專利名稱：：一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法。技術(shù)背景栽培稻是世界上最重要的糧食作物之一，在其11,500多年的栽培稻馴化歷史中為適應(yīng)不同的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，栽培稻形成了豐富的遺傳多樣性和明顯的遺傳分化，產(chǎn)生了秈稻(&o^'ca)和粳稻(y邵o/^'c3)兩個(gè)不同的生態(tài)型(MorishimaH,OkaHI.Phylogeneticdifferentiationofcultivatedrice.XXII.NumerableevaluationoftheIndica-Japonicadifferentiation.JapaneseJournalofBreeding,1981，31:402—413;GlaszmannJC.IsozymesandclassificationofAsianricevarieties.TheoreticalandAppliedGenetics,1987，74:21-30;WangZY，TanksleySD.Restrictionfragmentlengthpolymorphismin。iyz<asa"VaL.Genome,1989，32:1113-1118;BlairMW，Panaud0,McCouchSR.Inter-simplesequencerepeat(ISSR)amplificationforanalysisofmicrosatellitemotiffrequencyandfingerprintinginrice(6ryz3sa"raL).TheoreticalandAppliedGenetics，1999，98(5):780-782.))。它們之間在許多形態(tài)和生理性狀上存在著明顯的差異(MorishimaH，OkaHI.Phylogeneticdifferentiationofcultivatedrice.Numericalevaluationsofthei"c/2'ca-^3;o/n'cadifferentiation.Jpn.J.Breed,1981，31:402—413;WANGXiang—Kun,CHENGKan—Sheng，HUANNai—Wei，LU0Jun，LUYi—Xuan,LIUGuang-Rong.StudyontwoimportantricetypesconcerningtheoriginanddifferentiationofAsiancultivatedrice.ActaGeneticaSinica，1987,14(4):262-270.)。然而，水稻的秈-粳分化是一個(gè)緩慢的進(jìn)化過(guò)程，在許多水稻地方種中存在著典型的秈稻或粳稻，但也存在秈粳分化不明顯的中間型，對(duì)于這些類(lèi)型很難用傳統(tǒng)的方法來(lái)鑒定，更難研究水稻的秈粳分化程度。因此，開(kāi)發(fā)新型的Marker基因及其分子標(biāo)記來(lái)準(zhǔn)確鑒定秈稻和粳稻，并且用其研究水稻的進(jìn)化非常必要。Sir2(silenceinformationregulator)基因家族是一種保守的從古細(xì)菌到哺乳動(dòng)物都存在的NAD+依賴的組蛋白/非組蛋白去乙酰化酶。在酵母中，Sir2連同與它相互作用的幾個(gè)蛋白質(zhì)在基因沉默、基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞壽命以及代謝調(diào)節(jié)上起著不可缺少的作用。其主要的作用機(jī)制是熱量限制降低了抑制物煙酰胺的濃度，從而激活了Sir2的組蛋白去乙酰化功能。在哺乳動(dòng)物中，有7個(gè)Sir2同源基因，分別命名為SIRT1到SIRT7。其中SIRT1研究的最多，它在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期控制、抑制細(xì)胞凋亡、抵抗氧化逆境和延長(zhǎng)細(xì)胞壽命方面起著重要作用(王麗輝，金煒元，陳勇，王君暉.Sir2基因家族的功能和作用機(jī)制.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2006，6:822-826.)。而在植物中，SIR2基因數(shù)量較少。在水稻中僅有2個(gè)SIR2基因，即&6777和fls5Vf么2007年，HuangLM等對(duì)其中的1個(gè)SIR2基因(&577V)進(jìn)行了研究，研究結(jié)果認(rèn)為基因Os5V77過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)水稻對(duì)氧化脅迫的抗性。關(guān)于(9s57iT2(L0C—0sl2g07950)的功能研究未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法。本發(fā)明所提供的輔助篩選秈稻和粳稻的方法，是檢測(cè)待測(cè)水稻中是否缺失GenBankaccessionAL731882中自5，末端第67843-67878位的核苷酸序列，若缺失，則待測(cè)水稻為候選秈稻，若不缺失，則待測(cè)水稻為候選粳稻。所述缺失具體可通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。所述PCR擴(kuò)增具體可擴(kuò)增包含GenBankaccessionAL731882中自5，末端第67843-67878位核苷酸序列的片段。所述PCR擴(kuò)增中所用的引物，具體可為如下的引物:上游或下游引物與GenBankaccessionAL731882中自5，末端第67843-67878位的核苷酸序列互補(bǔ)或相同。其中，所用引物具體還可為如下的引物:其中的一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。實(shí)際應(yīng)用中，可采用的一種具體輔助篩選秈稻和粳稻的方法如下以待測(cè)水稻的基因組DNA為模板，用核苷酸序列分別是序列表中序列3和序列4的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),若產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上顯示為位于230-396bp之間的一條帶,則待測(cè)水稻為候選粳稻，若產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上顯示為沒(méi)有位于230-396bp之間的一條帶，則待測(cè)水稻為候選秈稻。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一對(duì)用于輔助篩選秈稻和粳稻的引物。本發(fā)明所提供的一對(duì)用于輔助篩選秈稻和粳稻的引物為其中的一條序列如序列表中序列3所示，另一條序列如序列表中序列4所示。本發(fā)明輔助篩選水稻秈粳亞種的方法可在發(fā)育早期篩選秈稻和粳稻品種或地方種，了解秈稻和粳稻的遺傳分化程度，對(duì)秈、粳稻雜種優(yōu)勢(shì)的利用和培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的雜交稻具有重要指導(dǎo)作用，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，為水稻秈粳亞種種質(zhì)的鑒定提供了一種快捷的選擇方法。圖1為Marker基因L0C—Osl2g07950在日本晴和93-11中的基因組序列比對(duì)結(jié)果(來(lái)自TIGR網(wǎng)站)及引物SIR2-2、專用引物SIR2-3所在基因組序列上的位置示意圖。圖2A為以日本晴和93-11的基因組DNA為模板，在引物SIR2-2引導(dǎo)下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型。圖2B為以日本晴和93-11的基因組DNA為模板，在引物SIR2-3引導(dǎo)下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型。圖3為以16個(gè)水稻品種和地方種的基因組DNA為模板，在專用引物SIR2-3引導(dǎo)下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的水稻品種和地方種均來(lái)自國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)。實(shí)施例1、基因L0C—0sl2g07950在秈稻和粳稻中不同表達(dá)模式的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證首先通過(guò)對(duì)秈粳稻在不同發(fā)育階段和不同組織部位的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了挖掘分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因LOC—Osl2g07950在GengChip數(shù)據(jù)中有兩組探針，而且這兩組探針在秈粳稻中的表達(dá)模式相反，探針P1在秈稻中表達(dá)量極低甚至不表達(dá)，而在粳稻中的表達(dá)量極高，而另一探針P2卻在秈稻中的表達(dá)量極高，而在粳稻中的表達(dá)量極低。根據(jù)前人的研究結(jié)果，造成基因表達(dá)量差異的主要原因可能是堿基序列的差異(InDel)，或受其它基因的調(diào)控。因此，利用比較基因組學(xué)的方法，首先對(duì)基因L0C—0sl2g07950在秈稻品種93-11和粳稻品種日本晴中的基因組序列進(jìn)行了核苷酸序列比對(duì)(Blast)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在93-11中，此基因3'-UTR區(qū)域存在一段序列的缺失(圖1)。實(shí)施例2、用于輔助篩選秈稻和粳稻的引物的設(shè)計(jì)為進(jìn)一步驗(yàn)證93-11與日本晴間是否存在基因組水平上的差異，依據(jù)日本晴序列，在二者可能存在基因組差異的區(qū)域設(shè)計(jì)引物SIR2-2，其中一個(gè)引物序列如序列表中序列1所示，另一個(gè)引物序列如序列表中序列2所示，并分別以日本晴和93-11的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為水稻基因組DNA模板20ng，TaqPlusDNA聚合酶0.5U，2.10XPCR緩沖液(lOOmMTrisHClpH9.0，500mMKCl，15mMMg2+，1%TritonX-100)，IOOMMdNTPs，正向引物4mM，反向引物4MM，用DEPC水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20W。PCR反應(yīng)條件為先94°C5min;隨后94。C30sec，58°C45sec，72°Clrain30sec，共35個(gè)循環(huán)；再72°C10min。通過(guò)濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有目的條帶。檢測(cè)結(jié)果表明引物SIR2-2在日本晴和93-11中均有擴(kuò)增產(chǎn)物，但產(chǎn)物大小略有不同，在瓊脂糖凝膠上的位置顯示為396-1000bp之間(圖2A，M為1KbDNALadder(普博欣生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)PBZ0304-1)，泳道l為日本晴、泳道2為93-11)。為進(jìn)一步驗(yàn)證日本晴和93-11中是否存在序列差異，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序分析(測(cè)序公司北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，用SIR2-2擴(kuò)增日本晴得到的產(chǎn)物的序列如序列表中序列5所示，用SIR2-2擴(kuò)增93-11得到的產(chǎn)物的序列如序列表中序列6所示，并利用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果表明，93-11中確實(shí)存在36bp的缺失，此缺失的序列即是GenBankaccessionAL731882中自5，末端第67843-67878位的核苷酸序列。根據(jù)日本晴的基因組序列再次對(duì)fls577^(L0C—0sl2g07950)設(shè)計(jì)引物SIR2-3，其中SIR2-3R在此缺失區(qū)域，SIR2-3F的序列如序列表中序列3所示，SIR2-3R的引物序列如序列表中序列4所示。分別以93-11和日本晴的基因組DNA為模板，按上述條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示此引物僅在日本晴中有擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上顯示為230-396bp之間的一條帶，而93-ll中卻無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2B，M為1KbDNALadder(普博欣生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)PBZ0304-1)，泳道l為日本晴，泳道2為93-11，泳道3為陰性對(duì)照)。所以，引物SIR2-3可作為區(qū)別秈粳亞種的InDel引物。實(shí)施例3、用引物SIR2-3輔助篩選水稻秈粳亞種的可行性驗(yàn)證水稻品種和地方種(均來(lái)自國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù))93-11、細(xì)麻柞谷、紫糯、N印a(深水稻)、桂朝2號(hào)、Aus6538(Bamalaia)、IR24、特青、日本晴、矮大種、木理(光殼粳稻)、糯粳稻、越富、秋光、紅光和云峰7號(hào)。首先利用形態(tài)指標(biāo)及相關(guān)文獻(xiàn)檢索分別隨機(jī)挑選秈粳亞種各8個(gè)品種和地方種，如表l:表1、16個(gè)水稻品種和地方種的秈粳亞種鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>分別提取上述不同水稻品種和地方種的基因組DNA，在引物SIR2-3的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下水稻基因組咖A模板20ng，TaqPlusDNA聚合酶0.5U，2.10XPCR緩沖液(100raMTrisHC1pH9.0，500mMKC1，15mMMg2+，1%TritonX-IOO)，100幽dNTPs，正向引物4141，反向引物4MM，用DEPC水補(bǔ)充反應(yīng)體系至2014。PCR反應(yīng)條件為先94。C5min;隨后94°C30sec，58。C45sec，72。Clmin30sec，共35個(gè)循環(huán)；再72t:10min。反應(yīng)結(jié)束后，利用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示(泳道1為秈稻93-11的電泳結(jié)果，泳道2-8分別為細(xì)麻柞谷、紫糯、N印a(de印waterrice，深水稻)、桂朝2號(hào)、Aus6538(Bamalaia)、IR24和特青的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果；泳道9為粳稻日本晴的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，泳道10-16分別為矮大種、木理(光殼粳稻)、糯粳稻、越富、秋光、紅光和云峰7號(hào)的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果)。結(jié)果表明，引物SIR2-3在7個(gè)秈稻品種和地方種中，均未擴(kuò)增出條帶，與93-11的擴(kuò)增結(jié)果相同；而在7個(gè)粳稻品種和地方種中，除地方種木理和品種越富外，均能擴(kuò)增出與日本晴相同的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物在在瓊脂糖凝膠上顯示為230-396bp之間的一條帶,鑒定秈稻和粳稻的準(zhǔn)確性分別為100%和80%。以上結(jié)果表明，用引物SIR2-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)輔助篩選秈稻和粳稻是可行的。序列表<160>6<210>1<211〉24<212〉腿<213〉人工序列<220><223><400〉1ctcactgcatttctcccttgctgt24<210〉2<211>26<212〉腿<213>人工序列<220〉〈223〉〈400〉2ccttttgcaacgaagaatctgcagag26<210>3<211>20〈212>靈<213〉人工序列〈220><223><400〉3cttgctgtaatgc<210>4<211〉24〈212>廳〈213>人工序列<220><223><400>4<210>5<211>564<212〉腿<213>稻屬水稻粳稻(<5r，sa"rasubsp.力/額.cs)<400〉5ctcacttgcctttctcccttgctgtaatgccaccatcttcttcagatactgcccagaata60cttcagatgggaagtctagctgtaccaaacgtaagttaagctggtgctgcgcagtcatct120ttgtcggaaaccatgtttccatgtaagaacaattctttggagaacaaaceiagtcacaagg180gaagacgaaacaatgaaagaaacttttagcaactaattaagttcagttcaactgggcaga240atatcatctccatcctgtttgcatgagatgagggagttaaccttgttaaccctgttgttg300taagtgtgtaaaccttaaccttgttaaccctgttgttgtaagtgtgtaaacctttttcag3G0tgacaattcattcaaatgtttccaaagatatggatatcccgaactgatcagcacattgaa420gaagtacaatatgctttgatagttccttgtaatgtgtcattaagcagaagttgaaaaacg480ttctagctggtccggatatttggattcatgtagtctattgtgctcttcacctgttcattt540ctgcagattcttcgtggcaaaagg564<210〉6<211>532<212>DNA<213>稻屬水稻秈稻((9iTZ3saf/rasubsp.i/7o7ca)<400>6ctcactgccattctcccttgctgttatgccaccatcttcttcagatactgcccagaatac60ttcagatgggaagtctatctgt3CC333tgtg3gtt朋gC3tggtgCtgCgcagtcatct120ttgttggaaaccatgttctcatgt犯ga^caatctttggagaacaagtcaCt3ggg3卿180tgaaacaatgaaagaaacttttagctagactaattttgttcagttcaactggacagaata240tcattgccatcctgtttgcatg,tga_gggcgttaaccttgttaaccctgtgtgttgta300agtgtgtaaacctttttcagattttcagtgacaattcgttcgaatgtacccaaagatatg360gatatcccgagctgatcagcacattgaagaagtacaatatgctttggtagttccttgtaa420tgtatcattaagcagaagttgaaaaacgttctagctggttcggatatttggsttcatgt3480gtctattgtgttcttcacctgttcgtttctgcagattcttcgtggcaaaagg53權(quán)利要求1、一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法，是檢測(cè)待測(cè)水稻中是否缺失GenBankaccessionAL731882中自5’末端第67843-67878位的核苷酸序列，若缺失，則待測(cè)水稻為候選秈稻，若不缺失，則待測(cè)水稻為候選粳稻。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述缺失通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增為擴(kuò)增包含GenBankaccessionAL731882中自5'末端第67843-67878位核苷酸序列的片段。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增檢測(cè)中所用的上游或下游引物與GenBankaccessionAL731882中自5，末端第67843-67878位的核苷酸序列互補(bǔ)或相同。5、根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的引物，其中一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增檢測(cè)中，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，若產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上顯示為位于230-396bp之間的一條帶，則待測(cè)水稻為候選粳稻，若產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上顯示為沒(méi)有位于230-396bp之間的一條帶，則待測(cè)水稻為候選秈稻。7、輔助篩選秈稻和粳稻的引物，其中的一條序列如序列表中序列3所示，另一條序列如序列表中序列4所示。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種輔助篩選秈稻和粳稻的方法。本發(fā)明所提供的輔助篩選秈稻和粳稻的方法是檢測(cè)待測(cè)水稻中是否缺失GenBankaccessionAL731882中自5’末端第67843-67878位的核苷酸序列，若缺失，則待測(cè)水稻為候選秈稻，若不缺失，則待測(cè)水稻為候選粳稻。本發(fā)明輔助篩選水稻秈粳亞種的方法可用于早期秈稻和粳稻品種或地方種，對(duì)秈、粳稻雜種優(yōu)勢(shì)的利用和培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的雜交稻具有重要指導(dǎo)作用，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，為水稻秈粳亞種種質(zhì)的鑒定提供了一種快捷的選擇方法。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101215609SQ200810056530公開(kāi)日2008年7月9日申請(qǐng)日期2008年1月21日優(yōu)先權(quán)日2008年1月21日發(fā)明者劉鳳霞,孫傳清,張振海,徐文英,震蘇,薛勇彪,譚祿賓,超邸申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)