一種用大蒜花序軸進行脫毒快繁的方法及應用與流程

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及大蒜組織培養(yǎng)與快繁的方法，更具體的說是構(gòu)建一種用大蒜花序軸進行脫毒快繁的新方法。

背景技術(shù)：

大蒜(Allium sativum L.)是百合科蔥屬一年生植物，大蒜栽培品種多不能形成種子，通常采用無性繁殖。這就使大蒜的生物多樣性和遺傳特性受到限制，造成嚴重的種性退化，嚴重影響大蒜的產(chǎn)量和品質(zhì)。長期無性繁殖還導致大蒜病毒的不斷積累，嚴重影響大蒜植株的生長及鱗莖的商品價值。當前，植物組織培養(yǎng)、人工誘變、基因工程以及大蒜多倍體育種等技術(shù)的應用，很大程度上提升了大蒜優(yōu)良品種的選育工作。其中植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種有效的脫毒快繁技術(shù)，已成大蒜育種研究熱點。

在大蒜的植物組織培養(yǎng)研究中，大蒜的不同外植體如，莖尖、根尖、幼嫩的葉子、貯藏葉、葉原基 、未成熟的花序軸、鱗莖以及氣生鱗莖等都已被應用于組織培養(yǎng)中用于誘導與再生。不定芽增殖途徑是直接誘導外植體內(nèi)潛伏的不定芽萌發(fā)，具有遺傳性狀穩(wěn)定，突變率低，再生時間較短等優(yōu)勢。目前，大蒜不定芽增殖方式多選用莖尖和莖盤（等為外植體，其繁殖系數(shù)平均在3到7 之間?；ㄐ蜉S是大蒜的生殖器官，處在生長頂端，病毒含量較低，其自然脫毒效果可以達到77.6%；花苞基部花盤有很高的誘導不定芽的潛力，王秀芝等以大蒜花序軸為外植體，誘導不定芽，每個花序軸不定芽總數(shù)可以達到19.2個?？梢姶笏饣ㄐ蜉S可以作為大蒜脫毒快繁的重要外植體。

然而，許多研究者雖然獲得了較多的不定芽，但脫毒種蒜高效培養(yǎng)成功的相關(guān)報道較為少見。因為高頻率試管苗的誘導僅僅是脫毒種蒜生產(chǎn)的限速條件之一，如何保證這些試管苗生根、移栽成活進而獲得脫毒種蒜是另一個重要條件。許多研究者采用離體培養(yǎng)技術(shù)從愈傷組織中獲得了大量再生植株，但在誘導生根和移栽環(huán)節(jié)上損失大量植株，降低了繁殖效率，并且耗時耗力，在應用方面受到限制。有研究者通過優(yōu)化大蒜再生植株的移植條件，提高其存活率，但植株馴化困難，效果不甚理想。熊正琴等將試管苗誘導形成試管鱗莖，其移栽成活率能明顯提高。此外，試管鱗莖便于儲存、方便運輸、具有更強抗逆性以及無需馴化的優(yōu)點，誘導成試管鱗莖的方式更加適用于大蒜組織培養(yǎng)。而且有研究表明，試管鱗莖與普通大蒜蒜瓣種植相似，經(jīng)過其休眠期，便可以直接種植并正常生長。

本發(fā)明以寶坻大蒜“六瓣紅”的花序軸作為外植體，通過優(yōu)化激素種類及濃度配比，獲得高效誘導不定芽培養(yǎng)基，結(jié)合誘導試管鱗莖、改進栽培途徑，構(gòu)建了從外植體到脫毒種蒜生產(chǎn)的完整方法，該體系為大蒜脫毒、快繁、保持優(yōu)良遺傳穩(wěn)定性、提高鱗莖產(chǎn)量及品質(zhì)等提供了重要的技術(shù)依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開了一種用大蒜花序軸進行脫毒快繁的方法，它是按如下的步驟進行:

（1）花序軸誘導不定芽：選擇寶坻大蒜“六瓣紅”，大蒜進入生殖生長期時，其花莖：假莖=1-1.2時，采摘大蒜的花序軸并于4℃中保存兩周。將經(jīng)低溫儲存兩周后的花序軸置于自來水下沖洗30 min，0.1% HgCl₂ 消毒20 min，蒸餾水沖洗3-4次，再用75%的酒精消毒10 min，蒸餾水沖洗3-4次。剝下外層苞葉及表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，并去除花莖部分，將花序軸接入不定芽誘導培養(yǎng)基中，每瓶接入2個花序軸。誘導不定芽的培養(yǎng)基為: MS+2.0 mg L^-1 KT+0.1 mg L^-1 NAA+ 30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=6.2。每個花序軸誘導的不定芽數(shù)可以達到11個；不定芽誘導試管鱗莖的誘導率均在90%以上，最高可達到98.78%，而每個花序軸誘導的試管鱗莖數(shù)最高可達到10.64個，其繁殖系數(shù)相對于鱗莖直接種植高了2倍多；

（2）不定芽誘導試管鱗莖：花序軸生長六周后，形成的不定芽高度達到3-5cm時，將其接入誘導培養(yǎng)基中誘導試管鱗莖，所述的誘導培養(yǎng)基指的是試管鱗莖誘導培養(yǎng)基：MS+120 g· L^-1綿白糖+6.8 g· L^-1瓊脂，pH=7.5，其詳細的方法是：當花序軸誘導的不定芽生長六周后，形成的不定芽高度達到3-5cm時，將其接入另試管鱗莖誘導培養(yǎng)基中誘導試管鱗莖；

（3）試管鱗莖的收獲與儲藏：不定芽在誘導試管鱗莖的培養(yǎng)基中誘導六周后，試管鱗莖成熟，將其取出并洗去培養(yǎng)基，在避光處晾干，晾干后，在4℃下保存3周后種植。

（4）再生植株和再生鱗莖的獲得：試管鱗莖度過休眠期后，于10月底種植，覆膜。第二年5月份，揭開薄膜，并進行除草，澆水以及松土工作。在6月下旬，組培大蒜成熟并收獲；

（5）組培大蒜病毒檢測和染色體檢測： 利用酶聯(lián)免疫技術(shù)和根尖細胞染色體制片技術(shù)分別檢測組培大蒜脫毒效果和染色體變異情況，組培大蒜達到部分脫毒效果，未觀察到染色體異常現(xiàn)象。

本發(fā)明所述的NAA是 a-萘乙酸（1-naphthlcetic acid），簡稱NAA ； KT是激動素（Kinetin）,簡稱KT；所述的MS基本培養(yǎng)基配方：

每1L基本培養(yǎng)基中含有：KNO₃ 1900mg,NH₄NO₃ 1650mg, MgSO₄?7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, CaCl₂?2H₂O 440 mg, MnSO₄?4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄?7H₂O 8.6 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, KI 0.83 mg, Na₂MO₃?2H₂O 0.25 mg, CuSO₄?5H₂O 0.025 mg, CoCl₂?6H₂O 0.025 mg, Na₂-EDTA 37.7 mg, FeSO₄?7H₂O 27.8 mg, 甘氨酸2.0 mg, 鹽酸硫胺素0.4 mg, 鹽酸吡哆素0.5 mg, 煙酸0.5 mg, 肌醇100 mg。

本發(fā)明進一步公開了用大蒜花序軸進行脫毒快繁方法在提高大蒜脫毒快繁效率方面的應用，實驗結(jié)果顯示：本發(fā)明的方法是有效的，能夠縮短大蒜制種時間，增大繁殖系數(shù)，由于不經(jīng)過脫分化和再分化過程，可以最大限度保證了優(yōu)良大蒜品種的遺傳穩(wěn)定性。

本發(fā)明以大蒜花序軸為外植體，構(gòu)建了從外植體選擇、花序軸不定芽誘導、不定芽誘導試管鱗莖、試管鱗莖打破休眠、大田栽培種植、脫毒效果檢測、遺傳穩(wěn)定性檢測、直到脫毒種蒜獲得的完整的方法。

下面本發(fā)明以典型的天津市寶坻大蒜快繁為代表，更加具體的說明實施方案：

1、花序軸誘導不定芽最佳培養(yǎng)基篩選：本發(fā)明所用的大蒜為寶坻大蒜“六瓣紅”，材料來自于天津師范大學生物科技園中。選擇于第一年10月底種植的寶坻大蒜“六瓣紅”，大蒜進入生殖生長期時，其花莖：假莖=1-1.2時，采摘大蒜的花序軸并于4℃中保存兩周。將經(jīng)低溫儲存兩周后的花序軸置于自來水下沖洗30 min，0.1% HgCl₂ 消毒20 min，蒸餾水沖洗3-4次，再用75%的酒精消毒10 min，蒸餾水沖洗3-4次。剝下外層苞葉及表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，并去除花莖部分，將花序軸接入篩選培養(yǎng)基中，每瓶接入2個花序軸。篩選培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類（KT，6-BA以及NAA）及濃度的激素，附加蔗糖30g·L^-1，瓊脂7.5g·L^-1，pH=6.2，121 ℃ (1.03×10⁵ Pa)滅菌20 min后使用。以下為花序軸誘導不定芽的篩選培養(yǎng)基：

表1 培養(yǎng)基激素配比

2、不定芽誘導試管鱗莖：花序軸生長六周后，形成的不定芽高度達到3-5cm時，將其接入另一種固體培養(yǎng)基中（MS+120 g· L^-1綿白糖+6.8 g· L^-1瓊脂，pH=7.5）誘導試管鱗莖，觀察并記錄試管鱗莖生長狀況。

3、試管鱗莖的收獲與儲藏：不定芽在誘導試管鱗莖的培養(yǎng)基中誘導六周后，試管鱗莖成熟，將其取出并洗去培養(yǎng)基，在避光處晾干，晾干后，在4℃下保存3周后種植。

4、再生植株和鱗莖的形態(tài)學觀察：試管鱗莖度過休眠期后，于10月底種植，并覆膜。第二年5月份，揭開薄膜，并進行除草，澆水以及松土工作。在6月下旬，大蒜成熟并收獲。測量鱗莖直徑，將大蒜鱗莖按照大中小的標準分為三組，每一組測量十個數(shù)據(jù)，將得到的三十個數(shù)據(jù)進行平均，得到試管鱗莖的平均直徑大小。

5、病毒檢測：酶聯(lián)免疫試劑OYDV、LYSV和GMV的DAS-ELISA檢測試劑盒購自美國Agdia公司。所用檢測抗體、酶標抗體、對硝基苯磷酸二鈉（PNP）底物、陽性對照、GEB樣品提取緩沖液、聚乙烯微孔板均購自Agdia公司，酶結(jié)合物為堿性磷酸酶（AP）標記的OYDV、LYSV、GMV3種病毒抗體，陰性對照為GEB提取緩沖液，具體檢測方法參照Agdia公司說明書。用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測大蒜的脫毒效果，方法參照試劑盒說明書，每個樣品重復三次。

6、再生植株染色體檢測：選取大蒜花序軸試管鱗莖再生植株根尖，用固定液固定24h后，用蒸餾水沖洗3-4次，放入70%的乙醇中進行保存。選取保存的根尖，用蒸餾水沖洗3-5次，加入1M HCl在60℃水浴中水解8 min，蒸餾水沖洗3-5次，將根尖分生組織區(qū)置于載玻片中央，滴加2-3滴卡寶品紅溶液，染色8min，用濾紙吸去多余染液，在顯微鏡下觀察根尖分生組織區(qū)染色體形態(tài)。

本發(fā)明公開的用大蒜花序軸進行脫毒快繁的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于：

（1）該方法的核心是通過高頻誘導試管鱗莖、試管鱗莖低溫春化、設(shè)施栽培進而在實現(xiàn)脫毒種蒜生產(chǎn)。傳統(tǒng)利用莖尖脫毒快繁，需要經(jīng)過脫分化、再分化、誘導試管苗、試管苗生根、煉苗移栽等繁瑣過程，歷時兩年才能獲得脫毒種蒜。本實驗室構(gòu)建的方法，大大提高了大蒜脫毒快繁效率，節(jié)省培育時間，降低生產(chǎn)成本。

（2）大蒜花序軸處于大蒜植株生長頂端，其本身帶毒量少，且通過花序軸直接誘導不定芽，沒有經(jīng)過脫分化和再分化過程，植株遺傳穩(wěn)定性得到保障。

（3）4℃下處理兩周，打破花序軸休眠期，更加有利于不定芽誘導。

（4）本發(fā)明優(yōu)化了各個環(huán)節(jié)，構(gòu)建了從外植體到脫毒種蒜以及組培蒜脫毒效果和遺傳穩(wěn)定性檢測的完整的方法，該方法在國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。

附圖說明

圖1為大蒜花序軸不定芽誘導，其中a.花序軸剛接入培養(yǎng)基，b-f.花序軸生長約1周、2周、3周、4周和6周時的生長狀況；

圖2為大蒜花絮軸不定芽誘導試管鱗莖，其中a.不定芽接入誘導試管鱗莖培養(yǎng)基中，b-f. 不定芽誘導試管鱗莖1周、2周、3周、4周和6周的生長狀況；

圖3為形成的不定芽總數(shù)與形成的試管鱗莖數(shù)總數(shù)相關(guān)性分析；

圖4為試管鱗莖的外觀、大小與解剖圖，其中a-b.從培養(yǎng)瓶中收獲的成簇的試管鱗莖 c.收獲的所有試管鱗莖，d.比較寶坻蒜瓣與試管鱗莖大小 e-f. 在解剖鏡下觀察試管鱗莖的生長點（箭頭所指）（圖中比例尺為1.9cm）；

圖5為大蒜試管鱗莖所得再生植株與鱗莖的形態(tài)，其中a.再生植株在地里的生長情況，b.收獲鱗莖時再生植株的形態(tài)，c.獨頭鱗莖 d.分瓣鱗莖e.二次生長鱗莖（圖中比例尺為1.9cm）；

圖6為大蒜花絮軸試管鱗莖再生植株根尖分生組織區(qū)的染色體檢測。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定。其中本發(fā)明所用到的NAA，KT， 蔗糖，10%安替福民、瓊脂均有市售。

實施例1

（1）花序軸誘導不定芽：選擇寶坻大蒜“六瓣紅”，大蒜進入生殖生長期時，其花莖：假莖=1-1.2時，采摘大蒜的花序軸并于4℃中保存兩周。將經(jīng)低溫儲存兩周后的花序軸置于自來水下沖洗30 min，0.1% HgCl₂ 消毒20 min，蒸餾水沖洗3次，再用75%的酒精消毒10 min，蒸餾水沖洗3次。剝下外層苞葉及表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，并去除花莖部分，將花序軸接入不定芽誘導培養(yǎng)基中，每瓶接入2個花序軸。誘導不定芽的培養(yǎng)基為: MS+2.0 mg L^-1 KT+0.1 mg L^-1 NAA+ 30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=6.2。每個花序軸誘導的不定芽數(shù)可以達到11個；不定芽誘導試管鱗莖的誘導率均在90%以上，最高可達到98.78%，而每個花序軸誘導的試管鱗莖數(shù)最高可達到10.64個，其繁殖系數(shù)相對于鱗莖直接種植高了2倍多；

（2）不定芽誘導試管鱗莖：花序軸生長六周后，形成的不定芽高度達到3-5cm時，將其接入誘導培養(yǎng)基中誘導試管鱗莖，所述的誘導培養(yǎng)基指的是試管鱗莖誘導培養(yǎng)基：MS+120 g· L^-1綿白糖+6.8 g· L^-1瓊脂，pH=7.5，其詳細的方法是：當花序軸誘導的不定芽生長六周后，形成的不定芽高度達到3-5cm時，將其接入另試管鱗莖誘導培養(yǎng)基中誘導試管鱗莖。

（3）試管鱗莖的收獲與儲藏：不定芽在誘導試管鱗莖的培養(yǎng)基中誘導六周后，試管鱗莖成熟，將其取出并洗去培養(yǎng)基，在避光處晾干，晾干后，在4℃下保存3周后種植。

（4）再生植株和再生鱗莖的獲得：試管鱗莖度過休眠期后，于10月底種植，覆膜。第二年5月份，揭開薄膜，并進行除草，澆水以及松土工作。在6月下旬，組培大蒜成熟并收獲；

（5）組培大蒜病毒檢測和染色體檢測： 利用酶聯(lián)免疫技術(shù)和根尖細胞染色體制片技術(shù)分別檢測組培大蒜脫毒效果和染色體變異情況，組培大蒜達到部分脫毒效果，未觀察到染色體異?，F(xiàn)象。

本發(fā)明所述的NAA是 a-萘乙酸（1-naphthlcetic acid），簡稱NAA ； KT是激動素（Kinetin）,簡稱KT；所述的MS基本培養(yǎng)基配方：

每1L基本培養(yǎng)基中含有：KNO₃ 1900mg,NH₄NO₃ 1650mg, MgSO₄?7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, CaCl₂?2H₂O 440 mg, MnSO₄?4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄?7H₂O 8.6 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, KI 0.83 mg, Na₂MO₃?2H₂O 0.25 mg, CuSO₄?5H₂O 0.025 mg, CoCl₂?6H₂O 0.025 mg, Na₂-EDTA 37.7 mg, FeSO₄?7H₂O 27.8 mg, 甘氨酸2.0 mg, 鹽酸硫胺素0.4 mg, 鹽酸吡哆素0.5 mg, 煙酸0.5 mg, 肌醇100 mg。

實施例2

1、大蒜花序軸誘導不定芽誘導

由于不同激素種類（KT、6-BA及NAA）及濃度對不定芽再生效率有一定的影響，我們設(shè)計了12種篩選培養(yǎng)基，將低溫保存兩周后的大蒜花絮軸接入上述篩選培養(yǎng)基中，統(tǒng)計不定芽誘導率，確定最佳誘導培養(yǎng)條件，其結(jié)果如下表所示：

表2 不同激素配比對寶坻大蒜花序軸不定芽增殖的影響

從表2中可以看出，在培養(yǎng)基1到6中，培養(yǎng)基2的誘導率較高，每個花序軸誘導的不定芽數(shù)達到6.12個。在6- BA濃度相同時，不添加NAA的培養(yǎng)基誘導率較高，說明誘導不定芽時6-BA比NAA的影響大。培養(yǎng)基7到12中，11的誘導率較高，每個花序軸誘導的不定芽數(shù)達到11.00個，在KT濃度相同時，添加NAA的培養(yǎng)基誘導率較高，表明KT與NAA共同作用花序軸不定芽的誘導。而從表中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基7到12均比培養(yǎng)基1到6的誘導率高，說明KT比6-BA更適合大蒜花絮軸不定芽的誘導，因此，大蒜花絮軸誘導不定芽的最優(yōu)培養(yǎng)基為：培養(yǎng)基11，即MS+2.0 mg L^-1 KT+0.1 mg L^-1 NAA+ 30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=6.2，其誘導率達到11個。

圖1是在最佳誘導培養(yǎng)基上誘導不定芽各環(huán)節(jié)：剛接入培養(yǎng)基時未見明顯膨大（圖1-a）。經(jīng)過一個星期左右，其表面出現(xiàn)凸起，花序軸明顯膨大，切塊表面增厚，形成半透明的叢生芽，大多數(shù)生長于中部和下部，并且密集生長（圖1-b）。不定芽持續(xù)生長，大約兩周后，半透明的不定芽變成嫩綠色，達到2厘米的長度（圖1-c）。4周后，形成密集的不定芽叢（圖1-e）。大約6周后，不定芽可以移植到誘導試管鱗莖培養(yǎng)基中（圖1-f）。

2、大蒜花序軸不定芽誘導試管鱗莖

由于眾多的不定芽叢生于同一個花絮軸基部，難以保證每一顆苗能夠誘導出實生根進行移栽，本研究通過誘導試管鱗莖途徑以提高繁殖效率。誘導試管鱗莖的培養(yǎng)基為：MS+ 120.0 g· L^-1 綿白糖+6.8 g ·L^-1 瓊脂，pH=7.5 。從圖2中可以看到，誘導大約1周后，不定芽根部開始膨大（圖2-b）；2周后，試管苗出現(xiàn)枯萎（圖2-c）；3周時，鱗莖外表皮逐漸變?yōu)樽仙▓D2-d）；4周時，誘導形成的試管鱗莖大部分外表皮變?yōu)樽仙嚬苊缈菸F(xiàn)象嚴重（圖2-e）；6周后，試管苗枯萎，試管鱗莖基本成熟（圖2-f）。此時，將試管鱗莖從培養(yǎng)瓶中取出，洗去表面培養(yǎng)基，于陰涼處晾干。

從表3中可以看到，不定芽誘導試管鱗莖的誘導率均在90%以上，最高可達到98.78%，而每個花序軸誘導的試管鱗莖數(shù)最高可達到10.64個，其繁殖系數(shù)相對于鱗莖直接種植（繁殖系數(shù)為5）高了2倍多。從圖3中可以看出，大蒜花序軸形成的不定芽總數(shù)與形成試管鱗莖總數(shù)呈顯著正相關(guān)（p<0.05）。因此，在需要獲得高誘導率的試管鱗莖時，誘導不定芽則需要在誘導率較高的培養(yǎng)基上生長。

表3大蒜花絮軸不定芽誘導試管鱗莖

注：小寫字母在0.05水平上差異顯著，大寫字母在0.01水平上差異顯著。

3 試管鱗莖的收獲與貯藏

大蒜花序軸誘導形成試管鱗莖總計1260個。較大的試管鱗莖的直徑為6.65mm，中等大小的直徑為4.23mm，而相對較小的直徑為1.68mm。從培養(yǎng)瓶中收獲的試管鱗莖成簇狀排列，每簇最多可達到25個（見圖4-a-b）。晾干后的試管鱗莖外表皮呈紫色（見圖4-c），與寶坻大蒜鱗莖外表皮一致。在解剖鏡下觀察，試管鱗莖都具有生長點（見圖4-e-f），因此，在渡過休眠期后，移栽至地里，試管鱗莖均可以正常生長。

4 大蒜試管鱗莖所得再生植株與鱗莖的形態(tài)學統(tǒng)計分析

大蒜試管鱗莖的再生植株數(shù)量為539株，收獲的鱗莖中，獨頭蒜有530株，分成兩瓣的有8株，四瓣的1株。鱗莖的最大直徑為22.14mm，最小直徑為3.16mm，二次生長的1株。

5病毒檢測

對通過試管鱗莖種植大田所得再生植株葉片分別用OYDV、LYSV和GMV試劑盒進行DAS-ELISA檢測，用酶標儀讀取405nm吸光度值，并與陰性對照、陽性對照吸光度值進行比較。結(jié)果表明，未脫毒寶坻大蒜病毒感染比較嚴重，且為復合型感染（見表4）。

從表4中可以看出，在未脫毒寶坻大蒜中均檢測出感染上述三種病毒，但病毒對植株侵染程度不同，這是一種復合侵染的方式。未脫毒大蒜樣品OYDV、LYSV和GMV檢測結(jié)果分別為陰性對照的3.10、6.11和3.11倍，感染情況相當嚴重。這種可能是導致大蒜品質(zhì)下降，繁殖系數(shù)降低的原因之一。經(jīng)過花序軸脫毒快繁途徑后再生植株樣品OYDV、LYSV和GMV檢測結(jié)果分別為陰性對照的2.9、4.3和1.2倍，達到一定脫毒效果。

表4再生植株葉片ELISA病毒檢測結(jié)果

6細胞學觀察

大蒜是真核細胞生物，染色體的正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)保證了基因遺傳的穩(wěn)定性，觀察大蒜花序軸試管鱗莖再生植株根尖分生組織區(qū)的染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)，細胞中有16條染色體，并且形態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)染色體異?，F(xiàn)象，因此保證了大蒜種質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性。

本發(fā)明構(gòu)建的大蒜脫毒快繁方法與常規(guī)方法的對比試驗結(jié)果如下：

對比試驗：

結(jié)論：與常規(guī)方法相比，本發(fā)明以大蒜花序軸為外植體，構(gòu)建了從外植體選擇、花序軸不定芽誘導、不定芽誘導試管鱗莖、試管鱗莖打破休眠、大田栽培種植、脫毒效果檢測、遺傳穩(wěn)定性檢測、直到脫毒種蒜獲得的完整的方法，省去試管苗生根和移栽，解決了試管苗成活率低的問題。該體系為大蒜脫毒、快繁、保持優(yōu)良遺傳穩(wěn)定性、提高鱗莖產(chǎn)量及品質(zhì)等提供了重要的技術(shù)依據(jù)。