Moscow, IDorozhny proezd. 1)，保藏號為 VKPMB-9246。Pantoea ananatis AJ13355株已于平成10年(1998年)2月19日保藏于通商產(chǎn)業(yè) 省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)名稱為獨立行政產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生 物保藏中心，地址郵政編碼305-8566日本茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏 號為FERM P-16644，并于平成11年(1999年)1月11日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國際保藏， 并給予保藏號FERM BP-6614。而且，該菌株在分離時被鑒定為成團(tuán)腸桿菌(EntercAacter agglomerans)，并當(dāng)作成團(tuán)腸桿菌AJ13355進(jìn)行了保藏。但是，近年來，基于16S r RNA核苷 酸序列分析等，其被重新分類為Pantoea ananatis。作為歐文氏菌屬細(xì)菌，可以列舉出解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)、胡蘿卜 軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)；作為克雷伯氏菌屬細(xì)菌，可以列舉出植生克雷伯氏 菌(Klebsiella planticola)0(L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的賦予或增強(qiáng))下面，對于給屬于腸桿菌科的細(xì)菌賦予L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的方法，或增強(qiáng)這些 細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的方法進(jìn)行描述。為了給細(xì)菌賦予L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，可以使用在棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌等氨基酸生產(chǎn)菌的選育中沿用至今的方法，如獲取營養(yǎng)缺陷突變株、類似物抗性菌 株或代謝調(diào)節(jié)突變株，創(chuàng)建L-半胱氨酸生物合成系統(tǒng)酶表達(dá)增強(qiáng)的重組菌株等等(參見 《7 S 7酸発酵》，(株)學(xué)會出版中心，1986年5月30日第一版發(fā)行，第77-100頁)。這 里，在L-半胱氨酸生產(chǎn)菌的選育中，被賦予的營養(yǎng)缺陷性、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變等 性質(zhì)可以是單獨一種，也可以是兩種或者三種以上。此外，表達(dá)被增強(qiáng)的L-半胱氨酸生物 合成系統(tǒng)酶可以是單獨一種，也可以是兩種或三種以上。另外，可以將營養(yǎng)缺陷突變、類似 物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變等性質(zhì)的賦予與生物合成系統(tǒng)酶的增強(qiáng)組合進(jìn)行。具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的營養(yǎng)缺陷突變體菌株、L-半胱氨酸類似物抗性菌株 或代謝調(diào)節(jié)突變株可如下獲得對親本菌株或野生型菌株施以常規(guī)突變處理，即X-射線或 UV照射或用誘變劑例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等 處理；其后，從所得的突變株中選擇顯示營養(yǎng)缺陷性、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變并且還具 有L-氨基酸生產(chǎn)能力的菌株。通過增強(qiáng)L-半胱氨酸生物合成途徑的酶，或，與生成L-絲氨酸等作為該途徑的基 質(zhì)的化合物相關(guān)的酶，例如，3-磷酸甘油酸脫氫酶或絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶等的活性，可以提高 細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力。3-磷酸甘油酸脫氫酶受到絲氨酸的反饋抑制，但通過使細(xì)菌 攜帶有編碼該反饋抑制被降低或解除了的突變型3-磷酸甘油酸脫氫酶的突變型serA基 因，可以增強(qiáng)該酶的活性。此外，絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶受到L-半胱氨酸的反饋抑制。因此，通過使細(xì)菌攜帶有 編碼該反饋抑制被降低或解除了的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的突變型cysE基因，可以增強(qiáng)該酶 的活性。此外，通過增強(qiáng)硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)的活性，也可以提高L-半胱氨酸 的生產(chǎn)能力。硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)的蛋白質(zhì)群由cysPTWAM基因簇編碼(特開 2005-137369 號公報，EP1528108 號說明書)。此外，通過提高yeaS基因(歐洲專利申請公開第1016710號說明書)的表達(dá)，也 可以提高細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力。yeaS基因的堿基序列以及該基因編碼的氨基酸序 列如SEQ ID NO: 15以及16所示。在細(xì)菌中，除ATG之外，還已知GTG等多種密碼子可以作 為起女臺密石馬子使用(http //depts. Washington, edu/agro/genomes/students/stanstart. htm)。在SEQ IDNO :15以及16中，與最初的密碼子gtg相當(dāng)?shù)陌被岜碛洖閂al，但實際 上為Met的可能性較高。具體來說，L-半胱氨酸生產(chǎn)菌的實例可以列舉出、但不限于下述屬于埃希氏菌屬 的菌株，如用編碼反饋抑制抗性的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)的多種cysE等位基因轉(zhuǎn)化的大 腸桿菌JM15 (美國專利第6，218，168號)；具有編碼適于向細(xì)胞分泌有毒物質(zhì)的蛋白質(zhì)的 過表達(dá)基因的大腸桿菌W3110(美國專利第5，972，663號)；半胱氨酸脫巰基酶(cysteine desulfohydrase)活性減少的大腸桿菌菌株(特開平11-155571號公報)；由cysB基因編 碼的半胱氨酸調(diào)節(jié)子的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性增強(qiáng)的大腸桿菌W3110(W001/27307)等。在大腸桿菌中，作為具有分泌L-半胱氨酸活性的公知的蛋白質(zhì)，已知有如上所述 的由ydeD編碼的蛋白質(zhì)(特開2002-233384)、由yfiK編碼的蛋白質(zhì)(特開2004-49237)、 由 emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、cusA 各基因編碼的蛋白質(zhì)(特開平 2005-287333)。也 可以增強(qiáng)所述L-半胱氨酸分泌蛋白質(zhì)的活性。
下面，作為賦予L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的方法，對增強(qiáng)L-半胱氨酸生物合成酶活性 的方法進(jìn)行說明。作為L-半胱氨酸生物合成酶，可以列舉出例如，絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)。在屬于 腸桿菌科的細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)SAT活性，可以通過增加編碼SAT基因的拷貝數(shù)、或者通過修 飾編碼SAT的基因的啟動子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列來實現(xiàn)。例如，將編碼SAT的基因片段，與在屬 于腸桿菌科的細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體、優(yōu)選多拷貝型載體連接制作重組DNA，并將其導(dǎo)入到 屬于腸桿菌科的宿主細(xì)菌中來進(jìn)行轉(zhuǎn)化即可。下面，對強(qiáng)化SAT基因的表達(dá)的方法進(jìn)行說明。對于其他的L-半胱氨酸生物合成 系統(tǒng)酶基因，以及具有所述yeaS基因以及具有半胱氨酸分泌活性的蛋白質(zhì)的基因，也可以 適用相同的方法。就使SAT基因的表達(dá)增強(qiáng)的修飾而言，例如，可以利用基因重組技術(shù)，通過提高細(xì) 胞內(nèi)的SAT基因的拷貝數(shù)來進(jìn)行。例如，將含有SAT基因的DNA片段，與在宿主細(xì)菌內(nèi)發(fā)揮 功能的載體，優(yōu)選多拷貝型載體連接從而制成重組DNA，并將其導(dǎo)入細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化即可。例如，大腸桿菌的SAT基因可以通過下述方法獲得使用基于SEQ IDNO 9的堿基 序列制作的引物，以大腸桿菌的染色體DNA為模板，通過PCR方法獲得SAT基因。其他細(xì)菌 的SAT基因也可以利用基于所述序列信息制作的探針，通過雜交方法，從細(xì)菌的染色體DNA 或染色體DNA文庫中獲取。提高SAT基因的拷貝數(shù)，可以通過使SAT基因在細(xì)菌的染色體DNA上多拷貝地存 在而實現(xiàn)。為了向細(xì)菌的染色體DNA上多拷貝地導(dǎo)入SAT基因，利用在染色體DNA上多拷 貝存在的序列作為靶標(biāo)，通過同源重組來進(jìn)行。作為在染色體DNA上多拷貝存在的序列，可 以利用重復(fù)DNA (i^petitive DNA)、存在于轉(zhuǎn)座元件的端部的反向重復(fù)序列等?；蛘?，與特 開平2-109985號公報中所公開的內(nèi)容一樣，可以將SAT基因搭載于轉(zhuǎn)座子上并將其轉(zhuǎn)移， 在染色體DNA上多拷貝地導(dǎo)入。另外，就SAT基因表達(dá)的增強(qiáng)而言，除了上述基因拷貝數(shù)的擴(kuò)增之外，如在國際公 開00/18935號小冊子中記載的一樣，可以通過下述方法來實現(xiàn)將染色體DNA上或者質(zhì)粒 上的SAT基因的啟動子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列替換成強(qiáng)啟動子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列，或者擴(kuò)增使SAT 表達(dá)增強(qiáng)的調(diào)節(jié)子，或者缺失或者弱化使SAT的表達(dá)降低的調(diào)節(jié)子。作為強(qiáng)啟動子，已知 的有例如Iac啟動子、trp啟動子、trc啟動子等。此外，通過向SAT基因的啟動子領(lǐng)域內(nèi) 導(dǎo)入堿基取代等，還可以修飾得到更強(qiáng)的啟動子。通過這些啟動子取代或者修飾可以強(qiáng) 化SAT基因的表達(dá)。啟動子強(qiáng)度的評價方法和強(qiáng)啟動子的例子記載于Goldstein和Doi 的論文(Goldstein, Μ. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryoticpromoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.，1，105-128)等中。而且，對表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾也可以與提高SAT 基因拷貝數(shù)的方法進(jìn)行組合。此外為了提高SAT蛋白質(zhì)的生成，也可以在SAT基因的翻譯 起始點附近導(dǎo)入突變從而提高翻譯效率，也可以將其與增強(qiáng)SAT基因的表達(dá)相組合。對于SAT基因表達(dá)的提高，以及SAT蛋白質(zhì)含量增加的確認(rèn)，可以按照與后述的對 目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄量的降低，以及對目標(biāo)蛋白質(zhì)含量的降低的確認(rèn)相同地，通過mRNA的定量， 以及使用抗體的蛋白質(zhì)印跡(Western blot)來進(jìn)行。SAT基因可以任選埃希氏菌屬細(xì)菌來源的基因以及其他生物來源的基因使用。作 為編碼大腸桿菌的SAT的基因，從野生株以及L-半胱氨酸分泌突變株中克隆了 cysE，從而得知其堿基序列(Denk, D. and Boeck, Α.，J. General Microbiol.，133，515-525 (1987))。 上述堿基序列以及該堿基序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO :9以及10所示。使用基于 該基因序列制成的引物，以埃希氏菌屬細(xì)菌的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR，可以獲得SAT基 因(參考特開平11-155571號)。其他生物的編碼SAT的基因也可以同樣地獲得。通過上 述方法得到的SAT基因，也可以像上述cysE基因那樣進(jìn)行表達(dá)增強(qiáng)。而且，當(dāng)在SAT基因的表達(dá)中存在“L-半胱氨酸反饋抑制”等抑制機(jī)理時，通過修 飾表達(dá)調(diào)節(jié)序列或與抑制相關(guān)的基因從而使該抑制機(jī)制變?yōu)榉敲舾行缘?，也可以增?qiáng)SAT 基因的表達(dá)。例如，通過在屬于腸桿菌科的細(xì)菌中攜帶降低或解除了 L-半胱氨酸反饋抑制的 SAT(下面，也稱為“突變型SAT”)，可以使SAT活性升高。作為突變型SAT，可以列舉出具 有下述突變的SAT 用賴氨酸殘基以及亮氨酸殘基以外的氨基酸殘基取代相當(dāng)于野生型 SAT (SEQ ID NO 10)的第256位的甲硫氨酸殘基的氨基酸殘基的突變，或者從相當(dāng)于第256 位的甲硫氨酸殘基開始缺失C末端側(cè)的區(qū)域的突變。作為所述賴氨酸殘基以及亮氨酸殘基 以外的氨基酸殘基，可以列舉出，在通常構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中，除甲硫氨酸殘基、賴氨酸 殘基以及亮氨酸殘基以外的17種氨基酸殘基?？梢粤信e出更優(yōu)選為異亮氨酸殘基或者谷 氨酸殘基。作為向野生型SAT基因中導(dǎo)入所期望的突變的方法，可以列舉出定點突變。作 為突變型SAT基因，已知編碼大腸桿菌的突變型SAT的突變型cysE (參考WO 97/15673號 國際公開小冊子、特開平11-155571號)。攜帶了含有編碼由谷氨酸殘基取代第256位的甲 硫氨酸殘基的突變型SAT的突變型cysE的質(zhì)粒pCEM256E的大腸桿菌JM39-8菌株(大腸 桿菌JM39-8(pCEM256E)、內(nèi)部編號AJ13391)，已經(jīng)于平成9年(1997年)11月20日保藏于 工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305日本茨城縣筑波市東1 丁目1番地3 號)，保藏號為FERMP-16527，并于2002年7月8日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國際保藏，并 給予保藏號FERM BP-8112。在本發(fā)明中，“對L-半胱氨酸的反饋抑制為非敏感性”既可以指如上所述的通過 修飾而使得對L-半胱氨酸的反饋抑制變?yōu)榉敲舾行?，也可以指原本就不受反饋抑制。?知擬南芥(Arabidopsis thaliana)的SAT為不受L-半胱氨酸反饋抑制，在本發(fā)明中優(yōu)選 使用。作為含有擬南芥來源的SAT基因的質(zhì)粒，已知的有pEAS-m(FEMS Microbiol. Lett.， 179(1999)453-459)。此外，通過增強(qiáng)編碼硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)蛋白質(zhì)群的cysPTWAM基因簇的 表達(dá)，也可以提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力(特開2005-137369號公報、EP1528108號說明 書)。此外，硫化物通過分別由cysK以及cysM基因編碼的0_乙酰絲氨酸(巰基)-裂 解酶-A或者B催化的反應(yīng)而被導(dǎo)入0-乙酰基-L-絲氨酸，從而產(chǎn)生L-半胱氨酸。因此， 通過增強(qiáng)編碼所述酶的基因的表達(dá)也可以提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。此外，通過抑制L-半胱氨酸分解系統(tǒng)，可以提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。抑 制L-半胱氨酸分解系統(tǒng)是指，細(xì)胞內(nèi)的L-半胱氨酸的分解活性與野生株或者親本 株等非修飾株相比有降低。作為承擔(dān)L-半胱氨酸分解系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，已知的有胱硫 醚- β -裂解酶(metC 產(chǎn)物、特開平 11-155571 號，Chandraet. al.，Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)、色氨酸酶(tnaA 產(chǎn)物、特開 2003-169668，(Austin Newton et. al.，J.Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218) )、0-乙酰絲氨酸巰基水解酶B (cysM基因產(chǎn)物、特開 2005-245311)、以及malY基因產(chǎn)物(特開2005-245311)。通過使所述蛋白質(zhì)的活性降低， 從而提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。使蛋白質(zhì)活性降低的修飾，可以像后述的針對fliY或ydjN基因所記載的方法一 樣來進(jìn)行。大腸桿菌的cysM基因的堿基序列以及該基因編碼的氨基酸序列，分別如SEQ ID NO 25以及26所示。(YdjN蛋白質(zhì)以及FliY蛋白質(zhì)活性的降低)本發(fā)明的細(xì)菌，如上所述為具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的屬于腸桿菌科的細(xì)菌，其 可以這樣獲得通過修飾從而使YdjN蛋白質(zhì)、或YdjN蛋白質(zhì)以及FliY蛋白質(zhì)的活性降低。 而且，也可以是在進(jìn)行了修飾使得YdjN蛋白質(zhì)、或YdjN蛋白質(zhì)以及FliY蛋白質(zhì)的活性降 低之后，再賦予其L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。YdjN蛋白質(zhì)以及FliY蛋白質(zhì)分別為由yjdN基 因以及fliY基因編碼的蛋白質(zhì)。為了使YdjN蛋白質(zhì)以及FliY蛋白質(zhì)的活性降低，可以通 過如下方法實現(xiàn)，例如，修飾具有fliY基因以及ydjN基因的細(xì)菌，從而使所述基因編碼的 FliY以及YdjN的活性降低。而且，在為了提高L-半胱氨酸生產(chǎn)能力而使活性降低時，可以 是使FliY或YdjN中的任一方活性降低，但優(yōu)選使YdjN的活性降低，更為優(yōu)選使兩方活性 均降低。在本發(fā)明中，對活性的“降低，，沒有特殊限制，其包含修飾株的活性比野生株或者 非修飾株低，以及活性完全消失這兩個方面。本發(fā)明者從Pantoea ananatis的染色體DNA中，發(fā)現(xiàn)了編碼其缺損可以使L-半 胱氨酸生產(chǎn)能力提高的蛋白質(zhì)的新基因，由于它們分別顯示了和大腸桿菌的fliY、ydjN的 較高的同源性(分別是78%、80% )，因此將它們分別命名為fliY和ydjN。而且，在本說明 書中，“同源性(homoloyg)”有些情況下是指“同一性(identity)”。在本發(fā)明中，有時將大腸桿菌的fliY、ydjN基因和Pantoea ananatis的fliY、 ydjN基因，以及其他細(xì)菌攜帶的所述基因的同源基因分別命名為fliY、ydjN基因。作為fliY基因的具體實例，可以列舉出含有SEQ ID NO :5、7所示的堿基序列的基 因。此外，作為ydjN基因的具體實例，可以列舉出含有SEQ IDNO :1、3所示的堿基序列的基 因。SEQ ID NO :5表示的是大腸桿菌MG1655菌株的fliY基因，SEQ IDNO :6表示的是 該基因編碼的氨基酸序列。此外，SEQ ID NO :7表示的是Pantoea ananatisSC17菌株的 fliY基因，SEQ ID NO :8表示的是該基因編碼的氨基酸序列。SEQ ID NO :1表示的是大腸桿菌MG1655菌株的ydjN基因的堿基序列，SEQ ID NO: 2表示的是該基因編碼的氨基酸序。此外，SEQ ID NO :3表示的是Pantoea ananatis SC17 菌株的ydjN基因的堿基序列，SEQ ID NO :4表示的是該基因編碼的氨基酸序列。FliY蛋白質(zhì)以及YdjN蛋白質(zhì)并不僅限于具有上述氨基酸序列的蛋白質(zhì)以及它們 的同源物，也可以是它們的變體(variant)。fliY或ydjN基因也可以是編碼FliY蛋白質(zhì) 或YdjN蛋白質(zhì)的變體的基因。FliY蛋白質(zhì)以及YdjN蛋白質(zhì)的變體是指具有在SEQ ID N0 2、4、6或8的氨基酸序列中，在1個或者數(shù)個位置上具有1個或數(shù)個氨基酸取代、缺失、插入 或添加1個或數(shù)個氨基酸而得到的氨基酸序列，且其具有FliY蛋白質(zhì)或YdjN蛋白質(zhì)的功能的蛋白質(zhì)。而且上述“1個或數(shù)個”根據(jù)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中的位置或者氨 基酸殘基的種類有所不同，但具體來說優(yōu)選為1 20個、更優(yōu)選為1 10個，更為優(yōu)選為 1 5個。ydjN基因缺損株如后述實施例所示，其S-硫代半胱氨酸以及L-胱氨酸的攝入降 低。因此，推測YdjN蛋白質(zhì)具有與S-硫代半胱氨酸以及L-胱氨酸的攝入有關(guān)的功能。另一方面，盡管有文獻(xiàn)指出FliY可能與L-胱氨酸的攝入相關(guān)(Butler etal., Life Sci. 52. 1209-1215(1993)，Hosie et al. , Res. Microbiol. 152. 259-270 (2001)),{0 如實施例所示的一樣，無論其與L-胱氨酸的攝入相關(guān)，或不相關(guān)，均可以推測與YdjN相比 其活性較低?？傊箉djN基因和fliY基因兩方均缺損，與使各個基因單獨缺損的情況相 比，顯著地提高了 L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。因此，雖然FliY的功能仍不明確，但其具有下 述特征使其缺損時，能夠提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。上述的1個或數(shù)個氨基酸的取代、缺失、插入或者添加為可以正常維持蛋白質(zhì)的 功能的保守突變。保守突變的代表為保守取代。保守取代是指，當(dāng)取代部位為芳香族氨基 酸時，在Wie、Trp、Tyr之間相互取代；當(dāng)取代部位為疏水性氨基酸時，在Leu、lie、Val間 之間相互取代；當(dāng)為極性氨基酸時，在Gin、Asn之間相互取代；當(dāng)為堿性氨基酸時，在Lys、 Arg, His之間相互取代；當(dāng)為酸性氨基酸時，在Asp、Glu之間相互取代；當(dāng)為具有羥基的 氨基酸時，為在義！·、!!!!·之間相互取代的突變。可視為保守取代的取代具體的可以列舉出， 用 Ser 或 Thr 取代 Ala、用 GlruHis 或 Lys 取代 Arg、用 Glu、Gln、Lys、His 或 Asp 取代 Asn、 用 AsruGlu 或 Gln 取代 Asp、用 Ser 或 Ala 取代 Cys、用 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gin、用 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu、用 Pro 取代 Gly、用 Asn、Lys、Gln、Arg 或 Tyr 取 代 His、用 Leu、Met、Val 或 Phe 的取代 lie、用 lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu、用 Asn、Glu、 GlruHis 或 Arg 取代 Lys、用 lie、Leu、Val 或 Wie 取代 Met、用 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu 取 代Wie、用Thr或Ala取代kr、用Ser或Ala的取代Hir、用Phe或Tyr的取代 ρ、用His、 Phe或Trp取代Tyr、以及用Met、Ile或Leu的取代Val。此外，就上述這樣的氨基酸的取 代、缺失、插入、添加或者倒位等而言，還包括因基因來源的細(xì)菌的個體差異、種間差異等情 況而天然發(fā)生的突變(mutant或variant)而產(chǎn)生的那些取代、缺失、插入、添加或者倒位。此外，也可以為編碼下述蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)與具有上述這樣的保守突變的 基因編碼的氨基酸序列全體相比，具有80%以上的同源性，優(yōu)選具有90%以上、更優(yōu)選具 有95%以上、更為優(yōu)選具有97%以上、特別優(yōu)選具有99%以上的同源性。編碼這樣的與 FliY、YdjN具有同源性的蛋白質(zhì)的基因，可以以上述大腸桿菌株野生型fliY、ydjN基因作 為提問序列，使用BLAST檢索或FASTA檢索，從公開的數(shù)據(jù)庫中容易地獲取其序列信息，并 通過使用基于該公知的基因序列作成的寡核苷酸作為引物來獲得。此外，只要是fliY、YdjN基因編碼的蛋白質(zhì)的功能沒有損壞即可，還可以是與上 述堿基序列的互補(bǔ)序列、或者能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交的基因。在 本發(fā)明中，嚴(yán)格的條件下是指，例如在60°C，1XSSC，0. 1% SDS優(yōu)選0. 1XSSC，0. 1% SDS相 當(dāng)?shù)柠}濃度下，洗滌1次優(yōu)選2 3次。上述雜交用探針也可以為基因的互補(bǔ)序列的一部分。這樣的探針，可以以基于公 知的基因序列制得的寡核苷酸為引物，以包含這樣的堿基序列的DNA片段為模板，通過PCR 反應(yīng)來制備。例如，當(dāng)作為探針使用300bp左右長度的DNA片段時，上述雜交的洗滌條件可以列舉出為 50°C、2XSSC、0. 1% SDS0下面，針對使FliY或YdjN蛋白質(zhì)活性降低的方法進(jìn)行說明。承擔(dān)所述L-半胱氨 酸分解系統(tǒng)的蛋白質(zhì)等，也可以通過同樣的方法使其活性降低。以下，將使其活性降低的對 象蛋白質(zhì)記為“目標(biāo)蛋白質(zhì)”，編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因記為“目標(biāo)基因”。使目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性降低的修飾例如可以通過降低目標(biāo)基因的表達(dá)來實現(xiàn)。具體 來說例如，通過使染色體上的目標(biāo)基因的編碼區(qū)域的一部分或全部缺損，可以降低所述蛋 白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)的活性。此外，通過修飾目標(biāo)基因的啟動子或shine-dalgarno(SD)序列等表 達(dá)調(diào)節(jié)序列等，也可以降低目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性。此外，對表達(dá)調(diào)節(jié)序列以外的非翻譯區(qū)的 修飾也可以降低基因的表達(dá)量。而且，還可以缺失包括染色體上的基因的前后序列的整個 基因全體。此外，所述修飾還可以這樣完成向染色體上的目標(biāo)基因的編碼區(qū)域?qū)氚被?酸取代(錯意突變)、或者導(dǎo)入終止密碼子(無義突變)、或者導(dǎo)入添加或缺失一 二個堿 基的移碼突變(Journal of Biological Chemistry272 :8611-8617 (1997) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 955511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991))。此外，強(qiáng)化負(fù)向調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)子的活性，或 者抑制正向調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)子的活性也可以使目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性降低。添加負(fù)向調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白質(zhì) 的活性或表達(dá)的物質(zhì)、除去正向調(diào)節(jié)物質(zhì)也可以使目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性降低。此外，只要是可以使目的蛋白質(zhì)的活性降低的修飾即可，也可以是通過X射線或 紫外線照射、或者利用N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍等突變劑進(jìn)行的常規(guī)突變處理而引 起的修飾。就表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾而言，優(yōu)選為1個堿基以上，更優(yōu)選為2個堿基以上，特別 優(yōu)選為3個堿基以上。此外，在缺失編碼區(qū)域時，只要目標(biāo)蛋白質(zhì)的功能降低即可，缺失的 區(qū)域可以是N末端區(qū)域、內(nèi)部區(qū)域、C末端區(qū)域中的任何區(qū)域，也可以是整個編碼區(qū)域。通 常，缺失的區(qū)域較長能夠切實地使基因失活。此外，優(yōu)選的是缺失區(qū)域的上游或下游的讀碼 框不一致。在目標(biāo)基因的編碼區(qū)域中插入其他序列時，可以為基因的任何區(qū)域，但插入的序 列較長時能夠切實地使基因失活。插入部位的前后序列優(yōu)選讀碼框不一致。對于其他序列 沒有特殊限制，只要是能夠降低編碼的目的蛋白質(zhì)的功能即可，可以列舉例如攜帶抗生素 抗性基因或?qū)-半胱氨酸生產(chǎn)有用的基因的轉(zhuǎn)座子等。為了如上所述地修飾染色體上的目標(biāo)基因，可以通過下述方法實現(xiàn)例如，缺 失基因的部分序列，制作經(jīng)過了修飾使得不產(chǎn)生發(fā)揮正常功能的目標(biāo)蛋白質(zhì)的缺失型基 因，用含有該基因的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌，通過引起缺失型基因和染色體上的基因進(jìn)行同源重 組，將染色體上的基因取代為缺失型基因。即使產(chǎn)生由缺失型基因編碼的目標(biāo)蛋白質(zhì)，其 也具有與野生型蛋白質(zhì)不同的立體結(jié)構(gòu)，降低了其功能。已經(jīng)明確了利用這樣的同源重 組通過基因取代破壞基因的被稱為“Red驅(qū)動整合(Red-driven integration)"的方法 (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640-6645 (2000))、組合 使用Red驅(qū)動整合法與λ噬菌體來源的切出系統(tǒng)(Cho，Ε. H.，Gumport, R. I.，Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184 :5200-5203(2002))的方法(參照 W02005/010175 號)等使用線性 DNA的方法，或者使用含有溫度敏感性復(fù)制起點的質(zhì)粒、可接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法，利用在 宿主內(nèi)不含復(fù)制起點的自殺載體的方法等(美國專利第6303383號，或特開平05-007491號)。對于目的基因的轉(zhuǎn)錄量的降低而言，可以通過將由該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量與野 生株或者非修飾株相比較來進(jìn)行確認(rèn)。作為評價mRNA的量的方法，可以列舉出Northern 雜交、RT-PCR 等(Sambrook, J. , et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring HarborLaboratory Press, Cold spring Harbor(USA),2001)。使用抗體的蛋白質(zhì)印跡(Western blot)可以對目標(biāo)蛋白質(zhì)的量的降低進(jìn)行確認(rèn) (Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, ColdspringHarbor(USA), 2001))。另外，目標(biāo)蛋白質(zhì)為YdjN蛋白質(zhì)時，對于該蛋白質(zhì)的量的降低的確認(rèn)，可以通過 測定細(xì)胞的S-硫代半胱氨酸或L-胱氨酸攝入活性來進(jìn)行。就蛋白質(zhì)是否具有上述化合物的攝入活性而言，可以通過下述方法確認(rèn)制作使 野生株或者親本株中編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)菌，并 對培養(yǎng)基中蓄積的L-半胱氨酸、L-胱氨酸、其衍生物或者前體、或者它們的混合物的量進(jìn) 行定量?；蛘撸瑥囊吧昊蛴H本株出發(fā)制作使編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)降低或缺損的細(xì) 菌，在含有S-硫代半胱氨酸或L-胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)菌時，通過培養(yǎng)基中添加的 這些化合物的減少量的變少來進(jìn)行確認(rèn)。具體實例如實施例所示。當(dāng)使用大腸桿菌的f IiY或ydjN基因作為f IiY或ydjN基因時，使用基于SEQ ID NO :5或1的堿基序列制作的引物，以大腸桿菌的染色體DNA為模板，通過PCR方法可以獲 得fliY或ydjN基因。同樣地，Pantoea ananatis的fliY或ydjN基因可以使用基于SEQ ID NO :7或3的堿基序列制作的引物，以Pantoea ananatis的染色體DNA為模板，通過PCR 方法來獲得。其他細(xì)菌的fliY或ydjN基因也可以使用基于上述序列信息制作的探針或引 物，通過雜交方法或PCR方法，從細(xì)菌的染色體DNA或染色體DNA文庫中獲得。另一方面，為了確認(rèn)FliY或YdjN蛋白質(zhì)是否具有攝入S-硫代半胱氨酸、L-胱氨 酸、或L-半胱氨酸的活性，在必須提高fliY或ydjN基因的表達(dá)量的情況下，只要將所述基 因多拷貝地導(dǎo)入細(xì)菌中即可。向細(xì)菌中多拷貝地導(dǎo)入fliY、ydjN基因時，可以適用像針對 于SAT基因所記載的方法一樣的使用多拷貝型載體的方法，或通過同源重組向染色體DNA 上多拷貝地導(dǎo)入的方法等。〈本發(fā)明的L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前體、或它們的混合物 的生產(chǎn)方法>在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述獲得的本發(fā)明的細(xì)菌，通過從培養(yǎng)基中采集L-半胱氨 酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前體、或它們的混合物，可以生產(chǎn)所述化合物。作為 L-半胱氨酸的衍生物，如上述的一樣，可以列舉出S-硫代半胱氨酸、噻唑烷衍生物、與該噻 唑烷衍生物相當(dāng)?shù)牧虼胪s醇等。作為使用的培養(yǎng)基，可以列舉出含有碳源、氮源、硫源、無機(jī)離子以及需要的其他 有機(jī)成分的通常的培養(yǎng)基。作為碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉水解物等糖類、富馬酸、檸檬 酸、琥珀酸等有機(jī)酸類。作為氮源，可以使用硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等無機(jī)銨鹽、大豆水解物等有機(jī)氮、氨 氣、氨水等。
作為硫源，可以列舉出硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫化物、連二亞硫酸鹽(hyposulfite)、 硫代硫酸鹽等無機(jī)硫化物。作為有機(jī)微量營養(yǎng)源，優(yōu)選適量含有維生素Bl等必需物質(zhì)或者酵母提取物等。除 此之外，根據(jù)需要可以少量添加磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。培養(yǎng)在需氧的條件下進(jìn)行30 90小時較好，培養(yǎng)溫度為25°C 37°C，且優(yōu)選將 培養(yǎng)中的PH控制在5 8的范圍內(nèi)。此外，可以使用無機(jī)或者有機(jī)的酸性或者堿性物質(zhì)， 以及氨氣等來調(diào)節(jié)PH值。就從培養(yǎng)物中采集L-半胱氨酸而言，可以通過組合通常的離子 交換樹脂法、沉淀法及其他公知的方法來實施。通過上述方法得到的L-半胱氨酸，可以用來生產(chǎn)L-半胱氨酸的衍生物。作為L-半 胱氨酸的衍生物包含甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸(carbocysteine)^^ 代半胱氨酸、乙酰半胱氨酸等。此外，當(dāng)L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培養(yǎng)基中積累時，從培養(yǎng)基中采集噻唑烷 衍生物，使得噻唑烷衍生物和L-半胱氨酸之間的反應(yīng)平衡向L-半胱氨酸一側(cè)移動，從而可 以生產(chǎn)L-半胱氨酸。此外，當(dāng)S-硫代半胱氨酸在培養(yǎng)基中積累時，例如可以使用二硫蘇糖 醇等還原劑通過進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化得到L-半胱氨酸。本發(fā)明中采集出的L-半胱氨酸或其衍生物除了含有作為目標(biāo)的化合物之外，還 可以含有微生物菌體、培養(yǎng)基成分、水分以及微生物的代謝副產(chǎn)物等。采集的目的化合物的 純度為50%以上，優(yōu)選為85%以上，特別優(yōu)選為95%以上。
實施例以下，通過實施例針對本發(fā)明的進(jìn)行更具體的說明。在下面所述的內(nèi)容中，半胱氨酸以及胱氨酸為L-型。(實施例1)鑒定具有半胱氨酸或胱氨酸攝入活性的蛋白質(zhì)(1)獲得不能利用S-硫代半胱氨酸作為單一半胱氨酸源的突變株(1-1)由 大腸桿菌MG1655株(ATCC No. 47076)獲得cysE基因缺損株cysE基因的缺損通過 Datsenko和Wanner等人開發(fā)的被稱為“Red驅(qū)動整合”的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12，p6640_6645)和 λ 噬菌體來源的切出系統(tǒng)(J. Bacteriol. 2000 184. 5200-5203(2002))來進(jìn)行。通過Red驅(qū)動整合，使用合成寡核苷酸作為引物得到PCR 產(chǎn)物，使用該P(yáng)CR產(chǎn)物能夠一步式地構(gòu)建基因破壞菌株，所述合成寡核苷酸的5'側(cè)設(shè)計 有目的基因的一部分，3'側(cè)設(shè)計有抗生物素抗性基因的一部分。另外通過組合λ噬菌體 來源的切出系統(tǒng)，可以除去在基因破壞菌株中導(dǎo)入的抗生物素抗性基因。通過這樣的Red 驅(qū)動整合和λ噬菌體來源的切出系統(tǒng)使大腸桿菌基因缺損的方法在特開2005-058227Α和 W02007/119880A1等中有詳細(xì)描述。使用與這樣的方法相同的方法，也可以獲得cysE基因 的缺損株。通過PCR方法獲得了在cysE基因的兩端的同源序列中插入了抗生物素抗性 基因(卡那霉素抗性基因(Knf))的DNA片段。除了使用DcysE (Ec) -F (ccggcccgcg cagaacgggc cggtcattat ctcatcgtgt ggagtaagcatgaagcctgc ttttttatac taagttggca SEQ ID NO 50)、DcysE (Ec)-R(actgtaggccggatagatga ttacatcgca tccggcacga tcacaggaca cgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga :SEQ ID NO :51)作為弓| 物，使用P^l 18-(λ BttL-Kmr- λ attR) (W02006/093322A2)作為模板以外，具體的實驗方法和實 驗材料，全部按照在特開2005-058227A1中記載的方法進(jìn)行。將獲得的缺損株命名為 MG1655AcysE。(1-2)由MG1655 Δ cysE菌株制作轉(zhuǎn)座子突變株的文庫使用EZ-Tn5<KAN-2>Tnp Transposome 試劑盒(EPICENTRE 公司)，由 MG1655 Δ cysE 菌株制得將Tn5隨機(jī)插入的突變株的文庫。根據(jù)試劑盒產(chǎn)品中附帶的說明書實施具體的實 驗方法。(1-3)從突變株文庫中篩選不能以S-硫代半胱氨酸作為單一半胱氨酸源加以利 用的突變株利用上述文庫，對不能以S-硫代半胱氨酸作為單一半胱氨酸源加以利用的突變 株進(jìn)行篩選。在此“半胱氨酸源”是指被攝入到細(xì)胞內(nèi)并用于生成半胱氨酸的基質(zhì)。在細(xì) 胞內(nèi)不能合成半胱氨酸時，半胱氨酸本身也屬于半胱氨酸源。在含有20 μ M半胱氨酸的Μ9 瓊月旨培養(yǎng)基(Sambrook and Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Third Edition)，Cold Spring HarborLaboratory Press)禾Π 含有 20 μ M S-硫代半胱氨酸 (cat#C2196, SIGMA)的M9瓊脂培養(yǎng)基上分別用牙簽接種突變株，篩選出在含有半胱氨酸的 培養(yǎng)基上可以生長繁育但在含有S-硫代半胱氨酸的培養(yǎng)基上不能生長繁育的突變株。從 約1000個菌株中，獲得了 1株突變株。對插入的Tn5的基因組區(qū)域進(jìn)行鑒定，結(jié)果可知在 ydjN基因中插入了 Tn5。(1-4) ydjN基因缺損株的S-硫代半胱氨酸同化能力的解析為了確認(rèn)插入Tn5的突變株的表型是否是因為ydjN基因的功能缺損，利用上 述的Red驅(qū)動整合由MG1655 Δ cysE菌株構(gòu)建了 ydjN基因的缺損株。此時使用引物 DydjN(Ec)-F(cactatgact gctacgcagt gatagaaata ataagatcaggagaacgggg tgaagcctgc ttttttatac taagttggca :SEQ ID NO :52)、DydjN(Ec)-R(aaagtaaggc aacggcccct atacaaaacg gaccgttgcc agcataagaacgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga :SEQ ID NO 53)。將構(gòu)建的缺損株命名為MG1655 AcysE Δ ydjN :: Km菌株，利用同樣的方法由MG1655 獲得了 MG1655 Δ ydjN Km 菌株。在含有50 μ M半胱氨酸、50 μ M胱氨酸或50 μ M S_硫代半胱氨酸的Μ9瓊脂培養(yǎng)基 (但是，在此使用等濃度MgCl2代替培養(yǎng)基成分中的MgSO4)上的生長繁育如表1所示。[表1]
權(quán)利要求
1.一種屬于腸桿菌科的細(xì)菌，其具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，并且經(jīng)過了修飾從而使得 YdjN蛋白質(zhì)的活性降低。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其中，所述YdjN蛋白質(zhì)為具有SEQIDNO :2或4的氨 基酸序列的蛋白質(zhì)或其變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌，其還經(jīng)過了修飾從而使得FliY蛋白質(zhì)的活性降低。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)菌，其中，所述FliY蛋白質(zhì)為具有SEQIDNO :6或8的氨 基酸序列的蛋白質(zhì)或其變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的細(xì)菌，其中，所述YdjN蛋白質(zhì)或FliY蛋白質(zhì)的 活性是通過降低編碼YdjN蛋白質(zhì)或FliY蛋白質(zhì)的ydjN基因或fliY基因的表達(dá)量，或者 破壞所述基因而降低的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)菌，其中，所述ydjN基因是下述(a) (c)中的任一種DNA (a)含有SEQID NO :1或3的堿基序列的DNA，(b)與SEQID NO :1或3的堿基序列的互補(bǔ)序列或能夠由所述堿基序列制備的探針在 嚴(yán)格條件下雜交的DNA，(c)與SEQID NO :1或3的堿基序列具有95%以上的同一性的DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的細(xì)菌，其中，所述fliY基因是下述(d) (f)中的任一 種 DNA (d)含有SEQID NO :5或7的堿基序列的DNA，(e)與SEQID NO :5或7的堿基序列的互補(bǔ)序列或能夠由所述堿基序列制備的探針在 嚴(yán)格條件下雜交的DNA，(f)與SEQID NO :5或7的堿基序列具有95%以上的同一性的DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項所述的細(xì)菌，其中，所述細(xì)菌還具有下述性質(zhì)中的至少 一種i)經(jīng)過修飾從而使得絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性提高， )經(jīng)過修飾從而使得yeaS基因的表達(dá)提高，iii)經(jīng)過修飾從而使得3-磷酸甘油酸脫氫酶活性提高，iv)經(jīng)過修飾從而使得硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)的活性增強(qiáng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項所述的細(xì)菌，其中，所述細(xì)菌為屬于泛菌屬的細(xì)菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)菌，其中，所述細(xì)菌為Pantoeaananatis。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項所述的細(xì)菌，其中，所述細(xì)菌為大腸桿菌。
12.—種L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前體、或者上述物質(zhì)的混合物 的生產(chǎn)方法，該方法中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1 11中任一項所述的細(xì)菌，并從所 述培養(yǎng)基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前體、或者上述物質(zhì)的混 合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的L-半胱氨酸生產(chǎn)方法，所述方法在L-半胱氨酸生產(chǎn)菌的選育中使用了在腸桿菌科細(xì)菌中承擔(dān)L-半胱氨酸攝入活性的基因。本發(fā)明還提供一種屬于腸桿菌科的細(xì)菌，其具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，并且經(jīng)過了修飾從而使得YdjN蛋白質(zhì)、或者YdjN蛋白質(zhì)和FliY蛋白質(zhì)的活性降低，并通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌，從該培養(yǎng)基中收集L-胱氨酸、其衍生物或前體、或者它們的混合物來制造這些化合物。
文檔編號C12P13/12GK102080062SQ20101013655
公開日2011年6月1日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月12日
發(fā)明者野中源 申請人:味之素株式會社