專利名稱：用一粒稻谷鑒定秈稻和粳稻的分子標記方法
用一粒稻谷鑒定秈稻和粳稻的分子標記方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物類型鑒別技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在一粒水稻種子(或稻米)中提 取DNA，并鑒定其秈稻和粳稻特性的方法。技術(shù)背景
栽培稻(ftr^a sativa L.)是我國重要的三大糧食作物之一，在我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 和經(jīng)濟發(fā)展中占有舉足輕重地位。栽培稻起源于我國，已有8000多年的栽培歷史，目前廣 泛種植于全球。在栽培稻的栽培和馴化過程中，由于適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境，產(chǎn)生了顯著的秈 稻和粳稻遺傳分化。典型的秈稻和典型的粳稻之間已經(jīng)形成了明顯的生殖隔離，故通常將 秈稻和粳稻分成兩個亞種秈稻亞種(Orj^a sativa subsp.)和粳稻亞種(ftTza sativa subsp. japonica).秈稻和粳稻不僅在形態(tài)、生理和生化性狀方面產(chǎn)生了較大的差 異，而且也形成了不同的稻米品質(zhì)和口感品味等特點。稻米的不同消費人群對于秈稻或粳 稻的喜好是不同的，如北方人更偏重選擇粳稻，這就造成了不同類型稻米在價格上有較大 差異。同時在育種中，由于秈稻和粳稻的遺傳分化以及上述特征特性，進行秈稻和粳稻的亞 種間有性雜交，可以產(chǎn)生豐富的遺傳變異類型而培育出優(yōu)異的水稻品種；秈稻和粳稻的亞 種間雜種優(yōu)勢，在雜交稻的培育中也具有重要的價值。因此，對于秈稻和粳稻的鑒定，不僅 可以確定特定稻米的商品價值，而且在水稻育種中也具有重要的實踐意義。
雖然秈稻和粳稻的準確鑒定極為重要，但是一直以來，對秈稻和粳稻的準確鑒定 都存在較大的問題。傳統(tǒng)鑒定秈、粳稻的方法主要依賴于形態(tài)性狀變異(如株高，株型 等)以及生理生化功能差異。目前用來鑒定秈稻和粳稻最常用的方法是以形態(tài)鑒定為基礎(chǔ) 的“程氏指數(shù)法”，(包括6個性狀稃毛、酚反應(yīng)、穗節(jié)長、稻殼色、葉毛和谷粒長寬比)。這 個方法的最大缺點1)由于形態(tài)性狀受環(huán)境的影響較大而導致檢測的不準確；2)形態(tài)測量 必須要栽種被測水稻樣品，從播種到成熟一般需要3-5個月，耗時長；3)形態(tài)測量需要一定 的樣品群體，故需要較多的水稻樣品；大大影響了秈稻和粳稻鑒定的效率。專利“利用水稻 DNA插入或缺失分子標記鑒定秈稻和粳稻的方法”大大提高了秈稻和粳稻鑒定的準確性和 效率。但是，水稻DNA的提取通常是以新鮮葉片來進行，需要將稻種進行萌發(fā)，形成幼苗，1 周甚至10天以后才能提取DNA，耗時較長。對于不能萌發(fā)出苗的種子，無法提取DNA。以一 粒稻米中提取的DNA為模板，結(jié)合InDel分子標記方法，能更快速和高效地確定稻米樣品的 秈、粳特性。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種僅用一粒稻谷(或稻米)提取DNA，并利用InDel分子標 記電泳和分析，快速和精確鑒定稻谷樣品秈稻和粳稻特性的方法。
本發(fā)明提出的一粒稻谷鑒定水稻的秈稻和粳稻特性方法，是一種利用一粒稻谷 (或稻米)中提取的微量DNA為模板、插入或缺失(InDel)分子標記以及瓊脂糖電泳技術(shù)鑒 定水稻品種的方法。具體來說是以一粒稻谷中提取的DNA為模板，利用水稻亞種間DNA序列的特異性差異InDel片段，設(shè)計擴增引物組合以及衍生物，對秈稻型等位基因(I)和粳稻 性等位基因(J)的頻率或進行計算，并根據(jù)這些頻率的值(o-ioo%)來確定秈稻和粳 稻的方法。
本發(fā)明用于提取一粒稻米中微量DNA樣本的方法，具體步驟如下(1)取一粒稻米，研磨成粉末，加入750μ L CTAB提取緩沖液；(2)緩沖液經(jīng)氯仿/異戊醇萃取后，在700(Γ13(ΚΚ)轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心；(3)上清液中加入等體積沉淀緩沖液，于-20°C放置30分鐘，按步驟(2)離心；所述緩 沖液配方可選為0. 5 1. 5% CTAB，40 60 mmol/L Tris-HCl pH7. 8 8. 5，9. 5 10. 5 mmol/L EDTA ρΗ7· 8 8· 5 ；(4)沉淀物中加入500μ L純化液，重復步驟(2)；所述純化液配方可選為9. 5^10. 5 mmol/L Tris-HCl ρΗ7· 8 8· 5,0. 8 1· 2 mmol/L EDTA ρΗ7· 8 8· 5,0. 8-1. 2 mol/L NaCl ；(5)上清液加入無水乙醇，-20°C沉淀DNA，按步驟(2)離心，沉淀物經(jīng)70%乙醇漂洗、離 心后烘干。
本發(fā)明用于鑒定秈稻和粳稻的MDel特異引物一共有40對，具體如下表1
權(quán)利要求
1.一種用一粒稻米提取DNA樣本的方法，其特征在具體步驟如下(1)取一粒稻米，研磨成粉末，加入750μ L CTAB提取緩沖液；(2)緩沖液經(jīng)氯仿/異戊醇萃取后，在700(Γ13(ΚΚ)轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心；(3)上清液中加入等體積沉淀緩沖液，于-20°C放置30分鐘，按步驟(2)離心；(4)沉淀物中加入500μ L純化液，重復步驟(2)；(5)上清液加入無水乙醇，-20°C沉淀DNA，按步驟(2)離心，沉淀物經(jīng)70%乙醇漂洗、離 后烘干。
2.一種用于鑒定秈稻和粳稻的InDel特異性引物對，其特征在于PCR產(chǎn)物長度差異為24-67bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列，共40對，列表如下
3. 一種利用InDel分子標記鑒定秈稻和粳稻的方法，其特征在于具體步驟如下(1)按照權(quán)利要求書1所述，從一粒稻谷或稻米中提取DNA樣品；(2)采用如權(quán)利要求書2所述的40對特異引物，對提取的水稻DNA樣品進行PCR擴增；(3)利用瓊脂糖電泳方法檢測PCR產(chǎn)物；(4)計算基因頻率根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果和讀取記錄電泳結(jié)果中樣品在各特異位點上的基因型結(jié)果， 使用下述公式來計算樣本各特異位點的平均秈稻型基因頻率巧或粳稻型基因頻率G，其變 化在0-100%之間秈稻型基因頻率(％)
全文摘要
本發(fā)明屬于生物類型鑒別技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種利用一粒稻谷(或稻米)和插入或缺失(InDel)分子標記來鑒定秈稻和粳稻的方法。本發(fā)明從一粒稻谷中提取DNA，利用秈稻93-11和粳稻日本晴的全基因組DNA序列對比而獲得的40對特異InDel引物，對水稻種子中提取的DNA進行片段擴增、電泳分離以及電泳圖譜的分析來鑒定該水稻樣本的秈、粳稻特性。具體而言，以一粒稻谷中提取的DNA為模板，利用40對InDel引物組合，基于聚合酶鏈式反應(yīng)和瓊脂糖電泳獲得的分子指紋圖譜進行分析和統(tǒng)計，根據(jù)樣本40個InDel位點上的93-11基因型和日本晴基因型分子指紋計算出的基因頻率(Fi或Fj)，確定被測水稻種子(樣品)的秈稻或粳稻特性。本發(fā)明僅需檢測一粒種子的樣品便可獲得結(jié)果，方法簡便快捷，鑒定準確，具有良好的推廣應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/11GK102031253SQ20101059178
公開日2011年4月27日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者劉蘋, 盧寶榮, 蔡星星 申請人:復旦大學