專利名稱：Lgals9基因作為豬初生重性狀相關(guān)的分子標記及制備方法與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于豬的分子標記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇 的與初生重性狀相關(guān)的分子標記的克隆及應用。本發(fā)明的分子標記與LGALS9基因有關(guān)。
背景技術(shù)：
豬是重要的經(jīng)濟動物，豬肉由于其肉嫩味美長期以來廣受消費者的青睞，是我國 人民動物性蛋白的主要來源之一。近年來，人們對豬肉的消費量與日俱增，如何提高生產(chǎn)性 能、降低生產(chǎn)成本成了豬育種工作者的工作重點之一。分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展為此提供了重要的契機，憑借這一技術(shù)手段，科學家 們發(fā)掘出了一大批與豬的初生重，生長速度，斷奶重，產(chǎn)仔數(shù)等重要的繁殖性狀有著顯著關(guān) 聯(lián)的分子標記。這為提高豬的生產(chǎn)性能提供了理論依據(jù)，并從實質(zhì)上使之得到了很大的提
尚ο豬的初生重作為一個重要的繁殖性狀，與豬出生后的生長速度及育成率有著不 可分割的密切聯(lián)系。最近有很多文獻報道了初生重對生長速度的影響，李劍豪(李劍 豪.長白豬初生重對生長速度及哺育率的影響.仔豬生產(chǎn)[J].2006. 18)研究發(fā)現(xiàn)長白 豬60日齡重與35日齡重均與初生重呈正相關(guān)且初生重與生長速度呈正相關(guān)。Beaulieu 等(Beaulieu AD 等，Impact of piglet birth weight, birth order and litter size on subsequentgrowth performance, carcass quality, muscle composition and eating quality of pork [J], J Anim Sci. 2010)研究發(fā)現(xiàn)，初生重較低的豬生長速度較慢，從而使 其進入市場的時間增加。另有研究表明仔豬的初生重與育成率亦悉悉相關(guān)，初生重在l.OKg 以下時仔豬育成率隨著初生重的增加而上升；初生重在1. OKg以上時仔豬育成率沒有明顯 的規(guī)律。初生重小于等于0.5Kg時仔豬育成率僅為55. 56% (高建國.二花臉豬初生重對 生長速度及育成率的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，1992，24(1) :26)。此外，科學家發(fā)現(xiàn)體重越輕 的新生兒，其長大后患II型糖尿病、心血管疾病和高血壓的風險越大，今年四月的一篇研 究報道首次證明這一現(xiàn)象與基因的變異有關(guān)(Freathy RM等，Variants in ADCY5 and near CCNLl are associated with fetal growth and birthweight[J]. Nat Genet,2010,42 (5) 430-435)。因此，對豬初生重相關(guān)基因的克隆和鑒定可為解釋豬和其它哺乳動物胎兒生長 發(fā)育的遺傳機制提供重要線索，并為豬的繁殖性狀遺傳改良提供理論依據(jù)。凝集素半乳糖蛋白家族是一類含有碳水化合物識別區(qū)域(carbohydrate recognition domain, CRD)能與β半乳糖結(jié)合的蛋白質(zhì)。功能包括細胞外功能如與細胞 表面和細胞外基質(zhì)糖蛋白、糖脂的互作以及細胞內(nèi)功能如與細胞質(zhì)和核蛋白的互作。參 與細胞粘附、增殖、凋亡、趨化、炎性反應以及T細胞死亡等調(diào)控多種生物學過程(Zick Y 等，Role of galectin-8 as a modulator of cell adhesion and cell growth [J]. Glycoconj J，2004，19 :517_526 ；Lahm H 等，Tumor galectinology :insights into the complex network of a family ofendogenous lectins[J]. Glycoconj J，2004，20
3227-238 ；Friedrichs J 等，Contributions of galectin-3 and_9 toepithelial cell adhesion analysed by single cell force spectroscopy[J]. J Biol Chem，2007，282 : 29375-29383)。半乳糖蛋白因子9 (LGALS9)是該蛋白家族的一個成員，屬于隨機重復亞家 族，在氨基端和羧基端分別含有一個碳水化合物識別區(qū)域，從而結(jié)合兩種不同的糖類，兩種 識別區(qū)域通過一個接頭蛋白連接起來(WadaI等，Identification and characterization of galectin-9, a novel β -galactoside-binding mammalian lectin[J]. J BiolChem, 1997，272 =6078-6086)。近期研究表明，LGALS9是新的子宮內(nèi)膜中晚期分泌相和蛻膜的 標記基因(Popovici RM 等，Galectin-9 :a new endometrial epithelial marker for the mid-and late-secretory and decidualphases in humans[J]. J Clin Endocrinol Me tab，2005，90 (11): 6170-6176)。人月經(jīng)周期分泌相子宮內(nèi)膜和早期妊娠的蛻膜中， LGALS9只在上皮細胞表達，尤其是腺上皮和腔上皮表達量很高，而在基質(zhì)細胞和免疫細 胞不表達(Shimizu Y 等，Expression and localization of galectin-9 in the human uterodome[J], Endocr J，2008，55 (5) 879-887) 0由于半乳糖蛋白家族能與細胞粘附分 子如層粘連蛋白和纖連蛋白結(jié)合，因此LGALS9基因被認為與子宮內(nèi)膜的容受性有關(guān)，可能 是結(jié)合子宮內(nèi)膜上皮細胞和囊胚細胞的中間蛋白，在胚胎附植中可能發(fā)揮重要作用(Gray CA 等’ Discovery and characterization of an epithelial—specific galectin in theendometrium that forms crystals in the trophectoderm[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101 =7982-7987)。而胚胎附植的早晚與初生重有一定的關(guān)系，因此本研究擬探討 LGALS9基因與初生重的關(guān)系。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于從LGALS9基因中克隆一種作為豬標記輔助選擇的與初生重性 狀相關(guān)的分子標記，其制備方法與在豬標記輔助選擇關(guān)聯(lián)分析上的應用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)申請人:從報道基因LGALS9克隆得到與豬初生重性狀相關(guān)基因的部分DNA片段，它 的DNA序列如序列表SEQ ID NO 1和附圖2所述。在序列表SEQ ID NO 1的第195bp處 有一個A195-C195的堿基突變，導致BtscI-RFLP多態(tài)性。這個堿基突變位于LGALS9基因 3，-UTR 中。本發(fā)明所述的分子標記的制備方法是用豬STS序列(GenBank收錄號BV726873)為模板設計引物；提取基因組 DNA，設計引物，該引物的DNA序列如下所示正向5，GACATCCAGCTGACGCACG 3，，反向 5’ GCTGGTGGCTTGGGACTAGG 3’。PCR擴增、PCR產(chǎn)物純化和測序，獲得如序列表SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。應用常規(guī)的PCR-RFLP的方法對序列表SEQ ID NO=I所示的第195位堿基突變進 行了檢測，并初步進行其基因型與豬初生重性狀之間的關(guān)聯(lián)分析的應用，為豬的分子標記 輔助選擇提供了 一個新的分子標記。更詳細的技術(shù)方案請參見說明書的《
》及《具體實施方式
》中的實施例。
序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明克隆的豬免疫性狀相關(guān)基因LGALS9的部分DNA序 列，序列全長為375bp，在該序列的的第195bp處有一個A195-C195的堿基突變。圖1 是本發(fā)明技術(shù)流程圖。圖2 是本發(fā)明中豬LGALS9基因的DNA序列，圖中突變位點用標有下劃線的加粗 斜體字顯示，所述的引物序列用斜體加粗及陰影顯示。圖3 是本發(fā)明中豬LGALS9基因3，-UTR區(qū)的BstcI-RFLP的三種基因型(AA AC CC)和基因組擴增電泳結(jié)果(P)，圖中M =DNA分子量標準(DL50 ladder)。圖4 是本發(fā)明中豬LGALS9基因正向測序發(fā)現(xiàn)的A-C突變。
具體實施例方式實施例1 豬LGALS9基因部分DNA序列擴增(1)引物設計以報道的豬STS序列(GenBank收錄號BV726873)為模板，利用生物學引物設計軟 件Primer Premier5. 0，設計擴增LGALS9基因3，-UTR的引物，該引物對的DNA序列如下LGALS9 正向引物5，GACATCCAGCTGACGCACG 3，，(對應于序列表 SEQ ID NO 1 的 第1-19位)，反向引物5，GCTGGTGGCTTGGGACTAGG3，(對應于序列表 SEQ ID NO 1 的第 356-375 位)；該引物的DNA序列擴增片段長度為375bp。(2) PCR 擴增反應PCR反應反應總體積為10 μ 1，其中豬DNA模板0.5 μ 1，雙蒸水7.0 μ 1，buffer 1μ l，Mg2+ 0.6 μ 1，IOmM 正向引物和反向引物各 0.3 μ l，dNTP 0. 2 μ 1，Taq 酶 0· 1μ 1 (IOU/ μ 1)。PCR反應條件為94°C預變性5min后，循環(huán)35次94°C變性30s、61°C退火30s、72°C 延伸25s，最后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3) PCR產(chǎn)物的純化和測序PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放 入1.5ml離心管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自新長江生物科技(北京)有限公 司，按照該試劑盒的說明書操作)純化PCR產(chǎn)物，具體步驟是按照IOOmg膠塊加入400 μ 1 Gel-Shift結(jié)合緩沖液(GS Buffer)的比例加入GS緩沖液，置50°C溫育lOmin，使瓊脂糖 膠塊完全溶化，每兩分鐘顛倒混勻一次；將溶化的膠液轉(zhuǎn)入到離心吸附柱，并將離心吸附 柱置于廢液收集管中，IOOOOrpm離心30s，棄去廢液；將離心吸附柱置回廢液收集管中，加 入500μ1 Wash Buffer于離心吸附柱中，IOOOOrpm離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用 500 μ 1 Wash Buffer溶液洗滌一次；將離心吸附柱置會廢液收集管中，最高速度離心lmin ； 小心取出離心吸附柱，將其套入一個無菌的1. 5ml離心管中，在吸附膜中央加入30 μ 1雙 蒸水，室溫靜置2-lOmin后，最高速度離心Imin ；取出離心吸附柱，將1. 5ml離心管(DNA溶 液)置于_20°C保存?zhèn)溆谩?4)DNA序列測定序列測定由深圳華大基因科技有限公司完成，基因片段測正反 兩個反應。
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實施例2 =PCR-RFLP診斷方法建立(I)PCR-RFLP引物序列(該引物也是擴增LGALS9基因3，-UTR的引物)，LGALS9 SNP 正向 5，GACATCCAGCTGACGCACG 3，，(對應于序列表SEQ ID N0:1 的第 1-19 位)，反向 5，GCTGGTGGCTTGGGACTAGG 3，。(對應于序列表 SEQ ID NO 1 的第 356-375 位)；該引物擴增片段長度為375bp。(2) PCR擴增條件PCR反應總體積10 μ 1，其中豬基因組DNA模板1 μ 1，雙蒸水7. 1 μ 1，10 X緩沖液 1 μ 1，IOmM 正向引物和反向引物各 0. 3 μ 1，dNTP 0.2 μ 1，Taq 酶 0. 1μ 1(5υ/μ 1)。PCR 反 應條件為94°C預變性5min后，循環(huán)35次94°C變性20S、61°C退火30s、72°C延伸20s，最后 72 0C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3) RFLP 檢測PCR產(chǎn)物酶切反應體積是10 μ 1，其中PCR產(chǎn)物3 μ 1，雙蒸水5.9 μ 1，10 X緩沖液 1μ 1，限制性內(nèi)切酶BstcI為0. 1μ 1(10υ/μ 1)，將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置4h，用 4%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。用引物擴增豬基因組DNA得到了 375bp特異性擴增片段，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段 在第195位發(fā)現(xiàn)一個A-C顛換，位于3，-UTR區(qū)(如圖4所示)，造成一個BstcI酶切位 點(GGATGNIT)，其中第197bp處為多態(tài)性酶切位點。酶切產(chǎn)生三種基因型，CC基因型只 有375bp —條帶，AA基因型有197bp和178bp兩條帶，雜合子AC基因型有375bp，197bp和 178bp的三條帶，如圖3所述。實施例3 本發(fā)明的分子標記在豬群中的多態(tài)性應用利用PCR-BstcI-RFLP檢測了廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺原種豬場 的“長白豬”群(一種具有國外豬血緣的豬種)，豬群的基因型頻率、基因頻率、香農(nóng)指數(shù) (Longuet-Higgins MS. On the Shannon-Weaverindex of diversity,in relation to the distribution of species in bird censuses[J]. Theor PopulBiol,1971,2 (3) :271_289) 和X 2檢驗P值如表1所示，結(jié)果顯示LGALS9基因各基因型在長白豬種均有分布，AA基因 型數(shù)最少，AC基因型數(shù)最多，長白豬是C等位基因占優(yōu)勢；LGALS9基因的香農(nóng)指數(shù)較高，達 到0. 973，說明該廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺原種豬場的長白豬群的多樣性較大； 對該基因進行Hardy-Weinberg平衡定律適合性檢驗，結(jié)果表明在長白豬群中LGALS9基因 的基因型和基因頻率的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P > 0. 05)。表1本發(fā)明的PCR-BstcI-RFLP多態(tài)性在長白豬中的分布
個體數(shù)基因型基因頻率香農(nóng)指數(shù)χ2檢驗P值AA AC CCA C34161 153 1270. 403 0. 5970. 973p>0. 05實施例4 本發(fā)明的分子標記在豬繁殖性狀標記性狀關(guān)聯(lián)分析中的應用本實施例豬群來自廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺原種豬場的長白豬群，父 母代及子一代全部進行了基因型檢測，子代出生0天測定體重。
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根據(jù)采集樣品的群體結(jié)構(gòu)，申請人運用混合模型來統(tǒng)計分析LGALS9基因SNP位點 的基因型效應及其與初生重性狀的關(guān)系 其中Y為初生重性狀測定值向量；X為固定效應關(guān)聯(lián)矩陣；β為固定效應參數(shù)向 量，包括性別效應、胎次效應、線別效應、候選基因的基因型效應；Z為混合模型中的隨機效 應的關(guān)聯(lián)矩陣；Y為所有隨機效應參數(shù)向量，包括公畜效應、公畜內(nèi)母畜效應；e為隨機殘 差效應；采用SAS (Version 8. 0)軟件中MIXEDM0DELS程序進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。對豬LGALS9基因3，_UTR區(qū)BstcI-RFLP多態(tài)性位點與初生重性狀進行關(guān)聯(lián)分析， 由表2可知在341個個體中AA基因型有61個，AC基因型有153個，CC基因型有127個。 不同基因型之間性狀差異顯著性的結(jié)果如表2所示，結(jié)果顯示豬LGALS9基因3’ -UTR區(qū) BstcI-RFLP多態(tài)性位點各基因型與長白豬初生重呈極顯著關(guān)聯(lián)，其P值為0. 0063。通過最 小二乘均數(shù)對AA、AC和CC基因型的個體進行兩兩比較，結(jié)果表明AC基因型個體的初生重 顯著高于AA型和CC型個體(P值分別為0. 0422和0. 0026)，但AA型和CC型個體初生重無 顯著差異(P = 0. 6288)。表2豬LGALS9基因3’ -UTR區(qū)A/C多態(tài)性位點基因型與初生重的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
基因型個體數(shù)初生重(Kg)AA611.5994±0.06792AC1531.7081土0.06007CC1271.5723土0.05507F檢驗0.0063**P值AA-AC AA-CC AC-CC0.0422* 0.6288 0.0026**注** 表示 P < 0. 01，* 表示 P < 0. 05c
權(quán)利要求
一種作為分子標記應用的與豬初生重相關(guān)的LGALS9基因，它的部分核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所述，在序列表SEQ ID NO1的第195bp處有一個A195 C195的堿基突變，導致BtscI RFLP多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其中擴增LGALS9基因3’_UTR所用的引物對的DNA序 列如下所示正向引物5 ‘ -GACATCCAGCTGACGCACG-3 ‘，反向引物5 ‘ -GCTGGTGGCTTGGGACTAGG-3 ‘。
3.一種制備與與豬初生重相關(guān)的分子標記的方法，其方法包括以下步驟從豬血液中提取基因組DNA，以豬LGALS9基因為模板設計引物，該引物 的DNA序列如下所示正向引物5 ‘ -GACATCCAGCTGACGCACG-3 ‘，反向引物 5 ‘ -GCTGGTGGCTTGGGACTAGG-3 ‘，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，獲得如序列表 SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列，在序列表SEQ ID NO 1的第195bp處有一個A195-C195 的堿基突變，導致BtscI-RFLP多態(tài)性。
4.權(quán)利要求1所述的基因在豬分子標記輔助育種中的應用。
5.權(quán)利要求2所述引物對在豬分子標記輔助育種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子標記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇應用的與初生重性狀相關(guān)的分子標記及應用。所述的分子標記由LGALS9基因克隆得到，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。在序列表SEQ ID NO1的第195bp處有一個A195-C195的堿基突變，導致BtsC I-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴增LGALS9基因3’-UTR區(qū)部分序列所用的引物以及用于多態(tài)性檢測方法，為豬的標記輔助選擇提供了一個新的分子標記。
文檔編號C12N15/12GK101906422SQ20101022303
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者余梅, 朱猛進, 李小平, 李長春, 梁躍, 趙書紅 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學