微生物催化法生產(chǎn)亞氨基二乙酸及其菌株的制作方法

專利名稱：：微生物催化法生產(chǎn)亞氨基二乙酸及其菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物催化水解亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，及制備過程中所用的一林新菌林——糞產(chǎn)堿桿菌(j/Ca//ge"M/臟幽)ZJUTBIO。(二)
背景技術(shù)：
草甘膦，英文名Glyphosate,商品名農(nóng)達(dá)、農(nóng)民樂等，分子式C3H8N05P,分子量169.08，外觀為白色固體，不溶于有機(jī)溶劑，屬芽后內(nèi)吸非選擇性高效廣譜滅生性除草劑，通過溶解雜草的葉直徑表面蠟質(zhì)層，藥效迅速進(jìn)入植物傳導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生作用，使雜草枯竭死亡，具有廣譜、低毒、無(wú)殘留、內(nèi)吸傳導(dǎo)和優(yōu)良的滅生性等特點(diǎn)，對(duì)植物無(wú)選擇性，一般所有綠色植物，無(wú)論是作物還是雜草，著藥后即被殺傷。近年來，草甘膦一直是全球產(chǎn)量最大的農(nóng)藥原藥除草劑品種，占據(jù)世界農(nóng)藥銷售額首位，且每年以20%左右的速度遞增，預(yù)計(jì)2010年全^求需求量將達(dá)100萬(wàn)噸。目前，世界農(nóng)藥市場(chǎng)銷售額高達(dá)300億美元左右，全球除草劑共約有600個(gè)品種，其中草甘膦占全球除草劑總量高達(dá)30%,市場(chǎng)銷售額約為150億美元，占整個(gè)農(nóng)藥市場(chǎng)的50%。美國(guó)孟山都(Monsanto)化學(xué)公司于20世紀(jì)60年代篩選合成了草甘膦，由于該產(chǎn)品能殺死大多年生深根性難除雜草，低毒、無(wú)殘留、在動(dòng)物和水生物中不積累，入土后隨微生物降解，不會(huì)造成土壤及地下水的污染等優(yōu)異特點(diǎn)，因此一經(jīng)問世即引起世界農(nóng)業(yè)界的廣泛關(guān)注。孟山都公司多年來將草甘膦當(dāng)作主導(dǎo)產(chǎn)品之一，在美國(guó)、西歐、南美等地投入數(shù)十億美元，建立了幾套萬(wàn)噸級(jí)的原藥生產(chǎn)廠，年產(chǎn)量20萬(wàn)噸以上，在世界許多地區(qū)相繼建立了制劑調(diào)配廠。2001年孟山都草甘膦專利到期后，我國(guó)企業(yè)憑借自有技術(shù)迅速發(fā)展和數(shù)家萬(wàn)噸級(jí)草甘膦生產(chǎn)企業(yè)的優(yōu)勢(shì)，已占據(jù)世界草甘膦市場(chǎng)的20%左右份額。草甘膦的合成工藝路線很多，但歸納起來，目前國(guó)內(nèi)外在工業(yè)生產(chǎn)上采用的合成路線主要是兩條亞氨基二乙酸路線(IDA法)和甘氨酸路線。IDA法是用亞氨基二乙酸(IDA)在強(qiáng)酸環(huán)境下(31%鹽酸)與亞磷酸、曱醛縮合反應(yīng)生成雙甘膦(PMIDA),PMIDA再氧化生成草甘膦。反應(yīng)原理<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>IDA法由于具有具有流程短、收率高和不產(chǎn)生污染等諸多優(yōu)勢(shì)，該法生產(chǎn)的草甘膦占世界草甘膦生產(chǎn)總量75%。應(yīng)用IDA法的主要公司是美國(guó)孟山都公司。上世紀(jì)90年代中后期，孟山都專利到期后國(guó)內(nèi)仿制出IDA路線，由于IDA法生產(chǎn)的草甘膦易于進(jìn)入歐美市場(chǎng)，因此最近幾年來國(guó)內(nèi)新建企業(yè)幾乎都是采用IDA路線。IDA法生產(chǎn)草甘膦的關(guān)鍵原料為亞氛基二乙酸，IDA的制備有4種方法氯乙酸法、二乙醇胺脫氬氧化法、氬氰酸法、亞氨基二乙腈化學(xué)水解法。1、氯乙酸法氯乙酸法是國(guó)內(nèi)最早研究和投產(chǎn)的IDA生產(chǎn)方法，用氯乙酸和NH3、Ca(OH)2反應(yīng)制得IDA鈣鹽，再用鹽酸酸化即可得IDA。由于收率低(70%左右)，產(chǎn)品含量低，對(duì)環(huán)境污染大、勞動(dòng)條件差、生產(chǎn)規(guī)模小。已遭淘汰。2、二乙醇胺法用二乙醇胺在高壓、催化劑作用下與NaOH溶液反應(yīng)脫氫，得到亞氨基二乙酸二鈉鹽(MSIDA),再用濃鹽酸酸化制取IDA。反應(yīng)原理如下,CH2CH2OHCH2COONaHNZ+2NaOH^HN\+4H2f\CH2CH20HCH2COOMaCH2COONaCH2COOHH<+2HC1~~H(+2NaClCH2COONaCH2COOH該工藝優(yōu)點(diǎn)是IDA收率高，產(chǎn)品獲國(guó)際認(rèn)可，副產(chǎn)物H2可回收利用。缺點(diǎn)是原料二乙醇胺主要依賴進(jìn)口，由于2004年底二乙醇胺反傾銷后，成本大幅提升，導(dǎo)致此工藝盈利能力下降，價(jià)格高；需要高壓反應(yīng)釜，設(shè)備投資大，安全要求高，能耗大。3、氫氰酸法用HCN、0120和(CH2)6N4經(jīng)過縮合、水解、酸化等反應(yīng)，制得IDA。該工藝是HCN由天然氨和氯合成，濃度較低，HCN劇毒，操作難度大。氫氰酸法是國(guó)外主要采用的工藝，國(guó)內(nèi)氫氰酸的原料來源存在問題，該法在我國(guó)未得到發(fā)展。4、亞氨基二乙腈化學(xué)水解法用NH(CH2CN)2經(jīng)在催化劑作用下經(jīng)NaOH堿解、濃鹽酸酸化合成IDA。該工藝反應(yīng)原理如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>亞氨基二乙腈化學(xué)水解法是近幾年才發(fā)展起來的一種路線，與乙醇胺路線相比，成本低，亞氨基二乙腈廉價(jià)易得，所以亞氨基二乙腈法將逐漸成為國(guó)內(nèi)合成IDA的主導(dǎo)工藝，目前亞氨基二乙腈法制備IDA都是采用化學(xué)水解法。但這種方法存在的問題是用化學(xué)水解法制備1噸亞氨基二乙酸用濃鹽酸酸化至少產(chǎn)生廢水6噸。而且廢水中還含有NH(CH2COONa)2和Na2S04等難處理的鹽類。該法能耗高、反應(yīng)條件苛刻，而且對(duì)i殳備要求高、生產(chǎn)成本高、對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。采用微生物腈水解酶可能快速地將亞氨基二乙腈水解成亞氨基二乙酸。有望開發(fā)反應(yīng)條件溫和、高效、操作簡(jiǎn)便和對(duì)環(huán)境友好的生物催化法新工藝，克服化學(xué)水解法存在的缺點(diǎn)，在提高經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，減小環(huán)境污染，降低能耗。目前國(guó)內(nèi)外尚沒有生物催化水解亞氨基二乙腈生產(chǎn)草甘膦中間體亞氨基二乙酸的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容為克服上述技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種微生物催化水解亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，及制備過程中所用的一林新菌林——糞產(chǎn)堿桿菌(々ecato)ZJUTB10。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種微生物催化水解亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，所述方法包括在以亞氨基乙腈為底物、以糞產(chǎn)堿桿菌ZJUTBIO培養(yǎng)獲得的腈水解酶為催化劑的反應(yīng)體系中，于pH6.0~9.0、1060°C下進(jìn)行水解反應(yīng)，得到所述亞氨基二乙酸。糞產(chǎn)堿桿菌ZJUTBIO可發(fā)酵得到腈水解酶，在通過腈水解酶生物催化水解亞氨基二乙腈得到產(chǎn)物亞氨基二乙酸，反應(yīng)式如CH2CN月青zR解酷^CH2COOHHN、+4H20-^<+訓(xùn)CH2CN、CH2COOH亞氨基二乙腈亞氨基二乙酸糞產(chǎn)堿桿菌(j/ca"ge"^/aecafc)ZJUTB10,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo:M208168,保藏日期2008年10月22日。該菌4朱由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所從土壤中分離獲得。所述反應(yīng)體系中底物亞氨基乙腈初始濃度為0.050.2mol/L。反應(yīng)過程中，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?.01M時(shí)，可以繼續(xù)補(bǔ)入底物亞氨基乙腈至亞氨基乙腈濃度為0.05~0.2mol/L,以達(dá)到連續(xù)生產(chǎn)的效果。所述腈水解酶存在于菌體細(xì)胞中，具體制備時(shí)，可直接將發(fā)酵獲得的含菌體細(xì)胞的發(fā)酵液作為催化劑參與反應(yīng)，也可將菌體細(xì)胞分離后，作為催化劑參與反應(yīng)。本發(fā)明中所述腈水解酶來自糞產(chǎn)堿桿菌ZJUTBIO培養(yǎng)獲得的含酶細(xì)胞，每10ml反應(yīng)體系添加所述含酶濕細(xì)胞量為0.10.5g(其酶活約為525U/g濕細(xì)胞)，反應(yīng)體系中亞氨基乙腈的濃度為0.05~0.2M。酶活的定義lh轉(zhuǎn)化亞氨基二乙腈生成1jaM亞氨基二乙酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。具體的，所述含酶細(xì)胞由如下方法制備得到糞產(chǎn)堿桿菌ZJUTBIO接種至適用于糞產(chǎn)堿桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，于2040。C下培養(yǎng)2496小時(shí)，并在培養(yǎng)開始o(jì)~6小時(shí)時(shí)間內(nèi)加入終濃度為0.1%0.5%的誘導(dǎo)劑，所述誘導(dǎo)劑為下列之一正丁腈、異丁腈、己內(nèi)酰胺，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液經(jīng)離心或膜分離，得到所述含酶細(xì)胞。所述適用于用于本發(fā)明菌種糞產(chǎn)堿桿菌ZJUTB10的培養(yǎng)基，可以是一些含有可以被糞產(chǎn)堿桿菌利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的常規(guī)培養(yǎng)基，液體、固體均可，但是大量工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，液體培養(yǎng)基較為合適。培養(yǎng)基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等。作為碳源的有葡萄糖，醋酸銨，乙腈，乙酸，乳酸，檸檬酸鈉；作為氮源的有肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米漿、蛋白胨、尿素、氨鹽(硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、醋酸胺等)；另可加有氨基酸類(如谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、甘氨酸、曱硫氨酸等)、微生素(VBi、VB2、VB12、Vc、VE、煙酸等)、核酸類(如噪呤、嘧啶及其衍生物等)。用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，還可加入適量的消泡劑，如泡敵等。本發(fā)明中，所述適用于糞產(chǎn)堿桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下醋酸銨0.5%~2.0%，酵母膏0.3%~0.8%,K2HP040.3%~0.8%，MgS040.01%~0.1%,FeSO40.001%~0.01%,NaCl0.05%0.5%,pH7.0~8.5。若沒有特別說明，本發(fā)明中百分比濃度均是質(zhì)量體積百分比濃度(w/v),某組分百分比濃度為1%是指lOOmL溶液中含有該組分lg。發(fā)酵培養(yǎng)可采用培養(yǎng)方式有靜置培養(yǎng)、搖動(dòng)培養(yǎng)、或通風(fēng)攪拌培養(yǎng)等，大量培養(yǎng)菌體時(shí)宜采用深層通風(fēng)攪拌培養(yǎng)。所述發(fā)酵培養(yǎng)可在搖瓶中進(jìn)行，也可在發(fā)酵罐中進(jìn)行。搖瓶培養(yǎng)在三角瓶中裝入適量的發(fā)酵培養(yǎng)基(1070%,v/v),滅菌后用接種針挑入一定量的斜面菌種，在2040。C下，旋轉(zhuǎn)式搖床(100300rpm)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在培養(yǎng)06h的過程中，力口入0.1~0.5%的誘導(dǎo)劑，經(jīng)過2496小時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)，獲得含腈水解酶的發(fā)酵液。發(fā)酵罐培養(yǎng)在種子罐中裝入適量的發(fā)酵培養(yǎng)基(40~70%，v/v)，滅菌后接入一定量的菌種，在溫度2040。C，攪拌轉(zhuǎn)速100300rpm的條件下培養(yǎng)24~72小時(shí)，得到種子液，在50L20M3的發(fā)酵罐中裝入適量的發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(4070%,v/v),實(shí)罐消毒后接入210%(v/v)的種子液，在通氣比0.1-1:1(每分鐘內(nèi)通過的空氣體積與培養(yǎng)液體積之比)，攪拌轉(zhuǎn)速100300rpm，溫度2040°C的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在培養(yǎng)06h的過程中，加入0.1%0.5%的誘導(dǎo)劑，經(jīng)過648小時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)，獲得含腈水解酶的發(fā)酵液。誘導(dǎo)劑可以是正丁腈、異丁腈、己內(nèi)酰胺。得到菌體培養(yǎng)液后可采用離心或過濾等方式分離出菌體細(xì)胞，利用該微生物細(xì)胞或固定化細(xì)胞或從該細(xì)胞中分離出的腈水解酶催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸。發(fā)酵液經(jīng)過離心或膜過濾系統(tǒng)進(jìn)行酶細(xì)胞菌體的收集，用濕菌體或其固定化細(xì)胞作為酶源，然后制備生物催化劑。發(fā)酵液在分離因素(離心機(jī)旋轉(zhuǎn)起來，在離心機(jī)轉(zhuǎn)鼓壁上進(jìn)行分離的物料受到的離心加速度和地球重力加速度g的比值fe3000的條件下離心，棄去上清液，細(xì)胞用去離子水洗滌后在離心，收集濃縮的濕細(xì)胞；或者發(fā)酵液用膜過濾系統(tǒng)進(jìn)行膜分離過濾，并加入2倍發(fā)酵液體積的去離子水洗滌，收集濃縮的濕細(xì)胞，收集的含酶細(xì)胞可以直接作為催化劑。其中的膜過濾系統(tǒng)可以是中空纖維膜或巻式膜或陶瓷膜或超濾膜。亞氨基二乙腈溶液的生物催化反應(yīng)可在水或pH69的磷酸鹽緩沖液或水-有機(jī)介質(zhì)或微水有機(jī)反應(yīng)介質(zhì)中加入生物催化劑，加入底物亞氨基二乙腈進(jìn)行反應(yīng)，pH控制在6.0-9.0之間，反應(yīng)溫度控制在1060。C之間，攪拌速度控制在50500rpm之間。反應(yīng)方式可以是批式反應(yīng)或者連續(xù)式反應(yīng)。在批式反應(yīng)中底物可一次性加入，或者間歇分多次加入，或流加，在任何時(shí)刻都必須保證底物的加入量不會(huì)使反應(yīng)液中的底物濃felM,反應(yīng)時(shí)間根據(jù)反應(yīng)的具體情況而定，反應(yīng)結(jié)束時(shí)應(yīng)保證底物濃度盡可能低，這可以通過停止加料后延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，或通過補(bǔ)加少量生物催化劑反應(yīng)一段時(shí)間來達(dá)到這一要求，反應(yīng)結(jié)束后通過離心或膜過濾系統(tǒng)分離得到反應(yīng)清液；在連續(xù)反應(yīng)中，底物可一次性加入，或間歇分多次加入，或流加，在任何時(shí)刻都必須保證底物的加入量不會(huì)使反應(yīng)液中的底物濃度三1M,當(dāng)產(chǎn)物濃度累積達(dá)到一定值20.09M(以亞氨基二乙酸計(jì))時(shí)，可通過膜過濾系統(tǒng)一次性，或者分多次間歇地，或者連續(xù)地分流出反應(yīng)清液，同時(shí)可一次性，或者間歇分多次地，或者連續(xù)地不加反應(yīng)介質(zhì)和底物，并根據(jù)反應(yīng)情況，可一次性，或者間歇分多次地?；蛘哌B續(xù)性的補(bǔ)加新的生物催化劑，以保證反應(yīng)可連續(xù)進(jìn)行。具體的，所述應(yīng)用方法如下(1)糞產(chǎn)堿桿菌ZJUTB10接種至種子培養(yǎng)基，30°C、200rpm下培養(yǎng)24小時(shí)，得到種子液；所述種子培養(yǎng)基組成如下醋酸4妄1%,酵母膏0.5%,K2HP040.5%,MgS040.02%,FeS040.003%,NaC10.1%,pH7.5;(2)發(fā)酵培養(yǎng)基以6%體積比接種量接種種子液，30。C下進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)開始6小時(shí)時(shí)加入終濃度為0.3%的正丁腈，發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間4896小時(shí)，得到發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下醋酸銨1%,酵母膏0.5%,K2HP040.5%，MgS040.02%,FeS040.003%,NaC10.1%，pH7.5;(3)取發(fā)酵液，膜過濾分離得到的菌體細(xì)胞以去離子水洗滌，得到細(xì)胞液，取細(xì)胞液以去離子水稀釋至細(xì)胞濃度為10~50g/L,加入底物亞氨基乙腈至亞氨基乙腈濃度為0.05~0.2mol/L,于2040°C、100300rpm下進(jìn)行水解反應(yīng)2472小時(shí)，水解反應(yīng)結(jié)束后，于水解液中得到所述亞氨基二乙酸。本發(fā)明中產(chǎn)物的分析測(cè)定方法取0.1mL水解液，力。1mL0.5mol/L的NaHC03溶液、0.4mL1%的2，4-二硝基氟苯-乙腈溶液和lmL蒸餾水，在60。C下避光反應(yīng)30min后，衍生化完后，再加7.5mL0.2mol/LpH為7的磷酸緩沖液。然后進(jìn)行HPLC分析4全測(cè)，色譜柱EliteCl8色譜柱(250nmx4.6nm);流動(dòng)相曱醇乙酸-乙酸鈉水溶液(曱醇與乙酸-乙酸鈉水溶液體積比為55:45，乙酸、乙酸鈉物質(zhì)的量濃度均為0.05mol/L);流速1.0mL/min;-險(xiǎn)測(cè)波長(zhǎng)為365nm;柱溫為30°C。本發(fā)明技術(shù)與現(xiàn)有的技術(shù)比較具有明顯的優(yōu)點(diǎn)1)廢水產(chǎn)量少。用化學(xué)水解法制備1噸亞氨基二乙酸如果用濃硫酸酸化至少產(chǎn)生廢水5噸，用濃鹽酸酸化至少產(chǎn)生廢水6噸。而且濃碌u酸酸化法廢水中還含有NH(CH2COONa)2和Na2S04等難處理的鹽類。如果用腈水解酶生物催化法生產(chǎn)亞氨基二乙酸，廢水中難處理的雜質(zhì)含量少，更利于實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)。2)反應(yīng)條件溫和?；瘜W(xué)水解法需要在100。C左右進(jìn)行，必須配備加熱和溫控裝置，反應(yīng)條件苛刻，能耗高而且對(duì)設(shè)備要求高。而生物催化法一般都是在常溫下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和設(shè)備成本相對(duì)較低。3)成本低?；瘜W(xué)水解法的原料除了亞氨基二乙腈外還有NaOH濃溶液、濃^^酸或濃鹽酸，所需原料多；生產(chǎn)成本高而生物催化法一:l殳只需亞氨基二乙腈作為原料和產(chǎn)腈水解酶細(xì)胞作為催化劑，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率都可達(dá)95%以上，原料簡(jiǎn)單易得，轉(zhuǎn)化率高，成本低。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在反應(yīng)過程中廢水產(chǎn)量少，污染少；反應(yīng)條件溫和、能耗低；成本低，轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:糞產(chǎn)堿桿菌(j/ca//gwes/aecafc)CCTCCNo:M208168的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。分別配制搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基A、B、C、D，其培養(yǎng)基組成如下A:醋酸銨0.5%，酵母膏0.3%,K2HPO40.3%,MgSO40.01%,FeS040.001%,NaC10.05%，用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到7.0。B:醋酸銨1%,酵母膏0.5%,K2HPO40.5%，MgSO40.02%,FeS040.003%,NaC10.1%,用2M的鹽酸或2M的氬氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到7.5。C:醋酸銨2.0%,酵母膏0.5%，K2HPO40.8%,MgSO40.05%，F(xiàn)eS040.003%,NaCl0.03%,用2M的鹽酸或2M的氪氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到8.0。D:醋酸銨2.0%,酵母膏0.8%,K2HPO40.8%,MgSO40.1%，F(xiàn)eS040.01%,NaC10.5%,用2M的鹽酸或2M的氬氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到8.5。分別將以上配制好的培養(yǎng)基以lOOmL—份倒入4個(gè)250mL搖瓶中，121。C滅菌20分鐘。冷卻室溫后分別接種糞產(chǎn)堿桿菌(爿/^//取"^1/^<^/&)CCTCCNo:M208168到各個(gè)培養(yǎng)基中，于30。C，200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)，在培養(yǎng)剛開始時(shí)加入0.3g的己內(nèi)酰胺作為誘導(dǎo)劑，發(fā)酵培養(yǎng)48h結(jié)束。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集發(fā)酵液，6000卬m離心收集菌體，分別稱取O.lg濕菌體置于含有105mM亞氨基乙腈的10ml反應(yīng)體系中，在30。C和200rpm的攪拌速度下反應(yīng)4h，加入濃鹽酸溶液終止反應(yīng)，通過HPLC方法測(cè)定反應(yīng)液中亞氨基二乙酸的量，計(jì)算出每克濕細(xì)胞中的酶活(U),得到的結(jié)果見表l:表l:搖瓶發(fā)酵液的濕細(xì)胞酶活<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例2:糞產(chǎn)石成桿菌(v4/ca^gew&y/"ec"fc)CCTCCNo:M208168的發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)配制種子培養(yǎng)基醋@吏銨1%,酵母膏0.5%,K2HPO40.5%,MgS040.02%,FeS040.003%，NaCl0.1%，用2M的鹽酸或2M的氬氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到7.5。分別配制發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基a、b、c、d,其發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下a:醋酸銨0.5%,酵母膏0.3%,K2HPO40.3%,MgSO40.01%,FeS040.001%,NaC10.05%,用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到7.0。b:醋酸銨1%，酵母膏0.5%，K2HPO40.5%，MgSO40.02%,FeS040.003%,NaC10.1%,用2M的鹽酸或2M的氬氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到7.5。c:醋酸銨2.0%,酵母膏0.5%,K2HPO40.8%,MgSO40.05%，F(xiàn)eS040,003%,NaC10.03%,用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到8.0。d:醋酸銨2.0%,酵母膏0.8%,K2HPO40.8%,MgSO40.1%,FeS040.01%,NaCl0.5%,用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到8.5。在5L種子罐中裝入3L的種子培養(yǎng)基，滅菌后接入菌種，在溫度30°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm的條件下培養(yǎng)24h，得到種子液；在50L的發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基30L,實(shí)罐消毒后接入1.8L的種子液，在通氣比0.3:1,攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,罐壓0.05Mpa,溫度30。C的條件下，在培養(yǎng)到6h時(shí)加入90g的正丁腈作為誘導(dǎo)劑，發(fā)酵培養(yǎng)過程中每隔24h分別收集發(fā)酵液，6000rpm離心收集濕菌體細(xì)胞測(cè)定酶活(測(cè)定方法同實(shí)施例l),結(jié)果見表2。表2.發(fā)酵罐發(fā)酵液濕細(xì)胞的酶活<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例3:發(fā)酵液離心或膜過濾取實(shí)施例2中b培養(yǎng)基發(fā)酵得到的發(fā)酵液2L,分別用低溫高速離心機(jī)離心(在4。C，12000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min)、中空纖維膜過濾(流量150mL/min,壓力0.8Kg/cm2)、巻式膜過濾(流量150mL/min,壓力16Kg/cm2)、陶覺膜過濾(流量150mLZmir"壓力4Kg/cm2)或平板超濾膜(Ultra-fla)過濾(流量150mL/min，壓力3Kg/cm2)方法處理發(fā)酵液。然后用4L去離子水洗滌細(xì)胞，收集濕細(xì)胞測(cè)定酶活(測(cè)定方法同實(shí)施例1)，結(jié)果見表3。表3:發(fā)酵液處理后的濕細(xì)胞酶活發(fā)酵液的處理方法處理后的含酶濕細(xì)胞酶活U/g<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例4:取實(shí)施例3低溫高速離心處理方法得到的濕菌體分別加入lOOmL水中，使?jié)窬w的濃度為30g/L,加入不同量的底物亞氨基二乙腈，使亞氨基二乙腈的最終濃度分別為0.01M,0.05M，O.IM，0.15M，0.2M。于30。C和200rpm條件下反應(yīng)24h，用HPLC測(cè)定方法測(cè)定反應(yīng)液中亞氨基二乙酸的濃度。結(jié)果見表4:表4:濃縮細(xì)胞在不同底物濃度下的催化活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例5:取實(shí)施例3低溫高速離心處理方法得到的濕菌體3g,分別加入lOOmL水中，濕菌體的濃度為30g/L，，各加入底物終濃度為0.2M的亞氨基二乙腈，分別在20。C,30°C,40。C條件下，200rpm轉(zhuǎn)速反應(yīng)96h。用HPLC測(cè)定方法測(cè)定反應(yīng)液中氨基二乙酸的濃度。結(jié)果見表5。表5:濃縮細(xì)胞在不同的溫度條件下的催化活性溫度(°c)反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化體系中亞氨基二乙酸的濃度(mM)201403019540180實(shí)施例6:取按照實(shí)施例3中空纖維膜過濾處理方法得到的濃縮細(xì)胞，用不同pH的磷酸鹽緩沖液稀釋至2L,濕細(xì)胞濃度約為30g/L,分別取50mL,各加入終濃度為0.1M的底物亞氨基二乙腈，于30。C和200rpm條件下反應(yīng)48h,用HPLC測(cè)定方法測(cè)定反應(yīng)液中亞氨基二乙酸的濃度。結(jié)果見表6。表6.濃縮細(xì)胞在不同的pH條件下的催化活性pH反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化體系中亞氨基二乙酸的濃度(mM)684799899971實(shí)施例7:取按照實(shí)施例3陶瓷膜過濾方法得到的含酶細(xì)胞40g,用2L水稀釋，裝入于3L的三口反應(yīng)瓶中，加入底物亞氨基二乙腈的濃度為0.05M,于30°C和200rpm條件下反應(yīng)，通過HPLC色語(yǔ)跟蹤分析，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀贠.OIM時(shí)，加入底物亞氨基二乙腈，使其終濃度達(dá)到0.05M;反應(yīng)72小時(shí)，底物累計(jì)加入次數(shù)為9次，反應(yīng)后HPLC色譜分析反應(yīng)結(jié)果，底物亞氨基二乙腈殘留濃度〈0.01M,終產(chǎn)物濃度0.4M，亞氨基二乙酸產(chǎn)率89.5%。權(quán)利要求1.一種微生物催化制備亞氨基二乙酸的方法，所述方法包括在以亞氨基乙腈為底物、以糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTB10培養(yǎng)獲得的腈水解酶為催化劑的反應(yīng)體系中，于pH6.0～9.0、10～60℃下進(jìn)行水解反應(yīng)，得到所述亞氨基二乙酸。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中底物亞氨基乙腈初始濃度為0.050.2mol/L。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于反應(yīng)過程中底物亞氨基乙腈濃度低于0.01mol/L時(shí)，繼續(xù)補(bǔ)入底物亞氨基乙腈至亞氨基乙腈濃度為0.050.2mol/L。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述腈水解酶來自糞產(chǎn)堿桿菌ZJUTB10培養(yǎng)獲得的含酶細(xì)胞，所述含酶細(xì)胞添加量以含酶細(xì)胞濕重計(jì)為10~50g/L。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征所述反應(yīng)在水中或pH69的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述含酶細(xì)胞由如下方法制備得到糞產(chǎn)堿桿菌ZJUTB10接種至適用于糞產(chǎn)堿桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，于2040。C下培養(yǎng)2496小時(shí)，并在培養(yǎng)開始06小時(shí)時(shí)間內(nèi)加入終濃度為0.1%~0.5%的誘導(dǎo)劑，所述誘導(dǎo)劑為下列之一正丁腈、異丁腈、己內(nèi)酰胺，培##到的發(fā)酵液經(jīng)離心或膜分離，得到所述含酶細(xì)胞。7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述適用于糞產(chǎn)堿桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下醋酸銨0.5%2.0%，酵母膏0.3%~0.8,K2HP040.3%0.8%,MgS040.01%~0.1%，F(xiàn)eS040.001%~0.01%，NaCl0.05%~0.5%,pH7.08.5。8.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)糞產(chǎn)堿桿菌ZJUTB10接種至種子培養(yǎng)基，30°C、200rpm下培養(yǎng)24小時(shí)，得到種子液；所述種子培養(yǎng)基組成如下醋酸4妄1%，酵母膏0.5%,K2HPO40.5%,MgSO40.02%,FeS040.003%，NaCl0.1%,pH7.5;(2)發(fā)酵培養(yǎng)基以6%體積比接種量接種種子液，30。C下進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)開始6小時(shí)時(shí)加入0.3°/。的正丁腈，發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間4896小時(shí)，得到發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下醋酸銨1%,酵母膏0.5%,K2HPO40.5%,MgSO40.02%，F(xiàn)eS040.003%，NaCl0.1%,pH7.5;(3)取發(fā)酵液，膜過濾分離得到的菌體細(xì)胞以去離子水洗滌，得到細(xì)胞液，取細(xì)胞液以去離子水稀釋至細(xì)胞濃度為10~50g/L，加入底物亞氨基乙腈至亞氨基乙腈濃度為0.05~0.2mol/L,于20~40°C、100~300rpm下進(jìn)行水解反應(yīng)2472小時(shí)，水解反應(yīng)結(jié)束后，于水解液中得到所述亞氨基二乙酸。9.糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTBIO，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號(hào)CCTCCNo:M208168,保藏日期2008年10月22日。全文摘要本發(fā)明公開了一種生物催化生產(chǎn)草甘膦合成的關(guān)鍵中間體亞胺基二乙酸的方法及其過程中所用的新菌株，本方法以亞胺基二乙腈為原料，以通過發(fā)酵培養(yǎng)糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTB10而得到的具有腈水解酶活性的微生物酶為催化劑，在一定的條件下進(jìn)行水解反應(yīng)，得到產(chǎn)物亞胺基二乙酸。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在反應(yīng)過程中廢水產(chǎn)量少，污染少；反應(yīng)條件溫和、能耗低；成本低，轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12P13/00GK101392276SQ20081012219公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年11月10日優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日發(fā)明者徐建妙,柳志強(qiáng),沈寅初,薛亞平,鄭裕國(guó)申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)