專利名稱：家蠶糖受體蛋白基因Bmor3及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是涉及家蠶食性相關的糖受體基因。
背景技術：
味覺系統(tǒng)能檢測和區(qū)分不同的味覺刺激，這是所有動物所具有的普遍特征。植食性是 鱗翅目昆蟲的一個重要特性。家蠶是一種寡食性經(jīng)濟昆蟲，幼蟲僅食桑葉。家蠶取食主要 包含兩個階段第一，家蠶幼蟲接受外界氣味物質所刺激，發(fā)生趨向反應。氣味物質透過 幼蟲觸角嗅孔，進入到觸角淋巴液腔，與高濃度的氣味結合蛋白結合形成復合體，然后通 過淋巴液循環(huán)，運輸?shù)叫嵊X神經(jīng)細胞膜上，與特異嗅覺受體結合，剌激電信號的產(chǎn)生，生 物電信號經(jīng)過細胞信號傳導途徑，到達大腦中樞，進而調節(jié)家蠶的行為反應。第二，當家 蠶被某種喜好氣味所吸引，并到達該物質處，將發(fā)生咬食、吞咽行為，該物質中所含成分 將刺激家蠶唇瓣、咽下神經(jīng)節(jié)等處的神經(jīng)細胞，其上的味覺受體與其作用后，產(chǎn)生特異電 信號，經(jīng)過傳導、神經(jīng)反饋等調節(jié)，促使家蠶對食物作出選擇。
家蠶基因組編碼了能識別植物成分中多種化合物的基因，其中同屬于GPCR家族成員
的嗅覺和味覺受體基因在家蠶覓食、攝食過程中起到了至關重要的作用。味覺受體多分布 在唇瓣、下顎、觸角等部位的化學感受器神經(jīng)細胞中，軸突延伸到大腦中的咽下神經(jīng)節(jié)。 味覺神經(jīng)細胞感知食物中的糖、水和鹽等成分，并產(chǎn)生相應的生理電信號，進而調節(jié)家蠶 的擇食行為。桑葉作為家蠶的主要食物，所含成分復雜，主要包括糖類、甾體及三萜類化 合物、多種氨基酸、生物堿、有機酸及其它化合物，其中糖類與蛋白質或氨基酸成分比列， 對家蠶的生長發(fā)育、蠶絲蛋白的合成、蠶繭質量等有密切的關系。甜味物質的感知是生物 的重要味覺特征之一，諸如果蠅、家蠶等以攝取糖類物質作為主要營養(yǎng)物質的生物尤為明 顯。他們利用特有味覺受體從植物中有害的苦味化學物中區(qū)分富含糖、氨基酸的營養(yǎng)物質。 因此，對糖類物質的敏感性，直接關系到家蠶的擇食行為。
隨著家蠶基因組數(shù)據(jù)的日益完善，我們從中獲得了大量的信息，篩選出了與感知糖類 物質直接相關的味覺受體基因。
發(fā)明內容
本發(fā)明將家蠶寡食性機制研究與現(xiàn)代基因工程育種相結合，其目的在于提供一種與家 蠶寡食性直接相關的糖受體基因，對糖受體基因的研究，將在家蠶育種等方面有廣闊的應用價值。
基于味覺受體的結構和特異表達模式，我們得到了一個感知糖的受體基因，具體方法 如下
(1) 在http://www.ncbi.nlm.niLgov/下載果蠅等昆蟲所報道的糖受體基因序列；
(2) 將序列在家蠶基因組海量數(shù)據(jù)中進行tBLASTn比對，為了得到可能的同源序列， E值為默認的10;
(3) 序列同源性分析味覺受體序列分化嚴重，同源性較低，故將E值小于5的各 序列從家蠶基因組數(shù)據(jù)中提出來，并在http:〃www.so他erry.com/berry.phtml對其相應片段 約1萬個BP范圍內DNA序列進行基因預測；
(4) 將所預測得到的基因完整的ORF，在NCBI中進行BLAST,驗證所得結果是否 為目的基因，結果表明，家蠶糖受體一個具有7次跨膜結構域的G-蛋白偶聯(lián)受體，為一個 新基因；
(5) S/nw3cDNA克隆的獲得根據(jù)預測所得到的Bww3完整的ORF設計引物，以 家蠶幼蟲頭RNA反轉錄得到的cDNA為模板擴增，擴增片段克隆到Pmdl8-T(上海Sangon) 載體上，然后進行序列測定與拼接，從而獲得^m^3cDNA基因克??；
(6) 細胞水平驗證5wo,'3:利用RNAi、 EAG等技術，驗證了 5mw3對糖類物質敏 感，為家蠶糖受體蛋白基因。
上述方法獲得的^附w3基因完整的ORF及其推斷的氨基酸序列如下:
ATGTCACGGATCTTCTCGATGACGCGATACTTTGGCGTTTCT ACATGTAAGCCCAGTATC
MSRIFSMTRYFGVS TCKPSI
GCATTCGGCTGGACAGTTATATTATTGTTAATGCTACTGGCT ATTGAAGTGGGAGCTATA
AFGWTVILLLMA IEVGAI
TGGAAGATCGTGAGGCTTCTCGGAGGATGGGCGGTTCATAGT ACTGATAGTCGGGGCTTC
WKIVLLGGWAVHS TDSRGF
ACAGCGAGACTGTCAGGTTGTATATTCTATGGGMCGCTCTT CTATCCCTGATCTTGTCA
TARLSGCIFYGNAL LSILS
ATCAMTTCGTGTCATCATGGGAACAGTTATCTGAGCGCTGG TCGAGAACAGAAACGGAT
IKFVSSWEQSERW SRTETD
CCAGGACTGCGACTCCCATCTGATAGTAGAATTAAAAGACGA ACTGTCCTAGTAAGTGCC
PGLRPSDSRIKRR TVVSA
TTCGTCATGACATGCGCTTGTGTGGAGCACATGTTAAGTATG ATGTCGGCCACAGGCTTC
FVMTCACVEHMSM MSATGF
GATTGTCCTCCTGMGMTATACGGAGAGATACATTCTAAGC TCACATGGATTCCTCGTT
DCPPEEYTERYIS SHGFLV
CAAAACGATGMTACAACCTCTGGTTGGCAATACCGATTTTC ATAATGAGTMACTTGCA
QNDEYNLWAIPIF IMSKLA
4ACCGCTTTGTGGAATTTCCAAGATTTGATCATTATTTTGATTAGTATGGGATTCACATCG
TAWNFQDIIILISMGFTS
CGATATAATAGACTTAATACGTACGTACATCGAGTTGTGATGCTTGAGAGGMCCTAAAG
RYNRNTYVHRVVMLERNLK
GAAGGTGCTCAGGTTTCGTCTGAAMTTACATGCGATTCCAAATATGGCGTCGAATTAGA
EGAQVSSENYMRFQIWRRIR
CAAGCGTATGTTAGACAGGCAGCCCTCGTGCGGTTAGTTGACGATCAGCTCGGGGCTTTG
QAYVRQAAVRVDDQGAL
GTCTTATTGTCAAACGTCAACMTTTATACTTCATCTGTCTTCAATTATTTCTTGGGATC
VSNVNNYFICLQFGI
AAGTTATATTATTTCATTTCTCTCGGTTGGTTGATGTTCAGAGCTTGTGGCGTAGTGTTG
KLYYFISGWLMFRACGVV
GCGGCTGCAGACGTATATATTCATTCGMAMAGCTTTAATCTCCTTGTACTTGTGTCCC
AAADVYIHSKKALISLYCP
GAATTAGCTTACAACCTGGAGATTMGAGATTAAAGTATCAGTTGAAGAATGATGAAGTT
ELAYNEIKRKYQKNDEV
GCTCTAACTGGAATGGGTTTATTTTCGTTGMTCGCGAATTGTTGTTAGAGGTAGCCGCA
ATGMGLFSNRELEVAA
GCCGTTTTGAMTATGMCTGGTTTTAGTGCAATACGATAAATGA
AVLKYEVVQYDK氺
Sww3基因在培育廣食性家蠶品種中的應用。
本發(fā)明的優(yōu)點是
(1) 首次從家蠶全基因組數(shù)據(jù)中篩選得到對糖類物質敏感的味覺受體基因說7fr3完
整地0RF，獲得克隆，并深入研究，證實其功能，為今后研究家蠶味覺發(fā)生機制提供了基 礎。
(2) 利用基因育種方法，可育成廣食性的家蠶品種，打破家蠶寡食性常規(guī)，減小桑 樹繁殖的季節(jié)性影響，更大可能的獲取經(jīng)濟價值。
(3) 通過對家蠶食性所涉及到的功能基因的研究，為研制新型的家蠶人工飼料提供 理論依據(jù)。
具體實施例方式
實施例
在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/下載果蠅等昆蟲所報道的糖受體基因序歹iJ，與家蠶基因 組海量數(shù)據(jù)中進行tBLASTn比對，將E值小于5的各序列從家蠶基因組數(shù)據(jù)中提出來， 并在http:〃www.so他erry.com/berry.phtml對其相應片段約1萬個BP范圍內DNA序列進行 基因預測；然后在NCBI中進行BLAST驗證，結果表明，家蠶糖受體一個具有7次跨膜 結構域的G-蛋白偶聯(lián)受體，為一個新基因；根據(jù)預測所得到的^w^3完整的0RF設計引
5物(正向引物5， GAAAGCAAGATTCACMA 3';反向引物5， CTATAGTACTGATATTCT 3，)。以家蠶幼蟲 頭RNA反轉錄得到的cDNA為模板擴增，擴增片段克隆到pMD18-T (Sangon)載體上， 然后進行序列測定(西南大學蠶學與系統(tǒng)生物學研究所)，從而獲得Sm^3cDNA基因克??； 利用RNAi、 EAG等技術，驗證了萬mw3對糖類物質敏感，為家蠶糖受體蛋白基因。序列表
SEQUENCE LISTING <110>西南大學
<120>家蠶糖受體蛋白基因Bmor3 <130>
<140> <141>
<160> 1
<170>
<210> 1 <211> 1125 <212> DNA
<213> 家蠶(Bombyxmori) <400> 1
1 ATGTCACGGA TCTTCTCGAT GACGCGATAC TTTGGCGTTT CTACATGTAA GCCCAGTATC
61 GCATTCGGCT GGACAGTTAT ATTATTGTTA ATGCTACTGG CTATTGAAGT GGGAGCTATA
121 TGGAAGATCG TGAGGCTTCT CGGAGGATGG GCGGTTCATA GTACTGATAG TCGGGGCTTC
181 ACAGCGAGAC TGTCAGGTTG TATATTCTAT GGGAACGCTC TTCTATCCCT GATCTTGTCA
241 ATCAAATTCG TGTCATCATG GGAACAGTTA TCTGAGCGCT GGTCGAGAAC AGAAACGGAT
301 CCAGGACTGC GACTCCCATC TGATAGTAGA ATTAAAAGAC GAACTGTCCT AGTAAGTGCC
361 TTCGTCATGA CATGCGCTTG TGTGGAGCAC ATGTTAAGTA TGATGTCGGC CACAGGCTTC
421 GATTGTCCTC CTGAAGAATA TACGGAGAGA TACATTCTAA GCTCACATGG ATTCCTCGTT
481 CAAAACGATG AATACAACCT CTGGTTGGCA ATACCGATTT TCATAATGAG TAAACTTGCA
541 ACCGCTTTGT GGAATTTCCA AGATTTGATC ATTATTTTGA TTAGTATGGG ATTCACATCG
601 CGATATAATA GACTTAATAC GTACGTACAT CGAGTTGTGA TGCTTGAGAG GAACCTAAAG
661 GAAGGTGCTC AGGTTTCGTC TGAAAATTAC ATGCGATTCC AAATATGGCG TCGAATTAGA
7721 CAAGCGTATG TTAGACAGGC AGCCCTCGTG CGGTTAGTTG ACGATCAGCT CGGGGCTTTG
781 GTCTTATTGT CAAACGTCAA CAATTTATAC TTCATCTGTC TTCAATTATT TCTTGGGATC
841 AAGTTATATT ATTTCATTTC TCTCGGTTGG TTGATGTTCA GAGCTTGTGG CGTAGTGTTG
901 GCGGCTGCAG ACGTATATAT TCATTCGAAA AAAGCTTTAA TCTCCTTGTA CTTGTGTCCC
961 GAATTAGCTT ACAACCTGGA GATTAAGAGA TTAAAGTATC AGTTGAAGAA TGATGAAGTT
薩GCTCTAACTG GAATGGGTTT ATTTTCGTTG AATCGCGAAT TGTTGTTAGA GGTAGCCGCA
1081 GCCGTTTTGA AATATGAACT GGTTTTAGTG CAATACGATA AATGA
<210> 2 <211> 374 <212> PRT
<213> 家蠶(Bombyxmori) <400> 1
1MSRIFSMTRY FGVSTCKPSI AFGWTVILLL MLLAIEVGAI WKIVRLLGGW AVHSTDSRGF
61 TARLSGCIFY GNALLSLILS IKFVSSWEQL SERWSRTETD PGLRLPSDSR IKRRTVLVSA
121 FVMTCACVEH MLSMMSATGF DCPPEEYTER YILSSHGFLV QNDEYNLWLA IPIFIMSKLA
181 TALWNFQDLI IILISMGFTS RYNRLNTYVH RVVMLERNLK EGAQVSSENY MRFQIWRRIR
241 QAYVRQAALV RLVDDQLGAL VLLSNVNNLY FICLQLFLGI KLYYFISLGW LMFRACGVVL
301 AAADVYIHSK KALISLYLCP ELAYNLEIKR LKYQLKNDEV ALTGMGLFSL NRELLLEVAA
361 AVLKYELVLV QYDK
8
權利要求
1、一種家蠶糖受體蛋白基因Bmor3，其特征在于其序列如下1 ATGTCACGGA TCTTCTCGAT GACGCGATAC TTTGGCGTTT CTACATGTAA GCCCAGTATC61 GCATTCGGCT GGACAGTTAT ATTATTGTTA ATGCTACTGG CTATTGAAGT GGGAGCTATA121 TGGAAGATCG TGAGGCTTCT CGGAGGATGG GCGGTTCATA GTACTGATAG TCGGGGCTTC181 ACAGCGAGAC TGTCAGGTTG TATATTCTAT GGGAACGCTC TTCTATCCCT GATCTTGTCA241 ATCAAATTCG TGTCATCATG GGAACAGTTA TCTGAGCGCT GGTCGAGAAC AGAAACGGAT301 CCAGGACTGC GACTCCCATC TGATAGTAGA ATTAAAAGAC GAACTGTCCT AGTAAGTGCC361 TTCGTCATGA CATGCGCTTG TGTGGAGCAC ATGTTAAGTA TGATGTCGGC CACAGGCTTC421 GATTGTCCTC CTGAAGAATA TACGGAGAGA TACATTCTAA GCTCACATGG ATTCCTCGTT481 CAAAACGATG AATACAACCT CTGGTTGGCA ATACCGATTT TCATAATGAG TAAACTTGCA541 ACCGCTTTGT GGAATTTCCA AGATTTGATC ATTATTTTGA TTAGTATGGG ATTCACATCG601 CGATATAATA GACTTAATAC GTACGTACAT CGAGTTGTGA TGCTTGAGAG GAACCTAAAG661 GAAGGTGCTC AGGTTTCGTC TGAAAATTAC ATGCGATTCC AAATATGGCG TCGAATTAGA721 CAAGCGTATG TTAGACAGGC AGCCCTCGTG CGGTTAGTTG ACGATCAGCT CGGGGCTTTG781 GTCTTATTGT CAAACGTCAA CAATTTATAC TTCATCTGTC TTCAATTATT TCTTGGGATC841 AAGTTATATT ATTTCATTTC TCTCGGTTGG TTGATGTTCA GAGCTTGTGG CGTAGTGTTG901 GCGGCTGCAG ACGTATATAT TCATTCGAAA AAAGCTTTAA TCTCCTTGTA CTTGTGTCCC961 GAATTAGCTT ACAACCTGGA GATTAAGAGA TTAAAGTATC AGTTGAAGAA TGATGAAGTT1021 GCTCTAACTG GAATGGGTTT ATTTTCGTTG AATCGCGAAT TGTTGTTAGA GGTAGCCGCA1081 GCCGTTTTGA AATATGAACT GGTTTTAGTG CAATACGATA AATGA。
2、 一種家蠶糖受體蛋白基因萬m^3編碼的蛋白質，其特征在于其序列如下1 MSRIFSMTRY FGVSTCKPSI AFGWTVILLL MLLAIEVGAI WKIVRLLGGW AVHSTDSRGF 61 TARLSGCIFY GNALLSLILS IKFVSSWEQL SERWSRTETD PGLRLPSDSR IKRRTVLVSA 121 FVMTCACVEH MLSMMSATGF DCPPEEYTER YILSSHGFLV QNDEYNLWLA IPIFIMSKLA 181 TALWNFQDLI IILISMGFTS RYNRLNTYVH RVVMLERNLK EGAQVSSENY MRFQIWRRIR 241 QAYVRQAALV RLVDDQLGAL VLLSNVNNLY FICLQLFLGI KLYYFISLGW LMFRACGVVL 301 AAADVYIHSK KALISLYLCP ELAYNLEIKR LKYQLKNDEV ALTGMGLFSL NRELLLEVAA 361 AVLKYELVLV QYDKO
3、 B附or3基因在培育廣食性家蠶品種中的應用。
全文摘要
一種家蠶糖受體蛋白基因Bmor3，利用已報道的昆蟲(如果蠅)，糖受體蛋白基因序列，在家蠶基因組海量數(shù)據(jù)中進行tBLASTn，預測得到的同源片段中基因完整ORF，通過NCBI上BLAST驗證，最終鑒定得到糖受體蛋白基因Bmor3。利用基因育種方法，可育成廣食性的家蠶品種，打破家蠶寡食性常規(guī)，減小桑樹繁殖的季節(jié)性影響，更大可能的獲取經(jīng)濟價值；通過對家蠶食性所涉及到的功能基因的研究，為研制新型的家蠶人工飼料提供理論依據(jù)。
文檔編號C12N15/12GK101492680SQ200810233309
公開日2009年7月29日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權日2008年12月11日
發(fā)明者代方銀, 向仲懷, 夏慶友, 徐漢福, 趙愛春 申請人:西南大學