專利名稱：一種酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)l-半胱氨酸的方法
一種酶轉(zhuǎn)化妒L"半胱氨酸的旅
fe^領(lǐng)域本發(fā)明屬于氮基酸的生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種惡臭j段單胞菌(/^油mo,戸Mi ) 酶法轉(zhuǎn){鵬物^ L-半胱氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-半胱氨酸(L-cysteine)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中具有活性硫(巰基)的 氨基酸，目前已在醫(yī)藥、食品添加劑和化妝品中廣泛應(yīng)用。在醫(yī)藥方面，半胱氨,其衍生物可用 于肝臟藥和解毒藥、解熱鎮(zhèn)麟、潰瘍治療藥、疲勞恢復(fù)劑、輸艦綜合錢酸制劑，特別是繊 藥。在食品方面，半胱氨酸可用作面包發(fā)酵助劑。在化妝品方面主要用于繊精、防曬霜、養(yǎng)發(fā)精、 生勤JC。由于在大多,微生物體內(nèi)，巰基來源于硫酸根離子，M^酸根離子可還原為某種硫化物， 因此柳隹用微生物發(fā)離制取L-半胱氨酸。我國對L-半胱氨酸的妒主要依靠毛發(fā)M;K解后提取 L-胱氨酸，然后將L-胱氨酸經(jīng)化學(xué)或電解還原制備得到L-半胱氨酸，4發(fā)中胱氨酸，含鬆勺為14%， 國內(nèi)目前毛勤乂角對去的最高收率約為4.5至5.5%。用毛發(fā),制取L-半胱氮酸收率低，倉嫩高,水 解戰(zhàn)呈產(chǎn)婦隹聞氣體及大量廢酸，環(huán)境污染嚴(yán)重；另外，由于衛(wèi)生問題，從毛發(fā)提取的產(chǎn)品不符合 醫(yī)藥的l頓標(biāo)準(zhǔn)。而微生物酶法轉(zhuǎn)化妒L半胱氨酸具有特異性強，妒工藝簡單，副反應(yīng)和畐U產(chǎn) 物少，對環(huán)境污染的禾號低靴點，將具剤艮好的發(fā)展前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的收率低，旨繼高，環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，衝共一 種微生物酶法轉(zhuǎn)皿物^ L"半胱氮酸的方法。
本發(fā)明JK共的一種以惡臭假單胞菌(Amfowomy p"/z'必)TS-1138全細(xì)胞為酶源，酶法轉(zhuǎn)化 DL-2-氮基-A2噻i^lfr4羧酸(DL"2-Amino-A2lhiazoline4"Carboxylic Acid， DL-ATC)合成L-半胱 氨酸的方法，包括
A. 將惡臭假單胞菌TS-1138進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)大培養(yǎng)
(惡臭假單胞菌(尸犯^b柳膨戸ft'必)TS1138曾于2006年11月在《生tJ^術(shù)通訊》第17 巻第6期和2007年2月在《河南工業(yè)大學(xué)對艮》第28巻第1期發(fā)表，測繊于天津禾根大學(xué)代謝 控制發(fā)酵研體，公眾如有需要，可直接與該研究室麟。)
B. 將步驟A中獲得的擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中碳源含量應(yīng)為 0. lF3(F。的干^t咅養(yǎng)基重，氮碳比N:C應(yīng)介于1: 100^50: 100之間，無機鹽含ffl^為0.1~10%， DL-ATC的添加量為0.1 %~0.9%。產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始PH6.0，培^MJt 25。C 33。C，振蕩培養(yǎng) 或發(fā),i歸12 36小時，接種量為O. 01^20% (V/V);在培養(yǎng)過程中流加氨水調(diào)節(jié)發(fā)辭咅養(yǎng)基 的PH6.2 7. 0;
C. 將步驟B培養(yǎng)到2(K24小時，離心分離菌體10min(4000r/min， 4°C)，棄去上清液，用pH7.4 的PBS緩沖液(磷自二鈉-磷酸二氫鈉-氯化鈉緩沖液)反復(fù)洗滌菌體三次并 ，在pH 7.4的 PBS緩沖液中添加的濕菌體，帝恪,反/^萬用細(xì)脫懸液，細(xì)胞濃度為100g/L 500g/L。
D. 將步驟C制備的細(xì)胤懸液，加入到底物溶液中，進(jìn)行艦反應(yīng)。其中底物溶液的濃度為0.05 % 5.0%，在0^小時加入，反應(yīng)溫度為3&^42°C，反應(yīng)時間為2 12小時。8|{￡反應(yīng)結(jié)束后，離 心分離菌體，社清液，采用酸式茚三酮法測定L-半胱氨齡量。
戰(zhàn)B步產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源為糖，即葡箭糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，山梨糖；或甘油； 或低W醇，乙醇；碳源含 ^范圍為10%~20%。
戰(zhàn)B步產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的氮源為氨或銨鹽，即氯化銨，硫鵬安，碳^L銨，硝,；或有 機氮，即牛肉膏，蛋白胨，酵TO， 5^漿，尿素。
戰(zhàn)B步產(chǎn),咅養(yǎng)基中的無機鹽為磷,，硫,，硫^M鐵，氯化鈉氨或硫^!孟。
在本發(fā)明實例中，采用酸式茚三酮法來測定L"半胱氨酸的含量，具體方法如下精確稱取一定 量L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于一定量0.05MHC1中，制備終濃度為500mg/l的標(biāo)準(zhǔn)母液，進(jìn)一步用 蒸餾水將上述母液分別稀釋為10， 20，……，100mg/l的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣 品溶液的稀釋液0.2mL,加入02mL冰醋酸，再加入0.2 mL酸性茚三酮試劑，于沸水浴中反應(yīng)IO min，然后立即在冷水中冷卻，最后加入2.4mL酒精，使總體積為3mL。放置10min后，于560nm 下測定其吸皿，以濃度和吸皿纟魏嚇準(zhǔn)曲線。S31該標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出未知溶液中的半胱氨酸濃 度。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果通常在由謝崔化法進(jìn)行的反應(yīng)中，^S對酶作用有兩個方面一 方面，反應(yīng)溫度升高，,反，率加快；另一方面，隨著溫度升高，酶蛋白熱變性1加快， 酶易失活， 一般不能重復(fù)使用；而固定化的方法步驟比較繁雜，而且或多或少對酶活力有一定影 響。而本發(fā)明方法以惡臭假單胞菌TS-1138細(xì)胞為酶源，酶法轉(zhuǎn)tt^物DLATC得到L-半胱氨酸 7K溶液。該方法直接利用細(xì)胞為酶源直接催化底物，取締了固定化酶的方法，并艦斷氐,反 應(yīng)驢，提高酶的穩(wěn)定性，在,反應(yīng)過程中流加底物DL"ATC，使酶可重復(fù){頓，提高了酶源 細(xì)胞的利用效率和L"半胱氨酸的產(chǎn)量。
具條驗式
實施例l:惡臭假單胞菌TS1138菌懸液的帝恪
從親賴羊斜面上挑取一環(huán)惡臭假單胞菌TS-1138的菌苔接A^有30mL種子培養(yǎng)基(葡萄糖 30g/L， DL-ATO3H205g/L，酵娜15g/L，蛋白胨10g/L，尿素3g/L， MnS04-H20 lg/L， K2HP04-3H20 3g/L， MgSQr7H2O0.5g/L， FeSOr7H2O0.01g^， NaC11.5g/L， pH7.5， 0.1MPal5min)的500mL 三角瓶中，8層紗布封口，于旋轉(zhuǎn)式搖床190r/min， 29。C振蕩培養(yǎng)14h后，以10%接種量將種子培 養(yǎng)物接A^"30mL產(chǎn),咅養(yǎng)基(葡萄糖30g/L， DLATC .3恥4g/L，就漿3g/L，尿素3g/L， MnSQrH20 lg/L， K2HP04'3H20 3.0g/L， MgS04.7H20 0.5g/L， FeS04.7H20 0.01g/L， NaC13 g/L， pH7.5, 0.1MPal5min)的500mL三角瓶中，8層紗布封口，于旋轉(zhuǎn)式搖床170r/min， 29。C振蕩培 養(yǎng)22h后，離心分離菌體10min(4000r/min， 4°C)，棄去上清液，用pH 7.4的PBS緩沖液反復(fù)洗滌 菌體三次并塞懸，在pH 7.4的PBS緩沖液中添加的濕菌體，制備謝足反艦用細(xì)胤懸液，細(xì)胞濃 度為350g/L。
實施例2:以惡臭假單胞^TS1138搖瓶培養(yǎng)，在42。C進(jìn)行,反應(yīng)^I^半胱氨酸 在100ml三角瓶中加入0.6。/。的DL-ATC溶液(含有0.6%DLATC 0.6%K2HPO4， pH7.5至8.0) 20ml，再加AJ^實施例l的TS-1138細(xì)脫懸液10ml，混勻。42。C恒溫，反您.5小時后，用酸式茚 三酮法測定半胱氨酸的含量為1.6 5g/t。
實施例3:以惡臭假單胞菌TS1138搖瓶培養(yǎng)，在38。C進(jìn)行謝足反應(yīng)生產(chǎn)L半胱氨酸 在100ml三角瓶中加入0.6。/。的DL-ATC溶液(含有0.6。/。DL-ATC， 0.6%K2HPO4， pH7.5至 8.0) 20ml，再加入i^實施例l的TS墨1138細(xì)脫懸液10ml，混勻。38。C恒溫，反應(yīng)3小時后，用 酸式茚三酮法測定半胱氨酸的含量為1.60g/l。
實施例4:以惡臭假單胞菌TS1138搖瓶培養(yǎng)，在38。C流加底物進(jìn)行,反應(yīng)生產(chǎn)L半胱氨酸 在100 ml三角瓶中加入0.6%的DLATC溶液(含有0.6% DL~ATC， 0.6% K2HP04， pH 7.5至 8.0) 20ml,再加Ai^實施例l的TS-1138細(xì)胞懸液20ml，混勻。38。C恒溫，分別于,反應(yīng)3h 和6h時加入10ml含DL"ATC0.18g與0.24g的底物溶液，使底物溶液中ATC的量基本維持在0.6% 左右，隨反應(yīng)9小時后，用麟茚三酮法測定半胱氨酸的含量為5.70g/1。
實施例5:以惡臭假單胞菌TS1138在5L罐培養(yǎng)，在42。C進(jìn)行,反應(yīng)生產(chǎn)L半胱氨酸 從飾羊斜面上挑取一環(huán)惡臭環(huán)假單胞菌TS-1138的菌苔接入種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基及種子 培養(yǎng)斜牛均同實施例1，以10%的接種量(種子培養(yǎng)液300mL)，將斜蟲滅好的產(chǎn)酶培養(yǎng)基(葡萄糖 50g/L， DL-ATC -3H20 5g/L，就漿3g/L，尿素3g/L， MnS04.H20 lg/L， K2HP04-3H20 3g/L， MgSO4.7H2O0.5g/L， FeS04.7H20 0.01g/L， NaC13g/L， pH7.0' O.lMPa 15min)火焰接種方式接 入5L自動控制發(fā),中，5L發(fā),中裝液量3L，離控制29。C，自動流加氨水控制pH在6.7左 右，通風(fēng)量200L/h，初始攪拌織200r/min，艦流加泡敵消泡。當(dāng)賺低于5g/L時流加濃度為 60g/L的葡萄糖液。
發(fā),養(yǎng)22小時后，取5L罐培養(yǎng)的細(xì)fcL，濃縮五倍至400ml，加入到含有0.6。/。的DL-ATC溶 液(含有0.6。/。DL"ATC, 0.6%K2HPO4， pH7.5至8.0) 800ml的5L自動控制發(fā),中，混勻。42°C 恒溫，反^15小時后，用酸式茚三酮法測定半胱氨酸的含量為1.81g/L
實施例6:以以惡臭假單胞^TS1138在5L罐培養(yǎng)，在38t:流加底物進(jìn)行,反應(yīng)^L"半胱氨
酸
在5L自動控制發(fā),中力口入0.6%的DLATC溶液(含有0.6%DL-ATC， 0.6% K2HP04， pH7.5 至8.0) 800 ml，再加入上述實施例5的TS-1138細(xì)脫懸液400ml，混勻。38。C恒溫，在,反應(yīng) 3h時加入30ml含DL"ATC4.8g的底物溶液，i醜物溶液中ATC的量基本維持在0.6%左右，■ 反應(yīng)6小時后，用酸式茚三酮法測定半胱氨酸的含量為2.95g/l。
權(quán)利要求
1、本發(fā)明提供的一種利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138酶法轉(zhuǎn)化DL-2-氨基-Δ2噻唑啉-4羧酸(DL-2-Amino-Δ2thiazoline-4-Carboxylic Acid，DL-ATC)合成L-半胱氨酸的生產(chǎn)工藝，包括A.將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)大培養(yǎng)B.將步驟A中獲得的擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中碳源含量應(yīng)為0.1％～30％的干基培養(yǎng)基重，氮碳比N∶C應(yīng)介于1∶100～50∶100之間，無機鹽含量應(yīng)為0.1～10％，DL-ATC的添加量為0.1％～0.9％。產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始PH6.0～9.0，培養(yǎng)溫度25℃～33℃，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)12～36小時，接種量為0.01％～20％(V/V)；在培養(yǎng)過程中流加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH6.2～7.0；C.將步驟B培養(yǎng)到20～24小時，離心分離菌體10min(4000r/min，4℃)，棄去上清液，用pH 7.4的PBS緩沖液(磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉-氯化鈉緩沖液)反復(fù)洗滌菌體三次并重懸，在pH 7.4的PBS緩沖液中添加的濕菌體，制備酶促反應(yīng)所用細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為100g/L～500g/L。D.將步驟C制備的細(xì)胞懸液，加入到底物(DL-ATC)溶液中，進(jìn)行酶促反應(yīng)。其中底物溶液的濃度為0.05％～5.0％，在0～9小時加入，反應(yīng)溫度為36～42℃，反應(yīng)時間為2～12小時。酶促反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體，取上清液，采用酸式茚三酮法測定L-半胱氨酸含量。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝,其特征在于B步產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源為糖， 即葡萄糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，山梨糖；或甘油；或低分子醇，乙醇；碳源含量最適 范圍為10%~20%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝,其特征在于B步產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的氮源為氨或 銨鹽，即氯化銨，硫酸銨，碳酸氫銨，硝酸銨；或有機氮，即牛肉膏，蛋白胨，酵母粉, 玉米漿，尿素。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于B步產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的無機鹽為磷 酸鉀，硫酸鎂，硫酸亞鐵，氯化鈉氨或硫酸錳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-半胱氨酸的工藝。以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138為供試菌種，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)和產(chǎn)酶培養(yǎng)后，以全細(xì)胞為酶源，酶法轉(zhuǎn)化DL-2-氨基-Δ2噻唑啉-4羧酸(簡稱DL-ATC)，其中底物溶液的濃度為0.05％～5.0％，在0～9小時加入，反應(yīng)溫度為36～42℃，反應(yīng)時間為2～12小時。本發(fā)明工藝簡單，生產(chǎn)原料成本低，耗能少，無污染。
文檔編號C12P13/12GK101348809SQ20071005819
公開日2009年1月21日 申請日期2007年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月18日
發(fā)明者劉淑云, 徐慶陽, 懷麗華, 寧 陳, 雷 馬 申請人:天津科技大學(xué)