專利名稱:家蠶糖受體蛋白基因Bmor2及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,特別是涉及家蠶食性相關(guān)的糖受體蛋白基因。
背景技術(shù):
味覺(jué)系統(tǒng)能檢測(cè)和區(qū)分不同的味覺(jué)刺激,這是所有動(dòng)物所具有的普遍特征。植食性是 鱗翅目昆蟲(chóng)的一個(gè)重要特性。家蠶是一種寡食性經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng),幼蟲(chóng)僅食桑葉。家蠶取食主要
包含兩個(gè)階段第一,家蠶幼蟲(chóng)接受外界氣味物質(zhì)所刺激,發(fā)生趨向反應(yīng)。氣味物質(zhì)透過(guò) 幼蟲(chóng)觸角嗅孔,進(jìn)入到觸角淋巴液腔,與高濃度的氣味結(jié)合蛋白結(jié)合形成復(fù)合體,然后通 過(guò)淋巴液循環(huán),運(yùn)輸?shù)叫嵊X(jué)神經(jīng)細(xì)胞膜上,與特異嗅覺(jué)受體結(jié)合,刺激電信號(hào)的產(chǎn)生,生 物電信號(hào)經(jīng)過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑,到達(dá)大腦中樞,進(jìn)而調(diào)節(jié)家蠶的行為反應(yīng)。第二,當(dāng)家 蠶被某種喜好氣味所吸引,并到達(dá)該物質(zhì)處,將發(fā)生咬食、吞咽行為,該物質(zhì)中所含成分 將刺激家蠶唇瓣、咽下經(jīng)節(jié)等處的神經(jīng)細(xì)胞,其上的味覺(jué)受體與其作用后,產(chǎn)生特異電 信號(hào),經(jīng)過(guò)傳導(dǎo)、神經(jīng)反饋等調(diào)節(jié),促使家蠶對(duì)食物作出選擇。
家蠶基因組編碼了能識(shí)別植物成分中多種化合物的基因,其中同屬于GPCR家族成員
的嗅覺(jué)和味覺(jué)受體基因在家蠶覓食、攝食過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。味覺(jué)受體多分布 在唇瓣、下顎、觸角等部位的化學(xué)感受器神經(jīng)細(xì)胞中,軸突延伸到大腦中的咽下神經(jīng)節(jié)。 味覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞感知食物中的糖、水和鹽等成分,并產(chǎn)生相應(yīng)的生理電信號(hào),進(jìn)而調(diào)節(jié)家蠶 的擇食行為。桑葉作為家蠶的主要食物,所含成分復(fù)雜,主要包括糖類、甾體及三萜類化 合物、多種氨基酸、生物堿、有機(jī)酸及其它化合物,其中糖類與蛋白質(zhì)或氨基酸成分比列, 對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育、蠶絲蛋白的合成、蠶繭質(zhì)量等有密切的關(guān)系。甜味物質(zhì)的感知是生物 的重要味覺(jué)特征之一,諸如果蠅、家蠶等以攝取糖類物質(zhì)作為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物尤為明 顯。他們利用特有味覺(jué)受體從植物中有害的苦味化學(xué)物中區(qū)分富含糖、氨基酸的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 因此,對(duì)糖類物質(zhì)的敏感性,直接關(guān)系到家蠶的擇食行為。
隨著家蠶基因組數(shù)據(jù)的日益完善,我們從中獲得了大量的信息,篩選出了與感知糖類 物質(zhì)直接相關(guān)的味覺(jué)受體基因。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將家蠶寡食性機(jī)制研究與現(xiàn)代基因工程育種相結(jié)合,其目的在于提供一種與家 蠶寡食性直接相關(guān)的糖受體基因,對(duì)糖受體基因的研究,將在家蠶育種等方面有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
基于味覺(jué)受體的結(jié)構(gòu)和特異表達(dá)模式,我們得到了一個(gè)感知糖的受體基因,具體方法 如下
(1) 在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/下載果蠅等昆蟲(chóng)所報(bào)道的糖受體基因序列;
(2) 將序列在家蠶基因組海量數(shù)據(jù)中進(jìn)行tBLASTn比對(duì),為了得到可能的同源序列, E值為默認(rèn)的10;
(3) 序列同源性分析味覺(jué)受體序列分化嚴(yán)重,同源性較低,故將E值小于5的各 序列從家蠶基因組數(shù)據(jù)中提出來(lái),并在http://www.softberry.com/berry.phtml對(duì)其相應(yīng)片段 約1萬(wàn)個(gè)BP范圍內(nèi)DNA序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè);
(4) 將所預(yù)測(cè)得到的基因完整的ORF,在NCBI中進(jìn)行BLAST,驗(yàn)證所得結(jié)果是否 為目的基因,結(jié)果表明,家蠶糖受體一個(gè)具有7次跨膜結(jié)構(gòu)域的G-蛋白偶聯(lián)受體,為一個(gè) 新基因;
(5) ^ww2cDNA克隆的獲得根據(jù)預(yù)測(cè)所得到的^wod完整的ORF設(shè)計(jì)引物,以 家蠶幼蟲(chóng)頭RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板擴(kuò)增,擴(kuò)增片段克隆到Pmdl8-T(上海Sangon) 載體上,然后進(jìn)行序列測(cè)定與拼接,從而獲得^^r2cDNA基因克隆;
(6) 細(xì)胞水平驗(yàn)證Smw2:利用RNAi、 EAG等技術(shù),驗(yàn)證了 Smod對(duì)糖類物質(zhì)敏 感,為家蠶糖受體蛋白基因。
上述方法獲得的基因完整的ORF及其推斷的氨基酸序列如下:
ATGCTTTCTTTGCTTTCGAAATTCGTAATAACGATGGACTGT TTACCAAAGGGCAGTGAT
MLSSKFVITMDC LPKGSD
CTTTTTGAAAGTTACATCATCAGGMCTTTCCTTGGTTGTTC GAATTTGACTTCCTGACT
FESYIIRNFPWLF EFDFT
TTGGTATCAACGATTAATTGGAGCTACTCAGATCTGTTCATA GTGTGCATGAGCATTTAC
VSTINWSYSDLFI VCMSIY
CTTACATCCATATTAAMCAGATCMCMGMAATAGAGATG GCTGGTAATTCCGTGAGT
LTSILKQINKKIEM AGNSVS
ATCTTTTATAGCGTAAGCAAGGTCATGMAATTCMATTGAG AACTATGACTTAGAATCA
IFYSVSKVMKIQIE NYDES
CCTGCCTATACCGTTCTGGCGMCATTACGGGAAGACTACAC AAGAGCAACGCGTCTCGT
PAYTVLANITGRLH KSNASR
TCGCAGCTTCGACGATACAATCAGCAGCGTTATATTTTTATC GTTTGCCTCMATCTATT
SQRRYNQQRYIFI VCKSI
TTTTATATGTCTACAATTGTACAATATACTATCGTGAGTATA ACTGATTTCATTGAAACA
FYMSTIVQYTIVSI TDFIET
AACTTTTTTTTATTGCTTAGATGGGTGGACGAGCTCACAGTG GCACAGCTTTCGCCATTA
NFFLRWVDETV AQSPGGC GGT TAC GAA CM ATA ATG TAT TTA TTG TTC TCT CTT TCG TTC CTA TTG GGT CGT TCT
GGYEQIMYLLFSLSFLLGRS CTA GTC GTC TCG CTT GTC GCA GCC AAA GTA CAC TCT GCT TCG ATG GTA CCG GCT TCA GCT
LVVSLVAAKVHSASMVPASA TTG TAT AAC ATA CCA CGA AAT ATG TAC TGT TCG GM ATT CAG AGG TTC TTG GAC CAA GTG
LYNIPRNMYCSEIQRFLDQV CAT GGT GAT AAG GTC GCG TTG AGC GGT CTT CGT TTT TTT TAC GTC ACT AGA AGC CTG GTT
HGDKVALSGLRFFYVTRSLV TTG TCG GTT GCT GGC ACT ATT GTC ACT TAC GAG CTG GTG TTG CTT CAA TTC AGC AAT GAA
LSVAGTIVTYELVLLQFSNE GAT TAA
D 氺
基因在培育廣食性家蠶品種中的應(yīng)用。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是-
(1) 首次從家蠶全基因組數(shù)據(jù)中篩選得到對(duì)糖類物質(zhì)敏感的味覺(jué)受體基因完 整地0RF,獲得克隆,并深入研究,證實(shí)其功能,為今后研究家蠶味覺(jué)發(fā)生機(jī)制提供了基 礎(chǔ)。
(2) 利用基因育種方法,可育成廣食性的家蠶品種,打破家蠶寡食性常規(guī),減小桑 樹(shù)繁殖的季節(jié)性影響,更大可能的獲取經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
(3) 通過(guò)對(duì)家蠶食性所涉及到的功能基因的研究,為研制新型的家蠶人工飼料提供 理論依據(jù)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例
在11 ://^^11(^.11101.11化^(^/下載果蠅等昆蟲(chóng)所報(bào)道的糖受體基因序列,與家蠶基因 組海量數(shù)據(jù)中進(jìn)行tBLASTn比對(duì),將E值小于5的各序列從家蠶基因組數(shù)據(jù)中提出來(lái), 并在http:〃www.softberry.com/beny.phtml對(duì)其相應(yīng)片段約I萬(wàn)個(gè)BP范圍內(nèi)DNA序列進(jìn)行 基因預(yù)測(cè);然后在NCBI中進(jìn)行BLAST驗(yàn)證,結(jié)果表明,家蠶糖受體一個(gè)具有7次跨膜 結(jié)構(gòu)域的G-蛋白偶聯(lián)受體,為一個(gè)新基因;根據(jù)預(yù)測(cè)所得到的Sww2完整的ORF設(shè)計(jì)引 物(正向引物5, GAAAGCAAGATTCACMA 3';反向引物5, CTATAGTACTGATATTGT 3');以家蠶幼蟲(chóng) 頭RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板擴(kuò)增,擴(kuò)增片段克隆到pMD18-T (Sangon)載體上, 然后進(jìn)行序列測(cè)定(西南大學(xué)蠶學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)研究所),從而獲得Bww2cDNA基因克??; 利用RNAi、 EAG等技術(shù),驗(yàn)證了5/nw2對(duì)糖類物質(zhì)敏感,為家蠶糖受體蛋白基因。序列表
SEQUENCE LISTING <110>西南大學(xué)
<120〉家蠶糖受體蛋白基因Bmor2 <130>
<140> 〈141〉
<160〉 1
<170>
〈210〉 1
〈211> 846
〈212〉 DNA
〈213〉 家蠶(Bombyx mori)
〈400> 1
1ATGCTTTCTTTGCTTTCGMATTCGTAATAACGATGGACTGTTTACCAAAGGGCAGTGAT
61CTTTTTGAAAGTTACATCATCAGGAACTTTCCTTGGTTGTTCGAATTTGACTTCCTGACT
121TTGGTATCMCGATTAATTGGAGCTACTCAGATCTGTTCATAGTGTGCATGAGCATTTAC
181CTTACATCCATATTAAAACAGATCAACMG嵐ATAGAGATGGCTGGTMTTCCGTGAGT
241ATCTTT窗AGCGTMGCMGGTCATGAMATTCMATTGAGMCTATGACTTAGAATCA
301CCTGCCTATACCGTTCTGGCGMCATTACGGGMGACTACACAAGAGCAACGCGTCTCGT
361TCGCAGCTTCGACGATACMTCAGCAGCGTTATATTTTTATCGTTTGCCTCAAATCTATT
421TTTTATATGTCTACMTTGTACMTATACTATCGTGAGTATMCTGATTTCATTGAAACA
481AACTTTTTTTTATTGCTTAGATGGGTGGACGAGCTCACAGTGGCACAGCTTTCGCCATTA
541GGCGGTTACGMCMATAATGTATTTATTGTTCTCTCTTTCGTTCCTATTGGGTCGTTCT
601CTAGTCGTCTCGCTTGTCGCAGCCAMGTACACTCTGCTTCGATGGTACCGGCTTCAGCT
661TTGTATMCATACCACGAAATATGTACTGTTCGG嵐TTCAGAGGTTCTTGGACCMGTG
721CATGGTGATAAGGTCGCGTTGAGCGGTCTTCGTTTTTTTTACGTCACTAGMGCCTGGTT
781TTGTCGGTTGCTGGCACTATTGTCACTTACGAGCTGGTGTTGCTTCMTTCAGCMTGAA
841GATTM
<210> 2 <211> 281 <212> PRT
〈213〉家蠶(Bombyx mori) <400> 1
1 MLSLLSKFVI TMDCLPKGSD LFESYIIRNF PWLFEFDFLT LVSTINWSYS DLFIVCMSIY
661 LTSILKQINK KIEMAGNSVS IFYSVSKVMK IQIENYDLES PAYTVLANIT GRLHKSNASR
121 SQLRRYNQQR YIFIVCLKSI FYMSTIVQYT IVSITDFIET NFFLLLRWVD ELTVAQLSPL 181 GGYEQIMYLL FSLSFLLGRS LVVSLVAAKV HSASMVPASA LYNIPRNMYC SEIQRFLDQV 241 HGDKVALSGL RFFYVTRSLV LSVAGTIVTY ELVLLQFSNE D
權(quán)利要求
1、一種家蠶糖受體蛋白基因Bmor2,其特征在于其序列如下1 ATGCTTTCTT TGCTTTCGAA ATTCGTAATA ACGATGGACT GTTTACCAAA GGGCAGTGAT61 CTTTTTGAAA GTTACATCAT CAGGAACTTT CCTTGGTTGT TCGAATTTGA CTTCCTGACT121 TTGGTATCAA CGATTAATTG GAGCTACTCA GATCTGTTCA TAGTGTGCAT GAGCATTTAC181 CTTACATCCA TATTAAAACA GATCAACAAG AAAATAGAGA TGGCTGGTAA TTCCGTGAGT241 ATCTTTTATA GCGTAAGCAA GGTCATGAAA ATTCAAATTG AGAACTATGA CTTAGAATCA301 CCTGCCTATA CCGTTCTGGC GAACATTACG GGAAGACTAC ACAAGAGCAA CGCGTCTCGT361 TCGCAGCTTC GACGATACAA TCAGCAGCGT TATATTTTTA TCGTTTGCCT CAAATCTATT421 TTTTATATGT CTACAATTGT ACAATATACT ATCGTGAGTA TAACTGATTT CATTGAAACA481 AACTTTTTTT TATTGCTTAG ATGGGTGGAC GAGCTCACAG TGGCACAGCT TTCGCCATTA541 GGCGGTTACG AACAAATAAT GTATTTATTG TTCTCTCTTT CGTTCCTATT GGGTCGTTCT601 CTAGTCGTCT CGCTTGTCGC AGCCAAAGTA CACTCTGCTT CGATGGTACC GGCTTCAGCT661 TTGTATAACA TACCACGAAA TATGTACTGT TCGGAAATTC AGAGGTTCTT GGACCAAGTG721 CATGGTGATA AGGTCGCGTT GAGCGGTCTT CGTTTTTTTT ACGTCACTAG AAGCCTGGTT781 TTGTCGGTTG CTGGCACTAT TGTCACTTAC GAGCTGGTGT TGCTTCAATT CAGCAATGAA841 GATTAA。
2、 一種家蠶糖受體蛋白基因^WW2編碼的蛋白質(zhì),其特征在于其序列如下<formula>formula see original document page 2</formula>
3、 S歸d基因在培育廣食性家蠶品種中的應(yīng)用。
全文摘要
一種家蠶糖受體蛋白基因Bmor2,利用已報(bào)道的昆蟲(chóng)(如果蠅),糖受體蛋白基因序列,在家蠶基因組海量數(shù)據(jù)中進(jìn)行tBLASTn,預(yù)測(cè)得到的同源片段中基因完整ORF,通過(guò)NCBI上BLAST驗(yàn)證,最終鑒定得到了糖受體蛋白基因Bmor2。利用基因育種方法,可育成廣食性的家蠶品種,打破家蠶寡食性常規(guī),減小桑樹(shù)繁殖的季節(jié)性影響,更大可能的獲取經(jīng)濟(jì)價(jià)值;通過(guò)對(duì)家蠶食性所涉及到的功能基因的研究,為研制新型的家蠶人工飼料提供理論依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101492679SQ200810233308
公開(kāi)日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者向仲懷, 夏慶友, 徐漢福, 英 林, 萍 趙 申請(qǐng)人:西南大學(xué)