專利名稱：一株利迪鏈霉菌及其在植物病害生物防治中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株利迪鏈霉菌及其應(yīng)用，特別涉及該株利迪鏈霉菌及其在植物病害生物防治中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真菌所引致的植物病害占所有植物病害的80％以上，許多重大病害對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失慘重，如果蔬類作物的灰霉病、炭疽病、番茄葉霉病、水稻稻瘟病、玉米大小斑病、小麥赤霉病等。其中由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是蔬菜保護地栽培普遍發(fā)生的一種世界范圍的流行性重要病害，近年其危害的作物種類不斷增加，目前已成為番茄、黃瓜、茄子、西葫蘆、甜椒、辣椒、菜豆、韭菜、草莓、葡萄等果蔬的主要病害或首要病害，常造成果實腐爛，損失嚴重。歐美、澳洲、非洲、日本、印度等國家因灰霉病引致的田間產(chǎn)量損失一般20-30％，我國黃淮東北和西北溫室集中的地方蔬菜灰霉病發(fā)生嚴重，田間產(chǎn)量損失30％左右，嚴重的達50-70％。目前蔬菜生產(chǎn)中對灰霉病尚無理想的抗源材料，抗病育種進展緩慢，因此該病的防治仍依賴于化學(xué)藥劑。但是長期大量應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥，不但嚴重污染人們的生活環(huán)境、破壞生態(tài)平衡、威脅人畜的健康和安全，而且也導(dǎo)致病原生物抗藥性的產(chǎn)生，致使病害再度猖獗而更難防治。據(jù)報道，近年來，防治灰霉病的兩類主要農(nóng)藥苯并咪唑類和二甲酰亞胺類的一些藥劑已引起灰霉病菌的抗藥性，使其田間防效明顯下降。同時，果蔬產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留超標也構(gòu)成了其出口創(chuàng)匯的重要障礙。而微生物農(nóng)藥源于自然，具有環(huán)境兼容性好、持效期長、低毒、對人畜和天敵安全等特點，同時其資源豐富，是植物尤其是果蔬病害控制的重要綠色環(huán)保途徑之一，符合可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求。因此，近年微生物農(nóng)藥在全球范圍內(nèi)得到了迅速發(fā)展。
利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus DeBoer et al.)是習(xí)居于土壤的腐生微生物，已有多年的研究歷史，作為鏈霉菌的一種，此菌能夠產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)。其著名的代表菌株是S.lydicus NRRL2433，該菌株在醫(yī)藥領(lǐng)域研究和應(yīng)用廣泛，能夠產(chǎn)生具有廣譜抗細菌和分枝桿菌作用的利迪霉素(Lydimycin)和抗革蘭氏陽性細菌和分枝桿菌的利迪鏈菌素(Streptolydigin)。在植物病害防治上應(yīng)用較廣的菌株是S.lydicus WYEC 108，此菌株最初分離自英國農(nóng)業(yè)土壤，其能夠定殖在植物的根尖部位，主要以重寄生的方式作用于土傳病害的病原菌，包括腐霉菌(Pythium)、絲核菌(Rhizoctonia)、鐮刀菌(Fusarium，)、輪枝菌(Verticillium)、頂囊殼(Gaeumannomyces)等屬真菌的種類，也能分泌幾丁質(zhì)酶(chitinase)破壞真菌的細胞壁。在國外該菌株已開發(fā)出活菌制劑用于植物根腐病、種子腐爛病等病害的生物防治。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株新的利迪鏈霉菌，該菌株經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)生具有強烈抑菌作用的活性代謝產(chǎn)物，該活性代謝產(chǎn)物可用于制備廣譜性抗植物真菌病害的生防制劑，用于植物氣傳真菌病害的生物防治。
本發(fā)明所提供的利迪鏈霉菌，是利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02，已于2006年03月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏登記號為CGMCC No.1654。
利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654，是從北京遠郊天然次生林土壤中分離得到的。具體方法如下從北京遠郊天然次生林地采集土樣，取10g加入內(nèi)裝100ml無菌水和玻璃珠的三角瓶中，于100轉(zhuǎn)/min搖床上振蕩20min，取0.5ml加入4.5ml無菌水中，再依次稀釋10-2，10-3，10-4倍，分別取以上土壤懸液0.1ml在高氏一號培養(yǎng)基平板上均勻涂布，超凈工作臺內(nèi)吹至略干；每濃度3個重復(fù)，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)5-10天，挑取放線菌單菌落進行稀釋劃線分離純化。以灰霉病菌等病原真菌為靶標菌，利用平板對峙培養(yǎng)法進行拮抗菌的初篩；對初篩獲得的有拮抗性的菌株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)0.45μm的無菌微孔濾膜過濾除菌獲得無菌發(fā)酵濾液；進一步測試該無菌發(fā)酵濾液對病原菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制作用和溫室防病效果，最終篩選出性狀優(yōu)良的生防菌株利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654。
綜合利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特性、生理生化特性和16SrDNA序列分析的結(jié)果，將其鑒定為利迪鏈霉菌。具體鑒定結(jié)果如下(1)菌體的形態(tài)特征革蘭氏染色陽性；在GYM瓊脂、JCM42#瓊脂、燕麥粉瓊脂等培養(yǎng)基上生長7天后，基內(nèi)菌絲發(fā)育良好，無橫隔，不斷裂；氣生菌絲生長良好，多分枝；孢子絲柔曲或彎曲，孢子橢圓形。
(2)培養(yǎng)特性在6種固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性如表1所示。
表1利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的培養(yǎng)特性
(3)生理生化特性利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的生理生化特性如表2所示。
表2利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的生理生化特性
注“W”表示弱陽性結(jié)果；“+”表示陽性結(jié)果；“-”表示陰性結(jié)果。
4.16SrDNA序列分析利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的部分16SrDNA序列如序列表中序列1所示。與GenBank中相關(guān)序列Blast比較的結(jié)果表明其屬于鏈霉菌屬；利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的16SrDNA序列與目前發(fā)表的利迪鏈霉菌相關(guān)菌株相比相似性很高，為99.9％。
本發(fā)明的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654能夠向培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量的生物活性物質(zhì)。平板對峙培養(yǎng)試驗表明這種活性代謝產(chǎn)物對灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternayia solani)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearium)、番茄葉霉病菌(Fulvia fulva)、芹菜斑枯病菌(septoria apiicola)、大蔥紫斑病菌(Alternaria poprri)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)等多種植物真菌性氣傳病害的病原菌有明顯的抑制作用；但通過平板打孔法和濾紙片法測定抑菌圈的實驗表明，其對黃瓜細菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)、辣椒瘡痂病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)等細菌無抑菌活性；經(jīng)培養(yǎng)皿中直接對峙培養(yǎng)觀察和菌核重寄生試驗證明，該菌株不具菌寄生性?？梢娝目咕V與前述已知菌株S.lydicus NRRL2433明顯不同，其主要抑菌作用方式則與WYEC 108的不同。
利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654，接種于種子培養(yǎng)基，28℃，200rpm/min搖瓶培養(yǎng)24h-30h后，按5％(體積比)的種子量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量以三角瓶體積的1/5為標準，在31℃條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑，240rpm/min的轉(zhuǎn)速搖瓶發(fā)酵96h，可使該菌株在發(fā)酵液中產(chǎn)生高濃度的抑菌活性代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵液的無菌濾液對灰霉病菌的抑菌圈直徑可達40mm以上，溫室盆栽防病效果為82％-90％。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗植物真菌病害的生防制劑。
本發(fā)明所提供的抗植物真菌病害的生防制劑，是發(fā)酵利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654得到的代謝產(chǎn)物。
所述代謝產(chǎn)物可從除去利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654菌體的發(fā)酵濾液中獲得。
所述利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7-8，由如下物質(zhì)配成15g黃豆粒，5g蛋白胨，2.5g硫酸銨，10g蔗糖，10g淀粉，0.25g硫酸鎂，0.2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，1g碳酸鈣，加水定容至1000ml。其中，所述15g黃豆粒是將15g黃豆粒加水煮沸0.5-1h，取濾液。
所述利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的發(fā)酵溫度可為28-31℃。
所述發(fā)酵中的通氣量可由裝液量為搖瓶體積的1/5，13mm旋轉(zhuǎn)半徑240rpm/min振蕩的條件控制；發(fā)酵時間可為90-100小時。
本發(fā)明還提供了上述抗植物真菌病害的生防制劑的制備方法。
本發(fā)明所提供的抗植物真菌病害的生防制劑的制備方法，是發(fā)酵利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654，從其發(fā)酵液中分離得到的代謝產(chǎn)物即為抗植物真菌病害的生防制劑。
所述利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7-8，由如下物質(zhì)配成15g黃豆粒，5g蛋白胨，2.5g硫酸銨，10g蔗糖，10g淀粉，0.25g硫酸鎂，0.2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，1g碳酸鈣，加水定容至1000ml。其中，所述15g黃豆粒是將15g黃豆粒加水煮沸0.5-1h，取濾液。
所述利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的發(fā)酵溫度為28-31℃；所述發(fā)酵中的通氣量可由裝液量為搖瓶體積的1/5、13mm旋轉(zhuǎn)半徑240rpm/min振蕩培養(yǎng)的條件控制；發(fā)酵時間為90-100小時。
實驗證明，本發(fā)明的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的無菌發(fā)酵濾液(抗植物真菌病害的生防制劑)對番茄灰霉病和甜椒灰霉病均有很好的防效；其2倍稀釋液對二者的平均防效分別達89.34％和90.04％，方差分析和均值多重比較結(jié)果表明其效果顯著高于目前生產(chǎn)上灰霉病防治的優(yōu)良用藥50％灰康懸浮劑；其5倍稀釋液對二者的平均防效分別達83.63％和82.74％，與灰康的防效無顯著差異。因此，利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654和用它制備的抗植物真菌病害的生防制劑在果蔬灰霉病的防治中有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的無菌發(fā)酵濾液(抗植物真菌病害的生防制劑)對番茄和甜椒種子的萌發(fā)和生根有明顯的促進作用，對其它供試作物的種子萌發(fā)沒有抑制作用。
圖1為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654與黃瓜灰霉病菌的平板對峙培養(yǎng)實驗圖2為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654無菌發(fā)酵濾液抑制番茄灰霉病菌菌絲生長的平板照片圖3為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654對番茄灰霉病菌產(chǎn)生的抑菌圈的平板照片圖4為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654對番茄灰霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用照片圖5為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654發(fā)酵濾液對番茄灰霉病的溫室防效照片具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實現(xiàn)本發(fā)明所采用的培養(yǎng)基具如下所述1、利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654平板分離和斜面保存采用高氏一號培養(yǎng)基K2HPO40.5g，NaCl 0.5g，KNO31.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，可溶性淀粉20g，瓊脂20g，水1000ml；pH 7.2-7.4。
2、平板對峙培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，蔗糖10-20g，瓊脂17-20g，水1000ml；pH自然。
3、經(jīng)正交試驗優(yōu)化得到的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654發(fā)酵培養(yǎng)基15g黃豆粒(加蒸餾水煮沸0.5-1h，取濾液)，5g蛋白胨，2.5g硫酸銨，10g蔗糖，10g淀粉，0.25g硫酸鎂，0.2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，配成水溶液，調(diào)pH7-8后，加1g碳酸鈣，加水定容至1000ml。0.10342Mpa滅菌20min。
4、種子培養(yǎng)基將發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的10g蔗糖代之以20g葡萄糖，其它成分不變。
實施例1、利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654菌種培養(yǎng)和抗植物真菌病害的生防制劑樣品制備將利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654接種到上述高氏一號斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7-10天，待其產(chǎn)生足量的孢子，用無菌鉑環(huán)刮取其孢子2-3環(huán)接種于250ml三角瓶內(nèi)的50ml上述種子培養(yǎng)基內(nèi)，置可控溫搖床上，在28℃條件下，200rpm/min(旋轉(zhuǎn)半徑13mm)恒溫振蕩培養(yǎng)24h-30h；然后在無菌條件下將其分接于10個500ml三角瓶內(nèi)的上述發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)(每瓶裝液量為100ml)；接種后的搖瓶在31℃條件下，以240rpm/min(旋轉(zhuǎn)半徑13mm)的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)96h；此時菌株已在發(fā)酵液中產(chǎn)生高濃度的抑菌活性代謝產(chǎn)物。
將以上步驟獲得的發(fā)酵液5000rpm/min離心10-15min沉降菌絲體及固形物，上清液用0.45μm的無菌微孔濾膜過濾，收集濾液(該濾液中無利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654菌體)，該利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A02 CGMCC No.1654的無菌發(fā)酵濾液即為抗植物真菌病害的生防制劑樣品，置4℃貯存?zhèn)溆谩?br>
實施例2、利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654及其代謝產(chǎn)物的抑菌活性試驗在本實施例中供試的培養(yǎng)基有高氏一號培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成均如上所述；供試靶標病原菌為灰葡萄孢菌(Botrytis cinereaPers.)的3個菌株，即黃瓜灰霉病菌、番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌。
1.平板菌落的抑菌活性試驗采用平板對峙培養(yǎng)法，先將固體斜面上利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的孢子用無菌水制成菌懸液，取200-500μl菌懸液均勻涂在直徑90mm的高氏一號固體平板上，28℃培養(yǎng)2-4d，使其長滿平板；用直徑7mm的無菌打孔器打制菌餅，然后在事先準備好的PDA平板一側(cè)接種利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654菌餅，另一側(cè)對稱位置接種無拮抗性的對照菌株菌餅，28℃培養(yǎng)2天后，以同樣的方法利用PDA平板打制靶標病原菌菌餅；在上述已接種好利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A02 CGMCC No.1654和對照菌株的PDA平板中央接種靶標病原菌菌餅，28℃下培養(yǎng)，觀察拮抗反應(yīng)。每處理三個重復(fù)。
對峙培養(yǎng)的結(jié)果如圖1所示，接種靶標病原菌4天后在利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654與靶標菌株黃瓜灰霉病菌、番茄灰霉病菌及甜椒灰霉病菌菌落之間產(chǎn)生明顯的抑菌帶，其寬度分別為20.9mm、21.2mm和22.4mm，且抑菌帶寬度不隨時間的推移而改變；而在對照菌株與靶標病原菌菌落間則無抑菌帶產(chǎn)生(圖1)。圖1中，A02為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654，黃灰為黃瓜灰霉病菌，CK為無拮抗性的對照菌株。
2.菌株代謝產(chǎn)物抑菌活性測定采用實施例1的方法制備利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654的供試真菌抑制劑(無菌發(fā)酵濾液)，然后分別測定以下指標(1)菌絲生長速率抑制測定將制備好的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654無菌發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基混合，分別制備成含有5，10，20，100，200倍稀釋發(fā)酵液的PDA平板，以含有相應(yīng)稀釋倍數(shù)發(fā)酵培養(yǎng)基的PDA平板為對照；平板中央接種番茄灰霉病菌菌餅，28℃下培養(yǎng)，分別在第1，2，3，4，5天用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。每處理三個重復(fù)。
實驗結(jié)果如表3所示，利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654不同濃度無菌發(fā)酵濾液對番茄灰霉病菌菌絲生長均有顯著的抑制作用，其抑制率隨著發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)的增加而降低，隨著時間延長而有所下降。在處理后經(jīng)120h，其5倍和10倍稀釋液對病原菌菌絲生長的抑制率仍達100％，即可以完全抑制番茄灰霉病菌的生長(圖2)。圖2中，CK為未接種利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A02 CGMCC No.1654的發(fā)酵培養(yǎng)基，5倍、10倍、20倍、100倍、200倍分別為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654無菌發(fā)酵液的稀釋倍數(shù)。
表3利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654無菌發(fā)酵濾液對番茄灰霉病菌菌絲生長速率的抑制
注CK為含有相應(yīng)稀釋倍數(shù)發(fā)酵培養(yǎng)基的PDA平板對照。
(2)抑菌圈測定采用平板打孔法。刮取PDA平板上培養(yǎng)產(chǎn)生的番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌的分生孢子，用無菌水制成菌懸液，均勻地涂于新制備的PDA平板上，置超凈工作臺內(nèi)吹干；用直徑7mm的無菌打孔器在平板四周對稱位置打孔，然后每孔中注入利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的無菌發(fā)酵濾液100μl，以未接種利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照；28℃下培養(yǎng)3d，十字交叉法測量抑菌圈直徑。每處理三個重復(fù)。
實驗結(jié)果表明利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654無菌發(fā)酵濾液在PDA平板上可對番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌均產(chǎn)生明顯的抑菌圈，其三次重復(fù)的抑菌圈平均直徑分別為41.0mm和40.4mm(圖3)。圖3中，A、B、C為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654無菌發(fā)酵濾液；D為對照。
(3)孢子萌發(fā)抑制率測定刮取平板上產(chǎn)生的番茄灰霉病菌分生孢子，用發(fā)酵培養(yǎng)基配成10×10倍顯微鏡下每視野50-100個孢子的菌懸液，然后用其將利迪鏈霉菌A02(CGMCC No.1654)的無菌發(fā)酵濾液稀釋成5倍、10倍、20倍、100倍、200倍等5個不同濃度的處理，以不接種利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，用無菌凹玻片在28℃下靜置培養(yǎng)，分別于處理后4h，8h，12h，24h鏡檢孢子萌發(fā)情況，以芽管長度超過分生孢子直徑的一半作為萌發(fā)標準，統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)量并計算萌發(fā)抑制率；每處理三個重復(fù)。
結(jié)果表明利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654對番茄灰霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用十分顯著(如表4)；其無菌發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)≤20時幾乎可以完全抑制病菌孢子萌發(fā)；稀釋倍數(shù)大于20倍而小于100倍時，雖不能完全抑制孢子萌發(fā)，但可顯著降低其萌發(fā)率和芽管伸長速度；100倍稀釋液對孢子萌發(fā)后的芽管頂端具有明顯的致畸抑制作用，使其至少在24h內(nèi)不再繼續(xù)伸長，失去侵染寄主的能力(圖4)。圖4中，1為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654無菌發(fā)酵濾液的100倍稀釋液處理后24h；2為對照處理后24h。
表4S.lydicus A02無菌發(fā)酵濾液對番茄灰霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制
實施例3、利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的溫室防病實驗供試靶標病原菌番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌供試作物品種；中蔬6號番茄、茄門甜椒供試對照藥劑50％灰康懸浮劑(農(nóng)藥登記號Ls20041062，內(nèi)蒙古清源保生物科技有限公司)按照實施例1的方法制備利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654的無菌發(fā)酵濾液。番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌在PDA平板上22℃培養(yǎng)7-10天，待其長出大量分生孢子后，用無菌水洗下孢子，配制成10×10倍鏡下每視野30-50個孢子的菌懸液備用。
實驗設(shè)4個處理利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的無菌發(fā)酵濾液5倍稀釋液和2倍稀釋液(A02發(fā)酵濾液(5×)和A02發(fā)酵濾液(2×))；50％灰康懸浮劑1000倍稀釋液(50％灰康(1000×))；清水對照。每個處理15株苗，三次重復(fù)；各處理隨機排列。
在番茄和甜椒苗長至現(xiàn)蕾開花期接種，先均勻噴施各處理藥劑和清水對照，以葉面滴水為度；待葉面稍干后，再噴霧接種番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌的孢子懸液。接種后用塑料薄膜遮蓋，并以加濕器加濕，22℃條件下保濕48小時；去掉遮蓋后，經(jīng)常噴水勿使過干。接種后第7-10天調(diào)查發(fā)病情況，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果，并利用統(tǒng)計分析軟件SPSS11.0，選擇Duncan法對實驗結(jié)果進行方差分析和多重比較。
病情調(diào)查以葉片為單位進行普查，病害分級標準如下0級無病斑；1級單葉片有病斑3個；3級單葉片有病斑4-6個；5級單葉片有病斑7-10個；7級單葉片有病斑11-20個，部分密集成片；9級單葉片有病斑密集占葉面積25％以上；病情指數(shù)＝〔∑(各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)〕×100防治效果(％)＝〔(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)〕×100實驗數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析結(jié)果如表5至表8和圖5。圖5中，1為50％灰康(1000×)；2為A02發(fā)酵濾液(2×)；3為A02發(fā)酵濾液(5×)；4為清水對照。
表5.利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654發(fā)酵濾液對番茄灰霉病的溫室防治效果
表6Duncan法對表5進行均值多重比較齊次子集結(jié)果
表7.利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654發(fā)酵濾液對甜椒灰霉病的溫室防治效果
表8Duncan法對表7進行均值多重比較齊次子集結(jié)果
表5-8表明，利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的發(fā)酵濾液對番茄灰霉病和甜椒灰霉病均有很好的防效；其2倍稀釋液對二者的平均防效分別達89.34％和90.04％，方差分析和均值多重比較結(jié)果表明其效果顯著高于目前生產(chǎn)上灰霉病防治的優(yōu)良用藥50％灰康懸浮劑；其5倍稀釋液對二者的平均防效分別達83.63％和82.74％，與灰康的防效無顯著差異。因此，利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654和用它制備的抗植物真菌病害的生防制劑在果蔬灰霉病的防治中有良好的應(yīng)用前景。
用按照實施例1的方法制備的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654無菌發(fā)酵濾液處理番茄、甜椒、黃瓜、白菜、茄子、甘藍、小麥、玉米等8種植物種子，結(jié)果表明該生防制劑對番茄和甜椒種子的萌發(fā)和生根有明顯的促進作用，對其它供試作物的種子萌發(fā)沒有抑制作用。
實施例4、菌株利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654抑菌譜的測定采用實施例2中的平板對峙培養(yǎng)法，在PDA平板上檢測利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654對17個供試靶標植物病原真菌菌株的抑制作用，并利用SPSS軟件進行方差分析和多重比較。結(jié)果如表9所示，利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654對供試的全部病原菌均有明顯的抑制作用；這些病原菌共9屬12種，幾乎在半知菌亞門兩大綱的各個目中均有分布；它們對利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的敏感性有一定的差異，Duncan法多重比較的結(jié)果將其分為7個齊次子集；總的看灰霉病菌的6個菌株和番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌、瓜類炭疽病菌的敏感性較高。
本實施例中供試靶標僅僅是隨機選用的植物病原真菌的少數(shù)代表種，而它們無一例外地對利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654具有敏感性；可見本發(fā)明的菌株利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的抑菌譜不會受此限制，至少其對半知菌類應(yīng)該是廣譜的。
表9利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654對供試病原菌的拮抗試驗
注字母a-g分別代表7個齊次子集，凡標有同一字母的各菌株歸在同一子集內(nèi)，其對菌株利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的敏感性無顯著差異序列表<160>1<210>1<211>1361<212>DNA<213>利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)<400>1gtcgaacgat gaacctcctt cgggagggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg60caatctgccc ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggc tctaataccg gatacgacac120ggggtcgcat gacctccgtg tggaaagctc cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc180agcttgttgg tggggtgatg gcctaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg240accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat300attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg360ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg agagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg420gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt480gggcgtaaag agctcgtagg cggcttgtca cgtcggatgt gaaagcccgg ggcttaaccc540cgggtctgca ttcgatacgg gcaggctaga gttcggtagg ggagatcgga attcctggtg600tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc660gatactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc720cacgccgtaa acgttgggaa ctaggtgtgg gcgacattcc acgtcgtccg tgccgcagct780aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga840cgggggcccg cacaagcagc ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta900ccaaggcttg acatacaccg gaaaaccctg gagacagggt cccccttgtg gtcggtgtac960aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga1020gcgcaaccct tgttctgtgt tgccagcatg cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga1080ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc1140ttgggctgca cacgtgctac aatggccggt acaatgagct gcgataccgc gaggtggagc1200gaatctcaaa aagccggtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg1260gagttgctag taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca1320caccgcccgt cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc c136權(quán)利要求
1.利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654。
2.利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654在制備抗植物真菌病害的生防制劑中的應(yīng)用。
3.抗植物真菌病害的生防制劑，是發(fā)酵利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654得到的代謝產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生防制劑，其特征在于所述代謝產(chǎn)物從除去利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654菌體的發(fā)酵濾液中獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生防制劑，其特征在于所述利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7-8，由如下物質(zhì)配成15g黃豆粒，5g蛋白胨，2.5g硫酸銨，10g蔗糖，10g淀粉，0.25g硫酸鎂，0.2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，1g碳酸鈣，加水定容至1000ml；所述利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的發(fā)酵溫度為28-31℃；發(fā)酵時間為90-100小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生防制劑，其特征在于所述植物真菌病害為灰霉病。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生防制劑，其特征在于所述植物真菌病害為番茄灰霉病和/或甜椒灰霉病。
8.一種制備權(quán)利要求3-7中任一所述的抗植物真菌病害的生防制劑的方法，是發(fā)酵利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654，從其發(fā)酵液中分離得到的代謝產(chǎn)物即為抗植物真菌病害的生防制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A02 CGMCC No.1654的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7-8，由如下物質(zhì)配成15g黃豆粒，5g蛋白胨，2.5g硫酸銨，10g蔗糖，10g淀粉，0.25g硫酸鎂，0.2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，1g碳酸鈣，加水定容至1000ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A02 CGMCC No.1654的發(fā)酵溫度為28-31℃；所述發(fā)酵中的通氣量由裝液量為搖瓶體積的1/5、13mm旋轉(zhuǎn)半徑240rpm/min振蕩培養(yǎng)的條件控制，發(fā)酵時間為90-100小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株利迪鏈霉菌及其應(yīng)用。該菌株是利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654。該菌株經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)生具有強烈抑菌作用的活性代謝產(chǎn)物，該活性代謝產(chǎn)物可用于制備廣譜性抗植物真菌病害的生防制劑，用于植物氣傳真菌病害的生物防治。
文檔編號C12R1/465GK1834230SQ200610065620
公開日2006年9月20日 申請日期2006年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月21日
發(fā)明者劉偉成, 裘季燕, 劉建華, 田兆豐, 劉霆, 劉德文, 潘爭艷, 盧彩鴿 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院