專利名稱：一株產(chǎn)納他霉素的利迪鏈霉菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物領域中的一株利迪鏈霉菌及其應用。
背景技術：
納他霉素(Natamycin)是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌抗生素，也稱游霉素或匹馬霉素(Pimaricin)，它由5個多聚乙酰合成酶基因編碼的多酶體系合成，能夠?qū)Ｐ砸种平湍妇兔咕?，阻止絲狀真菌中黃曲霉素的形成。其實際使用劑量為10-6數(shù)量級，具有低劑量、高效率，抗菌作用時間長的特點，是一種高效、安全的天然生物性食品防腐劑和抗菌添加劑，目前已在30多個國家廣泛使用，包括歐盟、大部分北美和東歐國家以及一些中東國家，甚至瑞士這樣對食品安全非常重視的國家也允許在面包和奶酪產(chǎn)品中使用納他霉素。1996年我國食品添加劑委員會對納他霉素進行評價并建議批準使用，1997年3月，我國衛(wèi)生部正式批準納他霉素作為食品防腐劑，其商品名稱為霉克(NatamycinTM)。
納他霉素對幾乎所有的霉菌和酵母菌具有抗性，抑菌作用比山梨酸強50倍左右，且連續(xù)數(shù)年使用也不易引起靶標真菌形成抗性，但對細菌和病毒無效。因此它在以細菌發(fā)酵為基礎的食品行業(yè)有著廣泛的應用前景。作為食品防腐劑，可應用于果醬、黃油、桔汁、生肉和沙拉醬等的防霉，延長食品的保質(zhì)期，防止酵母和霉菌引起的霉變，減少因為變質(zhì)而引起的食品回收，降低生產(chǎn)成本，且不改變食品的風味，滿足消費者對天然食品的要求。納他霉素也可以作為醫(yī)學上的高效抗菌劑，對口腔念球菌感染，真菌性眼角膜潰瘍，角膜炎，皮膚及粘液膜真菌感染等疾病都有很好的治療效果。隨著研究的不斷深入，納他霉素的應用范圍正在繼續(xù)擴大，發(fā)揮著越來越大的作用。
利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus DeBoer et al.)是習居于土壤的腐生微生物，研究歷史悠久，已知有許多菌株在代謝過程中能夠產(chǎn)生各種抗菌活性物質(zhì)。其著名的代表菌株是S.lydicus NRRL2433，該菌株在醫(yī)藥領域研究和應用廣泛，可產(chǎn)生具有廣譜抗細菌和分枝桿菌作用的利迪霉素(Lydimycin)和抗革蘭氏陽性細菌和分枝桿菌的利迪鏈菌素(Streptolydigin)；另外有產(chǎn)生抗少數(shù)大腸桿菌和克氏肺炎桿菌的蘋果酸氧霉素(Malioxamycin)的S.lydicus 1574，以及產(chǎn)生抗革蘭氏陽性細菌和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的抗生素Lydicamycin的菌株。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一株利迪鏈霉菌，該菌株能產(chǎn)生納他霉素。
本發(fā)明所提供的利迪鏈霉菌為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCCNo.1653，是從北京密云縣蔬菜田土壤中分離篩選獲得的，其已于2006年03月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏登記號為CGMCC No.1653。
本發(fā)明的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653可用于納他霉素敏感菌抑制劑的制備。
其中，所述納他霉素敏感菌為納他霉素對其具有抑制作用的真菌，如霉菌或酵母菌。
所述酵母菌具體可為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；所述霉菌具體可為灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種納他霉素敏感菌的抑制劑。
本發(fā)明所提供的納他霉素敏感菌的抑制劑，是發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653得到的代謝產(chǎn)物。
其中，所述利迪鏈霉菌A01 CGMCC No.1653的發(fā)酵培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中含有黃豆粉2％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉0.5％，葡萄糖2％，玉米漿0.25％，(NH4)2SO4 0.25％，MgSO4.7H2O 0.025％，K2HPO4 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.2％，其余為水；其中各組分的百分含量均為質(zhì)量百分含量。
所述發(fā)酵利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的條件為在28℃的條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、180rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)96h-120小時。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述任一所述的納他霉素敏感菌的抑制劑的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述任一所述的納他霉素敏感菌的抑制劑的方法，是發(fā)酵利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653，得到的代謝產(chǎn)物即為納他霉素敏感菌的抑制劑。
其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及發(fā)酵條件同上。
本發(fā)明的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653能產(chǎn)生納他霉素，在納他霉素敏感菌抑制劑的制備中將有廣泛的應用。
圖1A為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653無菌發(fā)酵濾液對酵母菌的抑制作用。
圖1B為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653無菌發(fā)酵濾液對灰葡萄孢的抑制作用。
圖2為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性產(chǎn)物的捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析結果分析圖。
圖3為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性物質(zhì)粗提物的紫外吸收光譜圖。
圖4為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性產(chǎn)物的HPLC第一次分離譜圖。
圖5為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性產(chǎn)物的HPLC第二次分離譜圖。
圖6為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產(chǎn)物純樣品的紫外掃描圖譜。
圖7為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產(chǎn)物純樣品的紅外吸收光譜。
圖8為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產(chǎn)物純樣品的高分辨質(zhì)譜圖(負離子)。
圖9為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產(chǎn)物純樣品的高分辨質(zhì)譜圖(正離子)。
圖10為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產(chǎn)物純樣品的核磁共振氫譜(500MHz)。
圖11為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產(chǎn)物純樣品的核磁共振碳譜(500MHz)。
具體實施例方式 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例中所使用的培養(yǎng)基如下 1、高氏一號培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，KNO3 1.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，可溶性淀粉20g，瓊脂20g，其余為水；所述高氏一號培養(yǎng)基的pH為7.2-7.4。
2、利迪鏈霉菌A01 CGMCC No.1653的種子培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有黃豆粉20g，蛋白胨5g，可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，玉米漿2.5g，(NH4)2SO4 2.5g，K2HPO4 0.02g，NaCl 4g，CaCO3 6g，其余為水；所述利迪鏈霉菌A01 CGMCC No.1653的種子培養(yǎng)基的pH為7.2。121℃滅菌30min。
3、利迪鏈霉菌A01 CGMCC No.1653的發(fā)酵培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有黃豆粉2％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉0.5％，葡萄糖2％，玉米漿0.25％，(NH4)2SO4 0.25％，MgSO4.7H2O 0.025％，K2HPO4 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.2％，其余為水；所述利迪鏈霉菌A01 CGMCC No.1653的發(fā)酵培養(yǎng)基的自然起始pH值為約5.6。其中，各百分含量均為質(zhì)量百分含量。
4、PDA培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯200g，蔗糖10-20g，瓊脂17-20g，其余為水；pH自然。
5、PDB培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯200g，蔗糖10-20g，其余為水；pH自然。
實施例1、利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的分離制備 從北京密云縣蔬菜田采集土樣，取10g加入內(nèi)裝100ml無菌水和適量玻璃珠的三角瓶中，置搖床上于100rpm振蕩20min，取0.5ml加入4.5ml無菌水中，再依次稀釋102、103、104倍，各取以上土壤懸液0.1ml分別均勻涂布在高氏一號培養(yǎng)基平板上，超凈工作臺內(nèi)吹至略干；每濃度3個重復，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)5-10天，挑取放線菌單菌落進行稀釋劃線分離純化，獲得純培養(yǎng)菌株。
初篩獲得的純培養(yǎng)菌株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)0.45μm的無菌微孔濾膜過濾除菌獲得無菌發(fā)酵濾液；以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ACCC20036)、黑曲霉(Aspergillus nigerACCC30005)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea ACCC30091)為指示菌，利用管碟法或洋菜打孔法檢測發(fā)酵液的抗菌活性； 對初篩獲得的有抗菌活性的菌株的無菌發(fā)酵濾液進行乙醇沉淀去雜質(zhì)，上清液進行紫外掃描獲得紫外圖譜，并與多烯類抗生素的圖譜進行比較，篩選出具有多烯類典型吸收峰的紫外圖譜的菌株； 復篩獲得的菌株的無菌發(fā)酵濾液去雜濃縮后進行柱層析分離，并用指示菌跟蹤檢測各分離組分的活性，對主要活性組分進行制備型高效液相色譜分離得到其純樣品；檢測鑒定其純樣品，最終篩選出能夠產(chǎn)生納他霉素的菌株——利迪鏈霉菌A01CGMCC No.1653。
利迪鏈霉菌A01 CGMCC No.1653的微生物學特性鑒定 (1)菌體的形態(tài)特征 革蘭氏染色陽性；在GYM瓊脂、JCM42#瓊脂、燕麥粉瓊脂等培養(yǎng)基上生長7天后，基內(nèi)菌絲發(fā)育良好，無橫隔，不斷裂；氣生菌絲生長良好，多分枝；孢子絲直、柔曲或彎曲，孢子橢圓形。
(2)培養(yǎng)特性 在6種固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性如表1所示。
表1 利迪鏈霉菌A01 CGMCC No.1653的培養(yǎng)特性 (3)生理生化特性 利迪鏈霉菌A01 CGMCC No.1653的生理生化特性如表2所示。
表2利迪鏈霉菌A01 CGMCC No.1653的生理生化特性 注“W”表示弱陽性結果；“+”表示陽性結果；“-”表示陰性結果。
(4)16SrDNA序列 利迪鏈霉菌A01 CGMCC No.1653的部分16SrDNA序列如序列表中序列1所示。與GenBank中相關序列Blast比較的結果表明其屬于鏈霉菌屬；其16SrDNA序列與已知的利迪鏈霉菌菌株NRRL2433相比相似性很高，為100％。
綜合其形態(tài)學特征、培養(yǎng)特性、生理生化特性和16SrDNA序列分析的結果，將其鑒定為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)，并將此菌株定名為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01。利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01已于2006年03月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏登記號分別為CGMCC No.1653。
實施例2、利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653發(fā)酵液的抑菌活性測定 斜面培養(yǎng)將利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653接種到高氏一號斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7-10天至其產(chǎn)生足量的孢子； 種子培養(yǎng)用無菌鉑環(huán)刮取其孢子3-5環(huán)接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶內(nèi)，置可控溫搖床上，在28℃條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、180rpm的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩培養(yǎng)20-24h； 發(fā)酵培養(yǎng)取上述種子培養(yǎng)液按3％(V/V)的接種量接種于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶內(nèi)，在28℃條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、180rpm的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩培養(yǎng)96h-120h。
活性檢測發(fā)酵液經(jīng)0.45μm的無菌微孔濾膜過濾除菌獲得無菌發(fā)酵濾液，分別以釀酒酵母ACCC20036和灰葡萄孢ACCC30091為指示菌。將釀酒酵母ACCC20036接種在PDB培養(yǎng)基中，在25-28℃、以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)12-24h獲得釀酒酵母ACCC20036的菌懸液；將灰葡萄孢ACCC30091接種于PDA培養(yǎng)基，22℃恒溫培養(yǎng)7天，刮取其分生孢子并將其用無菌水配制成106個孢子/ml濃度的灰葡萄孢ACCC30091的菌懸液。將兩種菌懸液分別按2％(體積比)的量加入到裝有融化后冷卻至50℃左右PDA培養(yǎng)基的三角瓶中，混勻后將其倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，每皿30ml，制作帶菌平板，凝固后每皿用直徑7mm的打孔器等距離打4個孔，每孔中注入利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的無菌發(fā)酵濾液80μl，28℃恒溫培養(yǎng)48-96h，十字交叉法測量抑菌圈直徑。結果表明發(fā)酵濾液對釀酒酵母和灰葡萄孢的抑菌圈直徑分別達31.0mm和43.0mm(圖1A和圖1B)。
實施例3、利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653代謝產(chǎn)物的抑菌機理 一、發(fā)酵液中納他霉素的粗提和初步鑒定 將實施例2中所得發(fā)酵液用3倍體積的無水乙醇預處理，4℃靜置2h，以沉淀菌體、固形顆粒、可溶性粘膠狀物、核酸、雜蛋白質(zhì)以及中間代謝產(chǎn)物等，上清液用2層濾紙以布氏漏斗真空抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45℃下減壓濃縮，濃縮液即為活性物質(zhì)粗提物，4℃保存?zhèn)溆谩?br>
采用捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析來鑒別活性物質(zhì)的化學類型，同時在190nm～400nm對其進行紫外全波長掃描。
1、捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析 溶劑系統(tǒng)為I.水飽和的正丁醇；II.含2％(質(zhì)量百分含量)對甲基苯磺酸的水飽和的正丁醇溶液；III.正丁醇∶醋酸∶水(體積比)＝2∶1∶1；IV.含2％(質(zhì)量百分含量)六氫吡啶的水飽和的正丁醇；V.正丁醇飽和的0.5mol/l pH為7.0的磷酸緩沖液；VI.含2％(質(zhì)量百分含量)對甲基苯磺酸的正丁醇飽和的水；VII.苯∶甲醇(體積比)＝4∶1，濾紙用0.5mol/l pH 7.0的磷酸緩沖液處理；VIII.甲醇∶3％(質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液(體積比)＝3∶1，濾紙用5％(質(zhì)量百分含量)硫酸鈉水溶液處理； 采用新華一號濾紙，裁成長16×1cm的紙條；層析在20cm×3cm的試管中進行；具體操作步驟如下 ①每支試管中分別加入各溶劑系統(tǒng)展開劑4ml，用橡皮塞封口，讓展開劑的蒸汽充滿整個展層空間； ②取上述活性物質(zhì)粗提物，用微量移液器或毛細管在濾紙條的一端分多次點樣，每次在自動干手器下邊點邊以熱風吹干，上樣量為15μl，點樣的直徑以不超過5mm為宜； ③待濾紙上的樣品吸干后，先將其懸掛在試管內(nèi)，用橡皮塞密閉管口，使濾紙在展開劑的蒸汽中平衡0.5h后，將其點樣端浸于展開劑中上行展層，勿使溶劑與樣品直接接觸；待展開劑接近前沿時，取出濾紙條懸于通風櫥中晾干或用熱吹風使溶劑盡量揮發(fā)； ④在無菌條件下用定制的方形玻璃盤制備PDA平板，取適量培養(yǎng)好的灰葡萄孢ACCC30091的孢子懸浮液均勻涂布在平板上；將層析后的濾紙條依次貼于平板上，室溫靜置約30min，使紙條上相應部位的活性物質(zhì)滲透擴散到培養(yǎng)基中；用無菌小鑷子取出紙條，并標記其在平板上的位置；將平板置25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h進行生物學顯影； ⑤根據(jù)生物活性顯示的結果，測量有效成分在不同pH下的展層距離，按下述公式計算遷移率Rf值，畫出pH層析譜 Rf＝原點到抑菌圈中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。
層析圖譜(圖2)表明，在溶劑II和溶劑VI中不顯跡，溶劑VII中不移動，即Rf值為0，這與多烯類抗生素在八溶劑系統(tǒng)中的紙層析圖譜相近。這表明活性物質(zhì)可能屬于多烯類抗生素。其中在溶劑III中在點樣量大時偶爾出現(xiàn)一大(Rf＝0.333)一小(Rf＝0.754)兩個抑菌區(qū)域，表明該活性物質(zhì)至少有兩個活性組分。
2、紫外掃描 將上述活性物質(zhì)粗提物用去離子水稀釋40倍，以去離子水做空白對照，采用日立UV-VIS 3010紫外可見分光光度計在190nm～400nm范圍內(nèi)進行全波長掃描。
結果表明紫外吸收光譜中，雖然雜質(zhì)峰較多，但在292nm、305nm和319nm處有明顯的三個吸收峰(圖3)，多次重復該試驗發(fā)現(xiàn)樣品的濃度越大吸收峰的峰值越高，表明活性物質(zhì)的含量越高。這三個典型的吸收峰是多烯類中四烯類抗生素所特有的特征峰，這與捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析的測定結果一致。
據(jù)上述分析，初步確定活性物質(zhì)的有效組分屬于四烯類抗生素。
二、活性物質(zhì)的分離純化 通過大孔樹脂柱層析、硅膠柱層析和高效液相色譜儀HPLC進行逐步分離純化。
1、大孔樹脂吸附柱層析 選用40cm×2.6cm玻璃層析柱，D4006大孔樹脂(天津南開大學化工廠)，大孔樹脂按廠家說明預處理后用適量去離子水調(diào)勻，緩慢加入裝有1/3體積去離子水的層析柱中，同時從柱底部以勻速緩慢放出蒸餾水，使柱中液面始終保持在樹脂層上面。裝至約3/4柱高度，自然沉降6～10h，使平衡后的裝柱體積為150ml。
將納他霉素粗提物與樹脂按2∶1的體積比進行動態(tài)吸附；吸附完畢后，關閉與柱所連的恒流泵，層析柱靜置2h，然后依次用1倍柱體積的去離子水、1.5倍柱體積的50％(體積百分含量)甲醇和2.5倍柱體積的80％(體積百分含量)乙醇洗脫，洗脫速度為0.5ml/min，用自動部分收集器分管收集洗脫液，每管15ml。以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。
結果表明活性洗脫液集中在第35～45管(即自流出量為3.5倍柱體積至4.5倍柱體積之間的洗脫液)。
合并有活性的洗脫液，45℃下減壓濃縮后供下一步分離。
2、硅膠吸附柱層析 選用40cm×2.6cm玻璃層析柱，200～300目硅膠，以體積比為1∶2∶1的正丁醇、甲醇和水的混合液為洗脫液；取約150g硅膠用去離子水浸泡3h，傾去細小顆粒，布氏漏斗真空抽濾除去水分；再用6mol/L HCl浸泡12h，然后用去離子水洗至中性，真空抽干；用無水乙醇浸泡過夜，真空抽干；臨用前在120℃下活化2h，干燥至恒重；層析柱中裝入1/3柱體積的洗脫液，然后緩慢加入用洗脫液混合均勻的硅膠，約至3/4柱高時停止加入，靜置6～10h，使硅膠緩慢沉降。然后用2～3倍體積的洗脫液以1mL/min的流速沖洗柱體，使之平衡。平衡后的柱體積為150ml。取步驟1的大孔樹脂活性洗脫濃縮液10ml上柱進行動態(tài)吸附，用2～3倍柱體積的洗脫液按0.5ml/min的流速進行洗脫，用自動部分收集器分管收集洗脫液，每管5ml。以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。
結果表明其洗脫液中的活性組分集中在第10～18管(即自0.33倍柱體積至0.6倍柱體積之間的洗脫液)。
合并活性洗脫液，45℃真空減壓濃縮，濃縮液用于下一步分離。
3、制備型HPLC分離純化 采用LC-9101型循環(huán)制備HPLC，JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制備柱。
取步驟2的硅膠柱層析后的活性洗脫濃縮液，用0.45μm微孔濾器過濾，自動進樣器進樣，每次進樣量6ml；以甲醇∶水(體積比為7∶3)為流動相進行分離，利用UV檢測器在波長305nm處檢測并自動形成分離圖譜；利用餾分收集器分別收集圖譜中各曲線峰所對應的洗脫液；以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。以2ml/min的泵流速相繼分離2次。
實驗結果表明，第一次HPLC分離共檢測到6個峰，其中在保留時間為57.399min的峰為主要活性峰(圖4)；對其進行的第二次分離檢測到保留時間為38.399min的峰為活性峰(圖5)，其相對峰面積百分比為99.503％，表明樣品純度達99.503％以上。
對最終樣品進行真空濃縮，干燥后呈白色或奶油色粉末。利用島津分析型HPLC分別采用下述兩種方法對其進行純度驗證。
1)取少量樣品溶于70％甲醇水溶液，以甲醇(A)和水(B)為流動相進行梯度洗脫。色譜條件為C18反相柱，柱溫30℃，UV檢測器，檢測波長305nm，SIL-10ADVP自動進樣器進樣10μl，以1ml/min的流速洗脫60min。梯度洗脫步驟如下 結果顯示洗脫曲線為單一的峰，說明其為單一組分，純度達到化學結構測定的要求。
2)取少量樣品溶于70％甲醇水溶液，以乙腈(A)和水(B)為流動相進行梯度洗脫。色譜條件為C18反相柱，柱溫30℃，UV檢測器，檢測波長305nm，SIL-10ADVP自動進樣器進樣10μl，以1ml/min的流速洗脫60min。梯度洗脫步驟如下 結果顯示洗脫曲線為單一的峰，說明其為單一組分，純度達到化學結構測定的要求。
兩種驗證方法得到的結果一致。
三、純化樣品化學結構的解析鑒定 1、紫外吸收光譜(UV) 將上述步驟二純化的樣品極微量溶于超純水中，用日立UV-VIS 3010紫外可見分光光度計在190nm～400nm波長范圍內(nèi)以超純水為空白對照進行全波長掃描，自動形成紫外吸收圖譜。
由紫外掃描圖譜可見，活性物質(zhì)的紫外吸收峰均表現(xiàn)出典型的四烯類抗生素譜型，即在波長281nm、291nm、305nm和319nm附近均有典型的共軛四烯發(fā)色基團的吸收峰，其中波長305nm處吸收值最大，281nm處吸收值最小(圖6)，再次驗證了該活性物質(zhì)屬于多烯類中的四烯抗生素。
2、紅外吸收光譜(IR) 采用KBr壓片法，用德國BRUKER公司TENSOR 27傅立葉紅外光譜儀進行400cm-1-4000cm-1區(qū)域內(nèi)掃描。
活性物質(zhì)純化樣品的紅外光譜如圖7所示，其中vmax3593、3493、3280cm-1為分子中N-H和-OH的伸縮振動特征吸收峰；vmax3017、2978、2940cm-1為分子中-CH3和-CH2的伸縮振動特征吸收峰；vmax1716cm-1為C＝O的強吸收特征峰；vmax1634、1570cm-1為C＝C伸縮振動的特征吸收峰；另外，在vmax1401、1267、1190、1107、1060、1003、885、847、798cm-1等處都有吸收峰。
3、高分辨質(zhì)譜 采用德國BRUKER公司超高分辨率9.4T混合型四級桿傅立葉串聯(lián)質(zhì)譜儀(9.4TQ-FT-MS)；條件capillary 4000，Dry Gas4.0l/s，源溫180℃，scan range300～2000，syringe pump1.5ml/min，數(shù)據(jù)分析軟件為Bruker DaltonicsDataAnalysis 3.4。
由高分辨質(zhì)譜可見，正離子檢測方式，檢測到分子離子峰[M+Na]+為m/z＝688.2938的化合物(圖9)；負離子檢測方式檢測到分子離子峰[M-H]-為m/z＝664.2976的化合物(圖8)。
綜上所述，分析確定活性物質(zhì)的主要活性組分的分子式均為C33H47NO13，分子量為665；由公式不飽和度(n)＝1+Nc+(Nn-Nh)/2(Nc碳原子數(shù)；Nn氮原子數(shù)；Nh氫原子數(shù))計算其分子式的不飽和度為11，表明其分子結構中含有多個不飽和鍵與環(huán)等。
4、核磁共振譜(NMR) 以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)為溶劑，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標，室溫下測定。
采用Bruker AVANCE DRX-500核磁共振譜儀(德國Bruker光譜儀器公司)，以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標，進行氫譜(1HNMR)和碳譜(13CNMR)的測定；前者共振頻率為500.1325156MHz，采樣次數(shù)32768次；后者共振頻率125.7577612MHz，采樣次數(shù)為65536次。
實驗結果表明，活性產(chǎn)物純樣品的1H-NMR圖譜(圖10)中，由于采用DMF做溶劑，使得羧基上的氫被中和，δ＝12的峰消失，同時增加了δ＝3和8的兩處溶劑峰，δ＝6附近的一組峰代表了共軛多烯上的氫，δ＝5左右的一組峰則代表羥基；13C-NMR圖譜(圖11)中，強度最大的峰系由溶劑DMF產(chǎn)生，δ＝180和165的峰表明分子中羧基和酯基的存在，δ＝130左右的一組峰則由共軛多烯產(chǎn)生；當θ＝135°時，DEPT譜圖中CH和CH3峰的譜線朝上，CH2峰的譜線朝下，分子中共有5個-CH2。
綜合分析上述實驗數(shù)據(jù)，判定活性產(chǎn)物的主要活性組分為納他霉素，其化學結構式為
序列表
<160>1
<210>1
<211>1270
<212>DNA
<213>利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)
<400>1
gggtctaata ccggatacga cacggggtcg catgacctcc gtgtggaaag ctccggcggt60
gaaggatgag cccgcggcct atcagcttgt tggtggggtg atggcctacc aaggcgacga120
cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc180
tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgaa agcctgatgc agcgacgccg240
cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag cagggaagaa gcgagagtga300
cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg360
cgcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagagctcgt aggcggcttg tcacgtcgga420
tgtgaaagcc cggggcttaa ccccgggtct gcattcgata cgggcaggct agagttcggt480
aggggagatc ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga ggaacaccgg540
tggcgaaggc ggatctctgg gccgatactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa600
caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgttgg gaactaggtg tgggcgacat660
tccacgtcgt ccgtgccgca gctaacgcat taagttcccc gcctggggag tacggccgca720
aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc agcggagcat gtggcttaat780
tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacataca ccggaaaacc ctggagacag840
ggtccccctt gtggtcggtg tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga900
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgttctg tgttgccagc atgcccttcg960
gggtgatggg gactcacagg agactgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt1020
caagtcatca tgccccttat gtcttgggct gcacacgtgc tacaatggcc ggtacaatga1080
gctgcgatac cgcgaggtgg agcgaatctc aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc1140
tgcaactcga ccccatgaag tcggagttgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg1200
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga1260
agccggtggc 1270
權利要求
1.利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653。
2.利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653在制備納他霉素敏感菌抑制劑中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述納他霉素敏感菌為酵母菌和霉菌。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述酵母菌為釀酒酵母。
5.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述霉菌為灰葡萄孢。
6.一種納他霉素敏感菌的抑制劑，是發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A01 CGMCC No.1653得到的代謝產(chǎn)物。
7.根據(jù)權利要求6所述的抑制劑，其特征在于所述利迪鏈霉菌A01 CGMCCNo.1653的發(fā)酵培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中含有黃豆粉2％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉0.5％，葡萄糖2％，玉米漿0.25％，(NH4)2SO4 0.25％，MgSO4.7H2O 0.025％，K2HPO4 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.2％，其余為水；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的抑制劑，其特征在于發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的條件為在28℃的條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、180rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)96h-120小時。
9.一種制備權利要求6-8中任一所述的納他霉素敏感菌的抑制劑的方法，是發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653，得到的代謝產(chǎn)物即為納他霉素敏感菌的抑制劑。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述利迪鏈霉菌A01 CGMCCNo.1653的發(fā)酵培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中含有黃豆粉2％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉0.5％，葡萄糖2％，玉米漿0.25％，(NH4)2SO4 0.25％，MgSO4.7H2O 0.025％，K2HPO4 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.2％，其余為水；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量；
所述發(fā)酵利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的條件為在28℃的條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、180rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)96h-120小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株利迪鏈霉菌及其應用。該菌株是利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653。該菌株能產(chǎn)生納他霉素，在納他霉素敏感菌抑制劑的制備中將有廣泛的應用。
文檔編號C12N1/20GK101182485SQ20071018743
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月23日 優(yōu)先權日2007年9月29日
發(fā)明者劉偉成, 劉建華, 裘季燕, 盧彩鴿, 霆 劉, 劉德文 申請人:北京市農(nóng)林科學院