專利名稱：一種小單孢菌菌株、制備方法及其應用的制作方法
一種小單孢菌菌株、制備方法及其應用技術領域：
本發(fā)明涉及一種小單孢菌菌株，該小單孢菌菌株的制備方法，及該小單孢菌菌株的應用。
背景技術：
小單孢菌屬(Micromonospora)屬于放線菌目小單孢菌科(Micromonosporaceae),因菌絲上著生單個孢子而得名，該屬菌為革蘭氏陽性菌，不抗酸，好氧或微好氣，化能異養(yǎng)菌，基內(nèi)菌絲發(fā)達，分枝有隔。在基內(nèi)菌絲上長單個孢子，有?；驘o梗，孢子不游動。小單孢菌是抗生素的重要來源。臨床上應用的許多氨基糖抗生素如慶大霉素等都是小單孢菌產(chǎn)生的。目前從該屬發(fā)現(xiàn)的抗生素種 類僅次于鏈霉菌，達450種以上。1987年從Caliche 土壤樣品中分離的棘孢小單孢菌Micromonospora echinospora subsp. calichensis產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的烯二塊類抗腫瘤抗生素CalicheamicinYltj該化合物細胞毒性高，至少是多柔比星的1000倍。該藥物的第一個抗體靶向化療藥物CMA-676 (Mylotarg) 以在臨床應用，它可治療嚴重、快速發(fā)展的致命性疾病急性骨髓性白血病(acute myeloid leukaemia)。從斐濟海鞘(Polysyncratonlithostrotum)中分離到小單抱菌Micromonospora Iomaiviticins,它產(chǎn)生抗腫瘤和細胞毒的抗生素Lomaiviticins即Lomaiviticins A和B (重氮苯并荷葡萄糖苷對稱二聚體)。Lomaiviticins 是很強的破壞 DNA 的藥物,BIA〈0. lng/spot。Lomaiviticins A 對許多腫瘤細胞株作用強，IC50為0. 01-98ng/ml，細胞毒作用方式與已知DNA損害劑多柔比星、絲裂霉素不同。它還具有很強的抗金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的作用，MIC為6-25ng/spot,已進入I期臨床實驗。綜上所述，在小單孢菌中已發(fā)現(xiàn)了一些具有重要商業(yè)價值的次級代謝產(chǎn)物，它們是新生素和其他生物活性物質(zhì)的重要微生物來源。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題之一在于提供一種小單孢菌菌株。本發(fā)明是通過以下技術方案解決上述技術問題之一的一種小單孢菌菌株，所述菌株為小單孢菌菌株 FM07-0019 (Mciromonospora sp. FM07-0019)，于 2012 年 8 月 23 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 6474。本發(fā)明所要解決的技術問題之二在于提供一種所述的小單孢菌菌株的分離方法，充分利用中國的海洋藥物資源，簡單易行。本發(fā)明是通過以下技術方案解決上述技術問題之二的一種所述的小單孢菌菌株的分離方法，包括以下步驟步驟100 :將2克采集于智利南部43° 32 ^ (V S，72° 52f Of W，水深20米的海底海泥用無菌陳海水稀釋成KT1和10_2倍；步驟200 :分別取原液及稀釋過的樣品懸液0. ImL涂布于燕麥瓊脂培養(yǎng)基進行菌種分離，并于30°C下培養(yǎng)2周，得到小單孢菌菌FM07-0019。
進一步地，所述燕麥瓊脂培養(yǎng)基組分為燕麥粉2%、瓊脂2%、重鉻酸鉀50mg/L、微量元素溶液0. lml/100ml,其余成分為水,且所述水包括質(zhì)量比為I : I的蒸懼水和海水；所述微量元素溶液包括如下組分=FeSO4 7H200. lg, MnCl2 4H20 0. lg, ZnSO4 7H20 0. lg,蒸鍛水IOOOmlo本發(fā)明所要解決的技術問題之三在于提供一種所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類化合物的方法，通過提取分離該新菌株的發(fā)酵液獲得了一種能夠抑制腫瘤的大環(huán)內(nèi)脂類化合物。本發(fā)明是通過以下技術方案解決上述技術問題之三的一種所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類化合物的方法，包括以下步驟(I)制備小單孢菌菌株FM07-0019發(fā)酵液將一鉬環(huán)小單孢菌菌株FM07-0019的燕麥瓊脂斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基，于溫度35°C，轉(zhuǎn)速220rpm/min下培養(yǎng)48h ;然后按10%的移種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，并于溫度28°C，轉(zhuǎn)速220rpm/min下振蕩培養(yǎng)96 120h ； (2)提取將⑴中獲得的小單孢菌菌株FM07-0019發(fā)酵液于4500rpm離心15min以獲得上清液和菌絲體；所述菌絲體用2倍于菌絲體體積的甲醇浸泡，經(jīng)減壓濃縮后再用水稀釋；將稀釋液與上清液合并后一起流經(jīng)大孔吸附樹脂Hp-20，再用甲醇洗出并濃縮，最后濃縮物用等體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得浸膏狀提取物；(3)分離將⑵中獲得的提取物采用正相硅膠柱層析，用體積比100 0，98 2，95 5，90 10，80 20，70 30，50 50，0 100 的氯仿-甲醇溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測，并收集Rf值為0.6的餾份；再經(jīng)S印hadex LH-20凝膠柱層析，用體積比I: I的甲醇-氯仿洗脫，薄層層析檢測，并收集Rf值為0. 6的餾份；再經(jīng)C18反相柱層析，以甲醇-水梯度洗脫，流速為lml/min，且所述甲醇-水梯度為甲醇含量在30min內(nèi)從0到100% ;薄層層析檢測，并收集Rf值為0. 6的餾份；再將餾份經(jīng)制備型高壓液相色譜進行分離，以60%乙腈溶液洗脫，流速為I. 5ml/min，得到大環(huán)內(nèi)脂類化合物。進一步地，所述薄層層析的展層劑為體積比9:1氯仿-甲醇溶劑。進一步地，所述種子培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉I. 5%，葡萄糖0. 5%，蛋白胨0. 5%酵母粉 0. 5%MgS04 7H20 0. 05%, NaCl 0. 05%, (NH4) 2S040 . 05%, K2HPO4O. 05%, CaCO3O. 1%，蒸餾水配制，pH為7. 5 ;且所述種子培養(yǎng)基中各組分的百分數(shù)均為質(zhì)量分數(shù)。進一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉4%葡萄糖0. 5%，蛋白胨0. 5%花生餅粉 2. 0%MgS04 7H20 0. 05%, K2HPO4O. 05%, CaCO3O. 1%，蒸餾水配制，pH 為 7. 5，且所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的百分數(shù)均為質(zhì)量分數(shù)。本發(fā)明所要解決的技術問題之四在于提供一種所述的小單孢菌菌株制備的大環(huán)內(nèi)脂類化合物，其具有很強的抗腫瘤活性。本發(fā)明是通過以下技術方案解決上述技術問題之四的一種所述的小單孢菌菌株制備的大環(huán)內(nèi)脂類化合物，結(jié)構(gòu)式如下
權利要求
1.一種小單孢菌菌株，其特征在于所述菌株為小單孢菌菌株FIM07-0019 (Mciromonospora sp. FM07-0019)，于 2012 年 8 月 23 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 6474。
2.一種如權利要求I所述的小單孢菌菌株的分離方法，其特征在于包括以下步驟 步驟100 :將2克采集于智利南部43° 32' 0' S，72° 52' 0' W，水深20米的海底海泥用無菌陳海水稀釋成KT1和10_2倍； 步驟200 :分別取原液及稀釋過的樣品懸液0. ImL涂布于燕麥瓊脂培養(yǎng)基進行菌種分離，并于30°C下培養(yǎng)2周，得到小單孢菌菌株FM07-0019。
3.如權利要求2所述的小單孢菌菌株的分離方法，其特征在于所述燕麥瓊脂培養(yǎng)基組分為燕麥粉2%、瓊脂2%、重鉻酸鉀50mg/L、微量元素溶液0. lml/100ml，其余成分為水，且所述水包括質(zhì)量比為I : I的蒸餾水和海水；所述微量元素溶液包括如下組分FeSO4 7H20 0. lg, MnCl2 4H20 0. lg, ZnSO4 7H20 0. lg，蒸餾水 1000ml。
4.一種利用權利要求I所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類化合物的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)制備小單孢菌菌株FM07-0019發(fā)酵液將一鉬環(huán)小單孢菌菌株FM07-0019的燕麥瓊脂斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基，于溫度35°C，轉(zhuǎn)速220rpm/min下培養(yǎng)48h ;然后按10%的移種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，并于溫度28°C，轉(zhuǎn)速220rpm/min下振蕩培養(yǎng)96 120h ； (2)提取將(I)中獲得的小單孢菌菌株FM07-0019發(fā)酵液于4500rpm離心15min以獲得上清液和菌絲體；所述菌絲體用2倍于菌絲體體積的甲醇浸泡，經(jīng)減壓濃縮后再用水稀釋；將稀釋液與上清液合并后一起流經(jīng)大孔吸附樹脂Hp-20，再用甲醇洗出并濃縮，最后濃縮物用等體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得浸膏狀提取物； (3)分離將(2)中獲得的提取物采用正相硅膠柱層析，用體積比100 0,98 2，95 5，90 10，80 20,70 30,50 50，0 100的氯仿-甲醇溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測，并收集Rf值為0.6的餾份；再經(jīng)S印hadex LH-20凝膠柱層析，用體積比I : I的甲醇_氯仿洗脫，薄層層析檢測，并收集Rf值為0. 6的餾份；再經(jīng)C18反相柱層析，以甲醇-水梯度洗脫，流速為lml/min，且所述甲醇-水梯度為甲醇含量在30min內(nèi)從0到100%;薄層層析檢測，并收集Rf值為0. 6的餾份；再將餾份經(jīng)制備型高壓液相色譜進行分離，以60%乙腈溶液洗脫，流速為I. 5ml/min，得到大環(huán)內(nèi)脂類化合物。
5.如權利要求4所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類化合物的方法，其特征在于所述薄層層析的展層劑為體積比9I氯仿-甲醇溶劑。
6.如權利要求4所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類化合物的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉1.5%，葡萄糖0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，酵母粉0. 5 %，MgSO4 7H20 0. 05%, NaCl 0. 05%, (NH4)2SO4O. 05%, K2HPO4 0. 05%, CaCO3 0. 1%，蒸餾水配制，pH為7. 5 ;且所述種子培養(yǎng)基中各組分的百分數(shù)均為質(zhì)量分數(shù)。
7.如權利要求4所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類化合物的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉4 %，葡萄糖0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，花生餅粉2. 0 %，MgSO4 7H20 0. 05%, K2HPO4 0. 05%, CaCO3 0. 1%，蒸餾水配制，pH 為 7. 5，且所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的百分數(shù)均為質(zhì)量分數(shù)。
8.一種利用權利要求I所述的小單孢菌菌株制備的大環(huán)內(nèi)脂類化合物，其特征在于結(jié)構(gòu)式如下
全文摘要
本發(fā)明提供了一種小單孢菌菌株、制備方法及其應用，本發(fā)明從海洋沉積物中分離并篩選到一株抗腫瘤活性很好的放線菌，該放線菌為小單孢菌菌株FIM07-0019(Mciromonospora sp.FIM07-0019)，并利用該小單孢菌菌株FIM07-0019制備出發(fā)酵液，再將所述發(fā)酵液經(jīng)提取、正相硅膠柱層析、C18反相柱層析等處理，提取分離得到對腫瘤細胞具有細胞毒活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，該大環(huán)內(nèi)酯類化合物為研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了天然藥物化學研究基礎和先導化合物，對開發(fā)利用中國的海洋藥物資源具有重要價值。
文檔編號C12N1/20GK102965300SQ20121034785
公開日2013年3月13日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權日2012年9月19日
發(fā)明者彭飛, 連云陽, 王傳喜, 謝陽, 林如, 江宏磊, 江紅 申請人:福建省微生物研究所