專利名稱：在基因重組多肽的生產(chǎn)中抑制副產(chǎn)物生成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于在采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)多肽的過程中抑制副產(chǎn)物生成的方法，以及以抑制副產(chǎn)物生成為特征的基因重組多肽的制造方法。
背景技術(shù)：
在生理活性多肽的生產(chǎn)中，廣泛使用基因重組技術(shù)。本來，遺傳密碼的翻譯通常被極忠實(shí)地進(jìn)行，但在目的多肽基因的翻譯時(shí)，不僅生成該目的多肽，而且往往會(huì)生成混入與密碼表中指定的氨基酸不同的氨基酸或者氨基酸衍生物的多肽。例如，關(guān)于核糖體的mRNA翻譯的不正確度，在根據(jù)〔35S〕Cys摻入高度純化的不含半胱氨酸的大腸桿菌蛋白質(zhì)—鞭毛蛋白中的比例進(jìn)行推斷的場(chǎng)合，該氨基酸摻入的概率是每密碼子大約10-4。如果存在抗生素鏈霉素，與密碼表指定的氨基酸不同的氨基酸進(jìn)入的概率就會(huì)顯著地增大，據(jù)認(rèn)為，這是由于該翻譯將Arg密碼子(CGU和CGC)弄錯(cuò)成Cys密碼子(UGU和UGC)所致(ヴオ-ト生化學(xué)(下)，第2版，東京化學(xué)同人，p869-870，1998)。
另外，Tsai等人曾報(bào)告，在人的IL-2大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)中，原本在甲硫氨酸應(yīng)該進(jìn)入的位置，以高頻度插入正亮氨酸(Tsai，L.B.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.156，p733-739，1988)。同樣的報(bào)告，在牛垂體生成激素的表達(dá)(Bogosian，G.et al.，J.Biol.Chem.，Vol.264，p531-539，1989)中也發(fā)現(xiàn)。在這兩種情況中，通過大腸桿菌的亮氨酸合成路徑活化在細(xì)胞內(nèi)合成正亮氨酸，正亮氨酸代替甲硫氨酸附加在甲硫氨酸t(yī)RNA上，結(jié)果進(jìn)入了已表達(dá)的蛋白質(zhì)中。
進(jìn)而，除了正亮氨酸的錯(cuò)誤摻入以外，Apostol等人指出，在利用大腸桿菌的重組血紅蛋白的生產(chǎn)中，在本來亮氨酸應(yīng)該摻入的位置摻入了正纈氨酸(Apostol I.et al.，J.Biol.Chem.，Vol.272，p28980-28988，1997)。對(duì)于此場(chǎng)合來說，也推斷為大腸桿菌的亮氨酸合成路徑的活化導(dǎo)致了正纈氨酸的生成，然后其代替亮氨酸摻入。
在上述事例中，已經(jīng)知道在代替甲硫氨酸摻入正亮氨酸之目的多肽的事例中，通過增加發(fā)酵培養(yǎng)基中的甲硫氨酸和/或亮氨酸的濃度，或者減少正亮氨酸的量，或者兩者同時(shí)進(jìn)行，可以抑制正亮氨酸摻入在培養(yǎng)基中已增殖的轉(zhuǎn)化微生物中被表達(dá)的異源多肽的方法(日本國(guó)特許第2879063號(hào)、美國(guó)專利第5599690號(hào))。
另一方面，本發(fā)明人研究了利用以大腸桿菌作為宿主細(xì)胞的基因重組的人心房鈉尿肽(以下也記載為hANP，氨基酸序列如SEQ ID No1中所示Kangawa，K.et.al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.118，p131-139，1984)的高效率的生產(chǎn)方法，結(jié)果成功地構(gòu)筑由融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)hANP的高效率生產(chǎn)方法(日本國(guó)特許第1963624號(hào))。在該生產(chǎn)方法中，融合蛋白質(zhì)由大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端的97個(gè)氨基酸構(gòu)成的保護(hù)肽、含有賴氨酸殘基的3氨基酸殘基的連接序列(Gln-Phe-Lys)和hANP構(gòu)成，該融合蛋白質(zhì)基因被編碼在來自pBR322的表達(dá)載體上。利用來自大腸桿菌的乳糖啟動(dòng)子控制融合蛋白質(zhì)基因的復(fù)制，已表達(dá)的融合蛋白質(zhì)在大腸桿菌內(nèi)作為包涵體蓄積。所得到的融合蛋白質(zhì)通過改性劑變成可溶性的后，用特異地識(shí)別并切斷賴氨酸殘基的蛋白酶API(無色桿菌蛋白酶I〔Masaki，T.et al.，Biochim.Biophys.Acta，Vol.660，p51-55，1981〕)處理，釋放hANP，再利用色譜法提純，得到純產(chǎn)物hANP。
本發(fā)明人在研究該hANP生產(chǎn)過程中，發(fā)現(xiàn)了物理化學(xué)性質(zhì)與hANP類似、利用色譜操作不容易分離的雜質(zhì)物。該雜質(zhì)在利用分析型反相高壓液相色譜(RP-HPLC)的分析中，作為在hANP洗脫位置的稍后方洗脫的物質(zhì)被檢測(cè)出，相對(duì)用酶反應(yīng)切出的hANP以約5％的比例存在(下文中將該雜質(zhì)物副產(chǎn)物多肽記載為R1)。另外，該R1在使用生產(chǎn)規(guī)模中使用的制備型高壓液相色譜(HPLC)的場(chǎng)合，不易與hANP發(fā)生分離，其洗脫峰與hANP的洗脫峰的尾部分重疊，因此具有不容易分離的性質(zhì)。
hANP也作為急性心力衰竭的治療用藥使用，像這樣作為藥品使用的hANP，必須是高純度的。目前采用的生產(chǎn)方法，也可以確保作為藥品的充分純度，但在精制過程中要去除副生的多肽R1，因而收率減少，生產(chǎn)成本增大。因此，找到抑制該不純物產(chǎn)生的方法，對(duì)于生產(chǎn)高純度的hANP是一個(gè)重要的課題。
在基因重組多肽的制造中，由于在精制過程中要去除作為雜質(zhì)的副產(chǎn)物，因而收率減少，生產(chǎn)成本出現(xiàn)問題，找出抑制該雜質(zhì)產(chǎn)生的方法，對(duì)于生產(chǎn)高純度的基因重組多肽是十分重要的。因此，本發(fā)明的目的在于，提供在基因重組多肽的生產(chǎn)中抑制副產(chǎn)物生成的方法及以抑制副產(chǎn)物生成為特征的基因重組多肽的制造方法。
發(fā)明的公開本發(fā)明提供了，在經(jīng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造含有絲氨酸殘基的多肽的方法中，通過在培養(yǎng)基中添加組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一種，從而抑制代替絲氨酸殘基而摻入O-乙酰絲氨酸殘基的副產(chǎn)物多肽生成的方法。
此外，本發(fā)明還提供了含有絲氨酸殘基的多肽的制造方法，該方法是培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造含有絲氨酸殘基的多肽的制造方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一種，從而抑制代替絲氨酸殘基而摻入O-乙酰絲氨酸殘基的副產(chǎn)物多肽生成。
附圖的簡(jiǎn)單說明
圖1表示表達(dá)載體pGHα97SII的示意圖。
圖2表示酶反應(yīng)結(jié)束后，用反相HPLC分析從融合蛋白質(zhì)切割出的hANP的結(jié)果。
圖3表示有關(guān)R1的結(jié)構(gòu)分析的質(zhì)譜分析的結(jié)果。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式(1)不純物R1的鑒定為了對(duì)在hANP的生產(chǎn)過程中生成的上述雜質(zhì)進(jìn)行分析，本發(fā)明人使用分析用C18反相高壓液相色譜，分取R1峰，利用質(zhì)譜分析分析其結(jié)構(gòu)，以及進(jìn)行氨基酸序列分析。結(jié)果確認(rèn)，R1是與hANP相比分子量?jī)H大42的物質(zhì)。另外，分析R1的氨基酸序列顯示，其氨基酸序列與hANP是相同的，據(jù)此判斷，R1并不是hANP中的某種氨基酸被別的氨基酸取代而產(chǎn)生，而是含有受到經(jīng)修飾的氨基酸的hANP衍生物。
進(jìn)而，在如果存在數(shù)個(gè)修飾部位的場(chǎng)合，認(rèn)為出現(xiàn)通過它們的組合產(chǎn)生的多種衍生物，但實(shí)際上用分析用HPLC僅得到單峰，由此認(rèn)為修飾部位僅存在一處。關(guān)于修飾基的結(jié)構(gòu)，是在生物合成的過程中產(chǎn)生的修飾反應(yīng)，而且分子量是42，因此認(rèn)為被乙酰化。
關(guān)于乙?；牟课唬鶕?jù)hANP的氨基酸序列，認(rèn)為可能是對(duì)絲氨酸殘基、精氨酸殘基和酪氨酸殘基的修飾。因此，首先對(duì)在hANP的C-末端存在1處的酪氨酸殘基進(jìn)行C-末端氨基酸分析，結(jié)果證實(shí)，R1的C-末端氨基酸是酪氨酰，否定了在酪氨酸殘基中的修飾可能性。進(jìn)而，就精氨酸殘基來說，R1可正常地被特異地識(shí)別精氨酸的蛋白酶(胰蛋白酶)的切斷，因而認(rèn)為這種可能性較小。因此判斷在絲氨酸殘基中產(chǎn)生乙?；?。這是因?yàn)椋l(fā)現(xiàn)作為絲氨酸的乙?；w的O-乙酰絲氨酸殘基在細(xì)胞內(nèi)合成，在多肽的翻譯時(shí)，存在代替絲氨酸殘基而摻入的可能性。另外，根據(jù)融合蛋白質(zhì)中游離出hANP的時(shí)刻能夠檢測(cè)出R1，推測(cè)R1是在翻譯為多肽時(shí)產(chǎn)生。因此判斷，在R1中產(chǎn)生的修飾是融合蛋白質(zhì)的表達(dá)時(shí)產(chǎn)生的，而不是在精制過程中產(chǎn)生。
(2)不純物R1的生成抑制本發(fā)明人研究了在培養(yǎng)過程中減少R1的生成。在以大腸桿菌作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)重組多肽的場(chǎng)合，目前還沒有關(guān)于使分子量?jī)H增大42的修飾的報(bào)告，因此關(guān)于抑制R1生成的方法完全不清楚。因此，本發(fā)明人嘗試從蛋白質(zhì)構(gòu)成成分的氨基酸入手，通過向培養(yǎng)基中添加氨基酸來抑制該氨基酸的生物合成，通過抑制O-乙酰絲氨酸等生物合成中間體的生成，抑制R1的產(chǎn)生。
按下面所述進(jìn)行了試驗(yàn)研究。即，添加18種氨基酸(L-丙氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸和L-組氨酸)中的任一種，培養(yǎng)hANP生產(chǎn)菌，然后比較hANP和R1的生成量。
L-纈氨酸的添加會(huì)妨礙菌的增殖，因而沒有用它來進(jìn)行試驗(yàn)研究。另外，由于酪氨酸的溶解度較低，對(duì)于大量培養(yǎng)時(shí)是不合適的，因此也沒有研究L-酪氨酸的添加，。
研究的結(jié)果表明，這18種氨基酸之中，甘氨酸、組氨酸或者甲硫氨酸的添加，將R1的生成抑制50％以上，這些氨基酸的添加對(duì)于R1生成的抑制效果較大。即，通過向培養(yǎng)基中添加這些氨基酸，可以抑制R1的生成，另外，還有增加每個(gè)菌體的包涵體產(chǎn)量的效果，在大量生產(chǎn)高純度hANP時(shí)是十分有用的方法。另外，上述氨基酸的添加量，只要是在培養(yǎng)終了時(shí)，使添加的氨基酸(甘氨酸、組氨酸和/或甲硫氨酸)的宿主細(xì)胞中的生物合成受到抑制的量即可，例如在培養(yǎng)中監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中的氨基酸含量，適宜地添加，以使任一氨基酸含量不缺乏。另外，根據(jù)菌體的氨基酸組成(Frederick C.H.et al.，Chemical Composition ofEscherichia coli in Escherichia coli and Salmonella，second edition，ASMpress，p.13-16中記載)、得到的菌體濃度、被表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸組成及其表達(dá)量，計(jì)算出需要添加的氨基酸量，從最初就向培養(yǎng)基中添加即使在培養(yǎng)終了時(shí)刻氨基酸也充分殘存的量也是可能的。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，對(duì)于甘氨酸、組氨酸或者甲硫氨酸來說，進(jìn)行了單獨(dú)添加各個(gè)氨基酸的情況的研究，但通過組合這些氨基酸，期待能夠充分進(jìn)一步抑制R1的生成。
另外，雖然本發(fā)明人是在hANP生產(chǎn)的例子中進(jìn)行的上述研究，但在使用基因重組技術(shù)的生產(chǎn)多肽中，形成+42的分子量的雜質(zhì)，即使在生產(chǎn)hANP以外的肽或者蛋白質(zhì)(尤其是含有絲氨酸的蛋白質(zhì))的場(chǎng)合，也經(jīng)常會(huì)發(fā)生，因此本方法能夠廣泛適用于利用基因重組生產(chǎn)的肽或者蛋白質(zhì)。另外，根據(jù)肽或者蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，不僅有1個(gè)絲氨酸殘基，而且有時(shí)具有多個(gè)絲氨酸殘基的情況，在多個(gè)絲氨酸殘基的1處以上生成1種以上的摻入O-乙酰絲氨酸殘基的副產(chǎn)物時(shí)，本發(fā)明也能夠抑制這些副產(chǎn)物的生成。
在本發(fā)明中，作為能夠適應(yīng)的肽的例子，可舉出A型鈉尿肽、B型鈉尿肽、緩激肽、大胃泌素、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽、促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子、Cortistatin、C型鈉尿肽、防衛(wèi)素1、Elafin、α-內(nèi)啡肽、β-內(nèi)啡肽、γ-內(nèi)啡肽、內(nèi)皮肽-1、內(nèi)皮肽-2、大內(nèi)皮肽-1、大內(nèi)皮肽-2、大內(nèi)皮肽-3、腦啡肽、Galanin、大胃泌素、腸抑胃肽、Ghrelin、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-2、生長(zhǎng)激素釋放因子、Histatin 5、胰島素、接合肽、促黃體素釋放激素、促黑素細(xì)胞激素、Midkine、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)肽Y、神經(jīng)降壓肽、催產(chǎn)素、原腎上腺脊髓素N末端20肽、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素相關(guān)肽、肽組氨酸-甲硫氨酸-27、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽38、血小板因子-4、肽T、腸促胰液素、血清胸腺因子、促生長(zhǎng)素抑制素、尿皮質(zhì)素、血管活性腸肽及其衍生物。作為蛋白質(zhì)的例子，可舉出生長(zhǎng)激素及其衍生物。
本發(fā)明優(yōu)選對(duì)含有絲氨酸殘基的、分子量約1000～20000的多肽實(shí)施。另外，含有絲氨酸殘基的多肽，最好是心房性鈉尿肽，最好是人心房性鈉尿肽。
能夠在本發(fā)明中使用的宿主細(xì)胞，只要是能夠在基因重組多肽的制造方法中使用的宿主細(xì)胞即可，沒有特別的限制。例如可以是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞中的任一種，作為原核細(xì)胞可舉出細(xì)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等)，作為真核細(xì)胞可舉出酵母(釀酒酵母屬等)、動(dòng)物細(xì)胞(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞等)。作為宿主細(xì)胞優(yōu)先選用包括細(xì)菌、酵母等的微生物，尤其好是大腸桿菌。
即，本發(fā)明是關(guān)于以下的方面。
a)在經(jīng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造基因重組多肽的方法中，通過在培養(yǎng)基中添加組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一種，抑制副產(chǎn)物多肽生成的方法；b)基因重組多肽的制造方法，該方法是培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造基因重組多肽的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一種，進(jìn)行培養(yǎng)，來抑制副產(chǎn)物多肽的生成；c)上述a)或者b)中記載的方法，其中，副產(chǎn)物多肽是分子量相對(duì)于基因重組多肽為+42的受到修飾的衍生物；d)上述a)至c)中記載的方法，其中，副產(chǎn)物多肽是乙?；难苌?；e)上述a)至d)中記載的方法，其中，基因重組多肽是分子內(nèi)具有絲氨酸的多肽；f)上述a)至e)中記載的方法，其中，基因重組多肽的分子量是約1000～20000；g)上述f)中記載的方法，其中，基因重組多肽是心房性鈉尿肽；h)上述g)中記載的方法，其中，心房性鈉尿肽是人心房性鈉尿肽；i)上述a)至h)中記載的方法，其中，在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造基因重組多肽的方法中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞；j)上述i)中記載的方法，其中，宿主細(xì)胞是微生物；k)上述j)中記載的方法，其中，微生物是大腸桿菌。
產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用可能性本發(fā)明是關(guān)于在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造基因重組多肽的方法中，通過在培養(yǎng)基中添加組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一種，抑制副產(chǎn)物多肽生成的方法，以及以抑制副產(chǎn)物生成為特征的基因重組多肽的制造方法。特別是具有抑制代替絲氨酸殘基而摻入O-乙酰絲氨酸殘基的副產(chǎn)物多肽生成的效果，按照本發(fā)明，可以以比以往低的生產(chǎn)成本提供高純度的基因重組多肽。
實(shí)施例以下，通過實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明。本專業(yè)的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變更、修飾，因此，本發(fā)明不受實(shí)施例的限制，本發(fā)明也包括這些變更和修飾。
實(shí)施例1表達(dá)載體的制備將由大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端部分的97氨基酸組成的保護(hù)肽(SEQID No2)、含有賴氨酸殘基的3種氨基酸殘基的連接序列(Gln-Phe-Lys)及hANP(SEQ ID No1)構(gòu)成的融合蛋白質(zhì)之編碼基因，克隆在缺失BalI-PvulI區(qū)域的pBR322(Nature.1980；283216-8)的EcoRI、DraI部位，制成表達(dá)載體pGHα97SII(圖1融合蛋白質(zhì)基因序列省略)。表達(dá)載體的構(gòu)建方法采用常規(guī)方法。
實(shí)施例2R1的鑒定(1)培養(yǎng)及包涵體回收用發(fā)酵罐，使用表1所示的NU培養(yǎng)基培養(yǎng)導(dǎo)入上述的表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌W3110菌株(W3110/pGHα97SII)。
表1 NU培養(yǎng)基的組成(每1L培養(yǎng)基)酵母提取物 4g磷酸二氫鉀 4g磷酸氫二鉀 4g磷酸氫二鈉 2.8g氯化銨 0.2g硫酸銨 1.2gMgSO4·7H2O 2gFeSO4·7H2O 40mgCaCl2·2H2O 40mgMnSO4·nH2O 10mgAlCl2·6H2O 10mgCoCl2·6H2O 4mgZnSO4·7H2O 2mgNa2MoO4·2H2O 2mgCuCl2·2H2O 1mgH3BO40.5mg鹽酸四環(huán)素 2mg在葡萄糖濃度4.5％、33℃、pH7.0、溶解氧濃度30％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別通過滴入氨水、提高攪拌轉(zhuǎn)速來控制pH和溶解氧濃度。葡萄糖消耗后，將培養(yǎng)溫度控制在37℃，通過逐漸添加甘油作為碳源，促進(jìn)hANP融合蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)行約30小時(shí)的培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的菌體中看到包涵體的形成，已表達(dá)的融合蛋白質(zhì)相當(dāng)于總菌體蛋白質(zhì)的30％以上。
培養(yǎng)后，使用Mantnn-Gaulin勻漿器(15M-8AT)，在500kg/cm2的條件下對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行勻漿化處理，利用離心分離機(jī)回收沉淀級(jí)分(包涵體)。接著，添加等量的30mM Tris·HCl(pH9.3)緩沖液，進(jìn)行懸浮后，再次進(jìn)行離心分離，回收沉淀。將該洗凈操作再反復(fù)一次，將最終得到的沉淀懸浮在適量的30mMTris.HCl(pH9.3)緩沖液中。
(2)R1的檢測(cè)接著，將得到的包涵體懸浮/溶解在含有5M尿素的30mM Tris·HCl(pH9.3)緩沖液中。使用量為在包涵體懸浮于水中時(shí)OD660值為220的量。向該包涵體溶液中，以3.5單位/L比例添加API(和光純藥)，在30℃下進(jìn)行1.5小時(shí)切割反應(yīng)。圖2是使用反相HPLC分析酶反應(yīng)終了后切出的hANP的圖。在柱溫度40℃、流速1ml/min，使用A液三氟乙酸溶液(1→1000)和B液乙腈/三氟乙酸溶液(0.95→1000)混合液(1∶1)，采用使B液的初始濃度為43％、分析開始后每次一定量地增加B液、在16分鐘達(dá)到52％的梯度法進(jìn)行分析。作為對(duì)hANP的相對(duì)洗脫時(shí)間為1.1的雜質(zhì)檢測(cè)出R1。
(3)R1的精制接著，為了R1的結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)行R1的精制。在酶處理終了后的反應(yīng)液中添加乙酸，使pH成為5.0，使保護(hù)肽沉淀后，通過離心分離去除沉淀。接著，在用含有2.5M尿素的50mM乙酸銨液(pH5.0)平衡化的CM-Toyopearl柱(TOSOH)中添加上清液，吸附R1和hANP后，利用氯化鈉的鹽濃度梯度使其洗脫，分取含有hANP和R1的級(jí)分。
向得到的級(jí)分中加入相當(dāng)于20％(體積/體積)量的乙酸，向十八烷基(C18)作為配位基的反相系柱(soken ODS)上樣，使hANP吸附在柱中后，利用乙腈濃度梯度使hANP溶出，分取含有hANP和R1的級(jí)分。
將這樣得到的級(jí)分加在分析用反相HPLC柱(YMC-Pack ODS-A-3024.6mm×150mm)上，分取R1的峰，得到高純度的R1。
(4)R1的結(jié)構(gòu)分析通過采用愛德曼法測(cè)定N末端的氨基酸序列以及采用質(zhì)譜(電子噴霧離子化法)測(cè)定分子量，進(jìn)行R1的結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N末端的序列與hANP的序列一致。另一方面，質(zhì)譜分析的結(jié)果表明，分子量是3122，與hANP的分子量3080相比，是僅大42的分子(圖3)。當(dāng)考察這些分析結(jié)果時(shí)，推測(cè)R1是受到某種修飾的hANP。關(guān)于該修飾基，根據(jù)+42的分子量和細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的修飾反應(yīng)，推測(cè)是乙?；?。根據(jù)hANP的氨基酸序列推測(cè)，可能是對(duì)絲氨酸殘基、精氨酸和酪氨酸殘基的修飾，尤其是對(duì)絲氨酸殘基的修飾可能性較大。業(yè)已知道，絲氨酸的乙酰體的O-乙酰絲氨酸在細(xì)胞內(nèi)合成(Kredich，N.M.Biosynthesis of cysteinin Escherichia coli and Salmonell，second edition ASM press，p514-527)，因此認(rèn)為，在翻譯為多肽時(shí)，O-乙酰絲氨酸代替絲氨酸摻入。
實(shí)施例3氨基酸的添加和R1的生成抑制(1)培養(yǎng)在100ml的LBD培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％葡萄糖、0.1mol磷酸鉀緩沖液〔pH7.0〕)中接種W3110/pGHα97SII的冷凍保存菌，在37℃進(jìn)行約7小時(shí)振蕩培養(yǎng)。在得到的培養(yǎng)液中添加甘油，使最終濃度成為10％后，向20個(gè)膠塞粉針瓶中各分注1mL，進(jìn)行冷凍保存，在以后的實(shí)驗(yàn)中使用。
將該冷凍保存菌接種在200mL的表1的NU培養(yǎng)基(但變更為，pH7.2、作為碳源使用葡萄糖(4g/L)，酵母提取物變成0.1g/L)中，在33℃進(jìn)行一夜振蕩培養(yǎng)。利用離心分離進(jìn)行集菌，用生理食鹽水(0.9％NaCl)洗凈一次，適量添加生理食鹽水(0.9％NaCl)進(jìn)行懸浮，使之成為最初的菌體濃度的7倍至8倍。
接著，將2mL該菌體懸浮液添加在以3g/L濃度含有L-丙氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸和L-組氨酸中任一種的100mL的NU培養(yǎng)基(但，pH6.9-7.0、酵母提取物0.1g/L、作為碳源使用甘油(10g/L))中，在37℃培養(yǎng)一夜。
(2)包涵體回收及R1的生成抑制通過離心分離(7000轉(zhuǎn)/分、20分鐘)從各燒瓶的培養(yǎng)液中回收菌體后，懸浮于5ml的去離子水中，利用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行破碎處理。接著，通過離心分離(12000轉(zhuǎn)/分、5分鐘)將包涵體回收在沉淀級(jí)分中，用5ml的30mMTris·HCl(pH9.3)緩沖液進(jìn)行懸浮，再進(jìn)行離心分離(12000轉(zhuǎn)/分、5分鐘)，進(jìn)行包涵體的洗凈和濃縮。
接著，將得到的包涵體懸浮/溶解于含有5M尿素的30mM Tris·HCl(pH9.3)緩沖液中。使用的量在包涵體懸浮于1mL的水中時(shí)OD660值成為22的量。添加0.004單位/mL反應(yīng)液的API蛋白酶(和光純藥)，通過在30℃、約150分鐘的反應(yīng)以使hANP從融合蛋白質(zhì)游離。反應(yīng)后，進(jìn)行離心分離(12000轉(zhuǎn)/分、5分鐘)。向得到的300μL的上清液中添加13.5～15.5μL的5％乙酸，用450μL的精制水進(jìn)行稀釋。通過離心分離(12000轉(zhuǎn)/分、5分鐘)去除在該操作中產(chǎn)生的沉淀，用HPLC(柱YMC-Pack ODS-A302)分析。根據(jù)相對(duì)hANP的峰面積的面積比計(jì)算出R1濃度。
表2是將R1對(duì)hANP的生成量進(jìn)行相對(duì)比較。
表2 R1對(duì)hANP的生成量的比較
其結(jié)果表明，在已進(jìn)行研究的氨基酸內(nèi)，添加組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸對(duì)R1的生成抑制效果大，與對(duì)照組(不添加氨基酸的情況)相比，R1的生成量減少50％以上。另外還表明，這些氨基酸的添加，具有使每個(gè)菌體的包涵體生產(chǎn)量增加的效果。在有R1生成抑制效果的組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中，如果考慮包涵體的生產(chǎn)量，添加甲硫氨酸時(shí)，R1相對(duì)hANP的生成量最低，對(duì)R1的生成抑制是有特別有效的。
另外，L-亮氨酸、L-苯基丙氨酸和L-半胱氨酸使融合蛋白質(zhì)表達(dá)降低。因此不能回收包涵體，這些氨基酸的添加對(duì)hANP生產(chǎn)是無效的。
序列表<110>サントリ-株式會(huì)社<120>在基因重組多肽的生產(chǎn)中抑制副產(chǎn)物生成的方法<130>YCT-601<160>2<210>1<111>28<212>PRT<213>人<223>hANP<400>1Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly1 510 15Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr20 25<210>2<211>97<212>PRT<213>大腸埃希氏菌<213>β-半乳糖苷酶N末端<400> 2Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp1 510 15Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro20 25 30Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser35 40 45Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro50 55 60Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Glu Ser Asp Leu Pro Glu65 70 75 80Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp85 90 95Ala
權(quán)利要求
1.在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造含有絲氨酸殘基的多肽的方法中抑制副產(chǎn)物多肽生成的方法，其特征在于，通過在培養(yǎng)基中添加組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一種，以抑制代替絲氨酸殘基而摻入O-乙酰絲氨酸殘基的副產(chǎn)物多肽生成。
2.含有絲氨酸殘基的多肽的制造方法，該方法是培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造含有絲氨酸殘基的多肽的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一種，進(jìn)行培養(yǎng)，抑制代替絲氨酸殘基而摻入O-乙酰絲氨酸殘基的副產(chǎn)物多肽生成。
3.權(quán)利要求1或2記載的方法，其特征在于，在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造含有絲氨酸殘基的多肽的方法中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3記載的方法，其中，宿主細(xì)胞是微生物。
5.權(quán)利要求4記載的方法，其中，微生物是大腸桿菌。
6.權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)記載的方法，其中，含有絲氨酸殘基的多肽的分子量是約1000～20000。
7.權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)記載的方法，其中，含有絲氨酸殘基的多肽是心房性鈉尿肽。
8.權(quán)利要求7記載的方法，其中，心房性鈉尿肽是人心房性鈉尿肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了,在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造含有絲氨酸殘基的多肽的方法中,通過在培養(yǎng)基中添加組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一種,以抑制代替絲氨酸殘基而摻入O－乙酰絲氨酸殘基的副產(chǎn)物多肽生成的方法,以及培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制造含有絲氨酸殘基的多肽的方法,該方法的特征是,通過在培養(yǎng)基中添加組氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸中的至少一種進(jìn)行培養(yǎng),以抑制代替絲氨酸殘基而摻入O－乙酰絲氨酸殘基的副產(chǎn)物多肽生成。
文檔編號(hào)C12N15/16GK1372595SQ01801203
公開日2002年10月2日 申請(qǐng)日期2001年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月10日
發(fā)明者籔田雅之, 澤野俊博, 增田由美子, 大末和廣 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社