專利名稱：家蠶微孢子蟲極絲蛋白ptp3基因及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)現(xiàn)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種來自于家蠶微孢子蟲的繁殖和侵染有關(guān)的 重要蛋白PTP3基因。
背景技術(shù)：
微孢子蟲是普遍分布于自然界的細(xì)胞內(nèi)專性寄生原蟲，近150個(gè)屬1200余種，有著 極為廣泛的宿主，包括脊椎動物和無脊椎動物，是經(jīng)濟(jì)昆蟲、魚類、兔類、產(chǎn)毛動物、嚙 齒類及靈長類的致命病原。而家蠶微孢子蟲(7fow歷s ^歷Z^cis)，分類地位屬于原生動物 門，單絲孢子蟲亞門，微孢子蟲綱。由微孢子蟲寄生于經(jīng)濟(jì)昆蟲家蠶而引起嚴(yán)重的傳染性 微粒子病，且由于微孢子原蟲可以通過胚胎向下代傳播， 一直被養(yǎng)蠶國家和地區(qū)列為蠶業(yè) 生產(chǎn)法定檢疫對象。單就我國每年因帶毒種和微粒子病而帶來的直接經(jīng)濟(jì)損失即達(dá)上千萬 元以上。攻克微粒子病這一蠶絲業(yè)的頑癥，是蠶業(yè)界的重點(diǎn)和難點(diǎn)研究領(lǐng)域。
微粒子病是由微孢子蟲寄生宿主而引起的疾病。微孢子蟲以其獨(dú)特的侵染方式，廣泛 寄生并感染極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的昆蟲、魚類、嚙齒類、兔類、皮毛動物、靈長類以及家庭寵物 如狗和鳥，引發(fā)嚴(yán)重疾病甚至死亡，嚴(yán)重制約著世界蠶業(yè)生產(chǎn)和動物保育。甚至還能機(jī)會 性地感染艾滋病(HIV)患者、器官移植病人、服用免疫抑制劑藥物病人和先天性免疫機(jī) 能不健全者，引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和皮膚潰爛等惡性疾病，加劇病情，加速病人的死 亡。100多年來，盡管己使用了多種化學(xué)藥物進(jìn)行治療，如咪唑類、煙曲霉素、歌咪啶 堿、苯萊特、甲基托布津等等，但治療效果并不理想，至今仍未發(fā)現(xiàn)有治療微孢子蟲病的 特效藥物。
極管是家蠶微孢子蟲繁殖和侵染的重要器官，在家蠶微孢子蟲對家蠶的侵染中起著關(guān) 鍵性作用。極管長度一般在50 15(Vm，直徑一般在O. 1 0.2pm范圍。極管具有柔韌性， 在運(yùn)送孢原質(zhì)的過程中其管直徑可以增加到0.4pm，孢原質(zhì)運(yùn)送完畢后其長度會縮短5 10%。在家蠶微孢子蟲入侵過程中，極管在適當(dāng)剌激后迅速彈出并"刺入"家蠶細(xì)胞中， 同時(shí)將孢原質(zhì)注入其細(xì)胞質(zhì)，完成對家蠶的入侵。而其組成成分主要是蛋白，而極管蛋白 PTP1是它主要的組成部分。極管蛋白PTP1是一種伴刀豆球蛋白，是極管的主要蛋白，在 ￡力e^o歷中PTP1蛋白的含量占整個(gè)極管蛋白的70%。通過SDA-PAGE和銀染分析PTP1發(fā) 現(xiàn)，不同種類的微孢子蟲的PTP1分子大小不等。對不同微孢子蟲PTP1蛋白的研究表明，PTP1蛋白具有疏水性、高脯氨酸含量和免疫抗原性等諸如特征(Delbac et al.,1998)。 而PTP2和PTP3也是構(gòu)成極管的重要組分。有研究認(rèn)為，在極管彈出過程中，PTP1和PTP2 在孢子激活之前呈類結(jié)晶狀蛋白質(zhì)單體，發(fā)芽過程中在極管頂端形成聚合體，而PTP3通 過調(diào)控PTP1-PTP2聚合體的構(gòu)象狀態(tài)影響極管的彈出。另外，極管蛋白PTP1的糖基化作 用對極管的構(gòu)造起著重要的作用，從而間接影響微孢子蟲對宿主細(xì)胞的入侵。但是目前關(guān) 于微孢子蟲極管蛋白的研究僅局限于^7c印/ a"'tozo朋、67收朋、^7es朋和7fe^歷a等部 分微孢子蟲屬的少量微孢子蟲。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明擬基于基因組分析數(shù)據(jù)，其目的在于提供一種家蠶微孢子蟲極管蛋白PTP3基 因。通過分析PTP3的功能、組成和特性，弄清極管蛋白PTP3在家蠶微孢子蟲極管彈出過 程中的作用，探明家蠶微孢子蟲侵染宿主家蠶致病的機(jī)制，對生產(chǎn)實(shí)踐和疾病防治具有極 其重要的意義。
本發(fā)明申請人通過對家蠶微孢子蟲極絲蛋白PTP3基因的克隆，得到了該蛋白基因的
編碼序列，具體方法如下
(1) 同源性預(yù)測通過對家蠶微孢子蟲與兔腦炎微孢子蟲基因組的基因同源性分析，
得到了家蠶微孢子蟲極管蛋白PTP3基因序列CDS;
(2) 引物設(shè)計(jì)利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，在正向引物加入BamH
I酶切位點(diǎn)，在反向引物加入SalI酶切位點(diǎn)，引物序列分別為 PTP3-Primer-F5'-CGGGATCCCTACACATTATTTG-3'
PTP3-Primer-R5-CGGTCGACGTGATGATGGGATTCC-3'
(3) 極絲蛋白PTP3PCR擴(kuò)增和克隆利用提取的微孢子基因組直接作為模板，采 用基因組PCR擴(kuò)增目的片段；將擴(kuò)增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)載體上，然后進(jìn)行
序列測定(上海英俊)，從而獲得的極絲蛋白PTP3全長編碼序列；
(4) 序列同源性分析同源性比對在NCBI站點(diǎn)上用BLAST完成，BLAST分析表明家
蠶微孢子蟲極絲蛋白PTP3與NCBI蛋白質(zhì)庫中蛋白質(zhì)沒有顯著的同源性，而極絲蛋白PTP3
是家蠶微孢子蟲極管的重要蛋白，因此極絲蛋白PTP3基因是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白基因。
上述方法獲得的PTP3基因全長cDNA基因及其推斷的氨基酸序列如下
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S S P L KPTP3基因在制備殺蟲劑特別是殺蝗劑中的應(yīng)用。
10本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是-
(1) 由于微孢子蟲極管蛋白PTP3是組成微孢子蟲極管的主要蛋白，而極管是微孢子蟲繁殖和侵染的重要器官，通過它廣泛寄生并感染極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的昆蟲、魚類、嚙齒類、兔類、皮毛動物、靈長類以及家庭寵物如狗和鳥，引發(fā)嚴(yán)重疾病甚至死亡，嚴(yán)重制約著世界蠶業(yè)生產(chǎn)和動物保育。甚至還能機(jī)會性地感染艾滋病(HIV)患者、器官移植病人、服用免疫抑制劑藥物病人和先天性免疫機(jī)能不健全者，引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和皮膚潰爛等惡性疾病，加劇病情，加速病人的死亡。齒此所獲得的極管蛋白PTP3對研究微孢子蟲繁殖和侵染機(jī)制有其重要作用。通過分析PTP3的功能、組成和特性，弄清極管蛋白PTP3在家蠶微孢子蟲極管彈出過程中的作用，探明家蠶微孢子蟲侵染宿主家蠶致病的機(jī)制，對生產(chǎn)實(shí)踐和疾病防治具有極其重要的意義。
(2) RNAi干涉等試驗(yàn)分析表明，把極絲蛋白PTP3干涉到后，微孢子蟲失去感染宿主的能力。所以微孢子蟲的極絲蛋白PTP3和它潛在的調(diào)控基因?qū)⒊蔀橹委熚㈡咦酉x感染新的因素。還可以通過轉(zhuǎn)基因的手段，使之它高豐度的表達(dá)，從而殺害蝗蟲等部分害蟲。
具體實(shí)施方式
-
應(yīng)用Glimmer3.0軟件，通過對家蠶微孢子蟲與兔腦炎微孢子蟲基因組的基因同源性分析，得到了家蠶微孢子蟲極管蛋白PTP3基因序列CDS;應(yīng)用Primer5. 0軟件，設(shè)計(jì)出一對特異性引物
PTP3-Primer-F5-CGGGATCCCTACACATTATTTG-3'
PTP3-Primer-R5'-CGGTCGACGTGATGATGGGATTCC-3'擴(kuò)增片斷克隆到PMD18-T載體上，序列測定由上海英駿完成，獲得的極絲蛋白PTP3全長編碼序列；同源性比對在NCBI站點(diǎn)上用BLAST完成，序列分析表明它為一個(gè)新蛋白基因。序列表
SEQUENCE LISTING<110>西南大學(xué)
<120>家蠶微孢子蟲極絲蛋白PTP3基因
<130>
<140><141>
<160> 1
<170>
<210> 1<211> 4110<212> DNA
<213> 家蠶(Bombyxmori)<400> 1
1 atgatctaca cattatttgt aatatacata tctagcacat tttgtaggat aatctcaaga61 agtacagtag aaaatggtcc tcccacagtt ectttcgatg aacatcaagc taaacatgtt121 catgttcgag tgcacggtag acacagacat ggaaatcacc atggtggtgg tcaagacgta181 cacgaagttc aaaaacacca cagtcatcac cacaatgggc ataattacgg tcttgaacat241 ggaaaattcg gaaatgtaac ttacacttct ggaaatcacc atggtcacca ttctcatcac301 ggttctcacg cggatggaca ccattctcaa tacggttcgc acgcggacgg acatcatgtt361 aacgcccaat cagatgcttc tgcaccacta gacgttttgc caatgaaaga agtaagaagt421 ggtgatgatc cagctttgga gagagatcta ggaattcaac aagccatgaa agcttttcga481 tcttctttac ctgttteaaa taaagacacc aattctcttt tggataaagc tgaaggaatt541 ttaagaagtg caccagacgg ccaattagat gctcctgttc ttgatagtta cggaaatcca601 actgggcaga catacagaga agccgcagaa gatgcagtag gctataagta tccaacagca661 gtagcagatg aagaattcga tagtttagta aggagtggtg ttgaaccggg aagagccaag721 caagtagctg ataaaattga agaaacaggt tttgaacacg agaaaattaa agatgcagta781 agaaatgaag tagctagagg tacagcaaac agagccgtag cagaattaca agacgaaatt841 caaagacgta aaaatgctac taaagtcaaa gaacgtgtta aagttgaaga tgaattgtac901 agacaacaca ctcttcctgc tactggttta ttcgatgaag acgtgtctgt tctgaaaaat961 atgagccaaa ttgttccgcc tgcgaaaatt gtcgactaca tcagagactc ctatgataat1021 tcaattgaag ccggacttcc tcctgcggtt gctcgtgctc aggccgatcg tgttggttct1081 ttaattacgg atttcaatac aatgttaaga agtggtgaat ctcctgaaac tgctttgtcc1141 catcttaaag acatgtctga taggcaatea aaagtcgatc aaagaagaga attacttcag1201 aactctagtc cagaagtctt aaaaatactt tcagataaag ataatttaat taaagaagca1261 ctggttaaaa ctgcaagaga tcctgactgt agagacagat actttgatga agcctcccag1321 aagatgaaga ttcttgatgc aagagaagcc agttttattc atgatactga aaataacaag<formula>formula see original document page 13</formula><210> 2 <211> 1370 <212> PRT
<213> 家蠶(Bombyxmori) <400> 1
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1321 GKAPVSPPAP TSPASSPTAS PIAPTASPIA PTGASIGAPG SLGIPSSPLK
1權(quán)利要求
1、一種家蠶微孢子蟲極絲蛋白PTP3基因，其特征在于其序列如下1 atgatctaca cattatttgt aatatacata tctagcacat tttgtaggat aatctcaaga61 agtacagtag aaaatggtcc tcccacagtt cctttcgatg aacatcaagc taaacatgtt121 catgttcgag tgcacggtag acacagacat ggaaatcacc atggtggtgg tcaagacgta181 cacgaagttc aaaaacacca cagtcatcac cacaatgggc ataattacgg tcttgaacat241 ggaaaattcg gaaatgtaac ttacacttct ggaaatcacc atggtcacca ttctcatcac301 ggttctcacg cggatggaca ccattctcaa tacggttcgc acgcggacgg acatcatgtt361 aacgcccaat cagatgcttc tgcaccacta gacgttttgc caatgaaaga agtaagaagt421 ggtgatgatc cagctttgga gagagatcta ggaattcaac aagccatgaa agcttttcga481 tcttctttac ctgtttcaaa taaagacacc aattctcttt tggataaagc tgaaggaatt541 ttaagaagtg caccagacgg ccaattagat gctcctgttc ttgatagtta cggaaatcca601 actgggcaga catacagaga agccgcagaa gatgcagtag gctataagta tccaacagca661 gtagcagatg aagaattcga tagtttagta aggagtggtg ttgaaccggg aagagccaag721 caagtagctg ataaaattga agaaacaggt tttgaacacg agaaaattaa agatgcagta781 agaaatgaag tagctagagg tacagcaaac agagccgtag cagaattaca agacgaaatt841 caaagacgta aaaatgctac taaagtcaaa gaacgtgtta aagttgaaga tgaattgtac901 agacaacaca ctcttcctgc tactggttta ttcgatgaag acgtgtctgt tctgaaaaat961 atgagccaaa ttgttccgcc tgcgaaaatt gtcgactaca tcagagactc ctatgataat1021 tcaattgaag ccggacttcc tcctgcggtt gctcgtgctc aggccgatcg tgttggttct1081 ttaattacgg atttcaatac aatgttaaga agtggtgaat ctcctgaaac tgctttgtcc1141 catcttaaag acatgtctga taggcaatca aaagtcgatc aaagaagaga attacttcag1201 aactctagtc cagaagtctt aaaaatactt tcagataaag ataatttaat taaagaagca1261 ctggttaaaa ctgcaagaga tcctgactgt agagacagat actttgatga agcctcccag1321 aagatgaaga ttcttgatgc aagagaagcc agttttattc atgatactga aaataacaag1381 cacatacgtc gtcctaggaa aatggcagaa gatttaatgg ataagactaa cagagataat1441 gcagaattag ttgatgtagc ttatagtcac ccagtagtag ccaaagacat tttaaaacaa1501 ggtattgcaa acactgaaag agtagctgag aaattggctg atcatttgga tgctgtaaaa1561 tttgctgaaa aagctcaaaa tccttcagct gtttcggctt tgaaacttct tgacgagaga1621 aagagacaag atgaacttga aaaaatcaat aagagaaata cagaaaatga gcaaaagatg1681 ttcaagcaga ttctaaaaga ccaagaagac gcggaagtaa tgcaaaccga agagaaaatg1741 gcagccgcaa acaaagcaag aaagatttta gatgaaggac gtagggcagc tgaacaagtt1801 ttgaaagcgg gtggaagtac tgatgaagct gctgctgttc gtgttgcagc tgagaatgct1861 actgctcgag gtttggaaca aagagaatcc atgatcgaag aagagattat gaaaaggttt1921 ggaggcgcag gtgatcctga aaaagctcgt aaaatggctg ctcacattgc tatcgctcac1981 agtggagaaa atgccgtagg aaaaacgccc gaagaagtca ttaagaaaga acaagaagcg2041 caaaagaaag agattttaag aaatgctttg tatgatgata ttggaaaaga accaatcgaa2101 attaagtctg taattccaga agaccgagat gaatactcta ttgacagaag tgtaattaaa2161 tttcctctta aaacatttat tgatgaagaa gtaagcaatg ttggagaagc ctacgtaaag2221 aacaaaaagc aaagtatcaa cgacgaagtc aggaataaag tcactaccac caacgtcaac2281 agcggtctta atgtaattga aacagaaaat ggtttcttga atctaggaga gaatagtaag2341 aaaatccaca ttgacgaagc cacagcctat tttaaaccgg ccgccaaatt aaaaatggag2401 aaaaaaggta ttaagacgga taatttcaga ccaaaaacca atcaaggtga aataagagac2461 atgcccaaag gagaaactta ctatgaggtt gatcttaaag acgccgatct aagtcttcct2521 tctcctacta atcctactcc tgatacactt gtctcaaatg gaaaagacgt tgttgatgtt2581 gaagatgttt ctgccattgt aattaataaa ggtactttag tccagacacc atggaacgaa2641 tactctgaca tgattaagcc gaagtttaat ccgtatccaa atgaaggaga gaaaattaat2701 caaatcaaga aacttcaaaa actcatagcc gatgagaaga gaaaagacac attagaccga2761 attaaagtta acacaattac taatcctgac ggagaaaagc gaatgattgt taatacgcct2821 tatggtgttc aagaaatgtt cgaggaaact gaaggaatga aaagactttc tcatattgat2881 ccaaataaga acgtggctat tagtgaaact ccgactgatg ataacaaaga atctatttac2941 agcgccttta agaacgtttc accaaatgaa gcagtcggaa aattcattga agatactttt3001 aattctgcat actcatccgg tcaagctcag agatttgtaa atcccacaaa cgcctttact3061 ggtcaagaag atccaaagaa agccagactc atgactcaga agactattga tgttacagag3121 tattatatta atgacggtaa accatcttcg gctatcaaaa atcaactaat ccaaaattac3181 agagccttag ctgatagcct tggaatgacc gaagaagatt tcattcaatt cgctcgtaaa3241 attcctgatg attctttggc acaaatgatc tcttataatg aacaatcaga atcttcgagg3301 cccgcattag tcgatgctcc attctttaag acacttcagc cacttgcaaa tcaaacgtca3361 aagaccaaac ttaacgacat catcaaaata atcttcacac aaatttctaa agtaactggt3421 aaaaccaatt caaccacagg cacaacactc gagaagaaga tagttcctaa tctaaaggca3481 gtaagatctg accaagtcat tgcaggacca aatggaggaa cttcagcttt atcccaagcc3541 acagctccaa gaaccggttc tacagttttg agtaagcaaa tcacacgagg acttcccaga3601 gttccttcag gtacaggtac tagttatcca gtgagagatc ccaatggtat taatacaagt3661 gaagataatg aaagatataa agtcaatcct tataatccat attctaaatc tgatactagt3721 ggtcttgaag cacctggtgg tgaaatagta cataatggta caagaccaag tccttacgct3781 atagtaggag ttccaatagt cgcagcggtt acaacaccag tcatcagacc agcagtctta3841 agaacgcctc cagcagcaca atcgagttct agtgcacttc aaggaaatac agcacttact3901 ggagcaggaa caccaagagc cggagtagca ggatcaccag gagtaaatcc aggaccaact3961 ggtaaagcac ctgtctcacc ccctgcacca acatcaccag cttcatctcc tacagcctca4021 cctatagcac ctacagcttc acctatagca cctacaggag catcaatagg agcacctggt4081 tcacttggaa tcccatcatc accattgaag。
2、 一種家蠶微孢子蟲極絲蛋白PTP3基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于其序列如下: 1 MIYTLFVIYI SSTFCRIISR STVENGPPTV PFDEHQAKHV HVRVHGRHRH GNHHGGGQDV 61 HEVQKHHSHH HNGHNYGLEH GKFGNVTYTS GNHHGHHSHH GSHADGHHSQ YGSHADGHHV 121 NAQSDASAPL DVLPMKEVRS GDDPALERDL GIQQAMKAFR SSLPVSNKDT NSLLDKAEGI181LRSAPDGQLDAPVLDSYGNPTGQTYREAAEDAVGYKYPTA■EEFDSLVRSGVEPGRAK241QVADKIEETGFEHEKIKDAVRNEVARGTANRAVAELQDEIQRRKNATKVKERVKVEDELY301RQHTLPATGLFDEDVSVLKNMSQIVPPAKIVDYIRDSYDNSIEAGLPPAVARAQADRVGS361LITDF畫LRSGESPETALSHLKDMSDRQSKVDQRRELLQNSSPEVLKILSDKDNLIKEA421LVKTARDPDCRDRYFDEASQ腿IL證EASFIHDTENNKHIRRPRKMAEDLMDKTNRDN481AELV歸YSHPVVAKDILKQGIANTERVAEKLADHLDAVKFAEKAQNPSAVSALKLLDER541KRQDELEKINKRNTENEQKMFKQILK,DAEVMQTEEKMAAANKARKILDEGRRAAEQV601LKAGGSTDEAAAV證A腿TARGLEQRESMIEEEIMKRFGGAGDPEKARKMAAHIAIAH661SG腿VGKTPEEVIKKEQEAQKKEILRNALYDDIGKEPIEIKSVIPEDRDEYSIDRSVIK721FPLKTFIDEEVSNVGEAYVKNKKQSINDEVRNKVTTTNVNSGLNVIETEN'GFLNLGENSK781KIHIDEATAYFKPAAKLKMEKKGIKTDNFRPKTNQGEIRDMPKGETYYEVDLKDADLSLP841SPTNPTPDTLVSNGKDVVDVEDVSAIVINKGTLVQTPWNEYSDMIKPKFNPYPNEGEKIN901QIKKLQKLIADEKRKDTLDRIK麗ITNPDGEKRMIVNTPYGVQEMFEET EGMKRLSHID961PNKNVAISETPTDDNKESIYSAFKNVSPNEAVGKFIEDTFNSAYSSGQAQ RFVNPTNAFT1021GQEDPKKARLMTQKTIDVTEYYINDGKPSSAI認(rèn)QLIQNYRALADSLGMTEEDFIQFARK1081IPDDSLAQMISYNEQSESSRPALVDAPFFKTLQPLANQTSKTKLNDIIKIIFTQISKVTG1141KTNSTTGTTLEKKIVPNLKAVRSDQVIAGPNGGTSALSQATAPRTGSTVLSKQITRGLPR1201VPSGTGTSYPVRDPNGINTSEDNERYKVNPYNPYSKSDTSGLEAPGGEIVHNGTRPSPYA1261IVGVPIV膨TTPVIRPAVLRTPPAAQSSSSALQGNTALTGAGTPRAGVAGSPGVNPGPT1321GKAPVSPPAPTSPASSPTASPIAPTASPIAPTGASIGAPGSLGIPSSPLK
3、 PTP3基因在制備殺蟲劑特別是殺蝗劑中的應(yīng)用。
全文摘要
一種家蠶微孢子蟲的繁殖和侵染有關(guān)的重要蛋白基因PTP3，依據(jù)家蠶微孢子蟲的9倍基因組數(shù)據(jù)，得到編碼家蠶微孢子蟲極管蛋白PTP3基因序列CDS，并經(jīng)一系列生物技術(shù)克隆證實(shí)。本發(fā)明所獲得的極管蛋白PTP3對研究微孢子蟲繁殖和侵染機(jī)制有其重要作用。從而對生產(chǎn)實(shí)踐和微孢子蟲病的防治發(fā)揮作用。RNAi干涉等試驗(yàn)分析表明，把極絲蛋白PTP3干涉到后，微孢子蟲失去感染宿主的能力。所以微孢子蟲的極絲蛋白PTP3和它潛在的調(diào)控基因?qū)⒊蔀橹委熚㈡咦酉x感染新的因素。還可以通過轉(zhuǎn)基因的手段，使之它高豐度的表達(dá)，從而殺害蝗蟲等部分害蟲。
文檔編號C12N15/30GK101492683SQ200810233310
公開日2009年7月29日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者向仲懷, 周澤揚(yáng), 潘國慶, 許金山 申請人:西南大學(xué)