本發(fā)明涉及農業(yè)
技術領域：
，具體涉及一種鷓鴣茶愈傷組織的培養(yǎng)方法以其培養(yǎng)基。
背景技術：
：鷓鴣茶[Mallotuspeltatus(Geiseler)MullerArgoviensis]也叫山苦茶、毛茶和禾姑茶，系大戟科野桐屬植物。鷓鴣茶在海南島主要分布在文昌、萬寧和陵水，也在三亞、樂東、白沙、定安、東方、瓊中、保亭和昌江等地有分布，其中以文昌銅鼓嶺和萬寧東山嶺的出產的鷓鴣茶最為有名。此外，在我國廣東、云南、廣西，以及中印半島和蘇門答臘島也有野生分布。鷓鴣茶葉圓味甘，是一種奇特的野生茶葉，其葉片等植物體干燥后具有濃郁的零陵香氣；沖泡飲用時別具風味、甘冽爽口，被歷代文人墨客譽為"靈芝草"。鷓鴣茶是海南具有濃郁地方和民族特色的代茶飲料植物，已成為海南地方茶的一大文化特色。鷓鴣茶具有顯著的保健作用和藥用功效，是海南重要的民間中藥材，利用歷史悠久。鷓鴣茶的提取物中富含茶多糖、茶多酚、沒食子酸和多酚類等多種有效成分。現代藥理學研究表明，鷓鴣茶中的有效成分具有清除氧自由基、抗動脈粥樣硬化、促進膽汁分泌、抑制病菌活性、抗疲勞衰老與鎮(zhèn)靜止痛等功效。另外，作為重要的中藥材，海南民間用鷓鴣茶的根治療牙痛有良好的效果。目前，鷓鴣茶資源的開發(fā)利用尚停留在利用野生資源的水平上，產業(yè)發(fā)展所需的鷓鴣茶人工規(guī)模種植和配套栽培技術尚處于空白。亦今為止，海南島內外或國內外尚沒有建立鷓鴣茶產品商業(yè)化生產的大規(guī)模種植基地，幾乎所有市場上流通的鷓鴣茶產品均是直接從野生植物上獲取。除了個別農戶有零星的庭院式種植外，制作鷓鴣茶產品所需的原材料幾乎全部依賴掠奪式地從野生植株上獲取葉片。受到經濟利益的驅使，目前鷓鴣茶野生資源已經逐年減少。由于鷓鴣茶的市場需求量較大，且隨著“海南國際旅游島”的發(fā)展，鷓鴣茶原葉的需求量也將會急劇增加。鷓鴣茶是雌雄異株植物，在自然居群中以雄株多而雌株少為普遍現象。自然授粉條件下，鷓鴣茶的平均結實率(成熟種子/雌花數)不足5％，因此，行業(yè)內將目光轉向組織培養(yǎng)，但是鷓鴣茶的組織培養(yǎng)一直是行業(yè)內的瓶頸，因為外植體培養(yǎng)極易發(fā)生褐變，而無法取得愈傷材料。技術實現要素：本發(fā)明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種用于培養(yǎng)鷓鴣茶愈傷組織的培養(yǎng)基以及采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)鷓鴣茶愈傷組織的方法，愈傷率高，填補了鷓鴣茶組織培養(yǎng)的空白。本發(fā)明的第一個方面是提供一種用于培養(yǎng)鷓鴣茶愈傷組織的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有兩種激素組分，第一激素組分為萘乙酸，其含量以所述培養(yǎng)基為基準為0.1-0.5mg/L，第二激素組分為激動素、2,4-D或6-芐氨基腺嘌呤，其以所述培養(yǎng)基為基準含量為0.5-1.5mg/L。優(yōu)選地，第一激素組分為萘乙酸，其含量為0.3-0.5mg/L。進一步優(yōu)選地，第一激素組分為萘乙酸，其含量為0.3mg/L。優(yōu)選地，第二激素組分含量為1-1.5mg/L。進一步優(yōu)選地，第二激素組分為2,4-D，其含量為1mg/L；或者第二激素組分為激動素，其含量為1.5mg/L；或者第二激素組分為6-芐氨基腺嘌呤，其含量為1.5mg/L。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加所述兩種激素。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基還添加蔗糖。蔗糖作為培養(yǎng)基內的碳源和能源外，并維持培養(yǎng)基的滲透壓也起重要作用。本領域技術人員可根據經驗酌量添加，本發(fā)明對蔗糖在培養(yǎng)基中的含量不作特別限定。一般地，蔗糖在培養(yǎng)基中的含量為20-40g/L，在本發(fā)明的一個實施方式中，其含量為30g/L。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基還添加瓊脂。瓊脂作為凝固劑來將液體培養(yǎng)基轉化為固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基。本領域技術人員可根據經驗酌量添加使液體培養(yǎng)基轉化為固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基即可，本發(fā)明對瓊脂在培養(yǎng)基中的含量不作特別限定。一般地，瓊脂在培養(yǎng)基中的含量為5-10g/L，在本發(fā)明的一個實施方式中，其含量為7.5g/L的蔗糖。其中，所述培養(yǎng)基的pH值5.8-6.2。本發(fā)明的第二個方面是提供一種鷓鴣茶愈傷組織的培養(yǎng)方法，取健壯鷓鴣茶無菌苗剛出芽的胚軸，切成小段，接種于本發(fā)明第一個方面所述的任意一種培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)。本申請發(fā)明人為解決現有技術中的不足，反復摸索，成功獲得可高效培養(yǎng)鷓鴣茶愈傷組織的培養(yǎng)基，采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)鷓鴣茶愈傷組織，愈傷率高，填補了鷓鴣茶組織培養(yǎng)的空白。附圖說明圖1為本發(fā)明培養(yǎng)基對胚軸愈傷組織的誘導結果，其中，A為實施例5的培養(yǎng)基對胚軸愈傷組織的誘導結果,B為實施例15的培養(yǎng)基對胚軸愈傷組織的誘導結果，C為實施例24的培養(yǎng)基對胚軸愈傷組織的誘導結果。圖2為實施例24的培養(yǎng)基對胚軸愈傷組織的誘導生長過程，A為培養(yǎng)15天的愈傷生長狀態(tài)，B為培養(yǎng)30天的愈傷生長狀態(tài)，C為培養(yǎng)45天的愈傷生長狀態(tài)，D為培養(yǎng)60天的愈傷生長狀態(tài)。具體實施方式下面參照附圖，結合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明，以更好地理解本發(fā)明。實施例1-9(培養(yǎng)基)實施例1-9均采用MS為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8-6.2，其中加入30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂，并加入激素NAA(萘乙酸)和2,4-D，每個實施例中NAA和2,4-D添加量如表1所示。實施例10-18(培養(yǎng)基)實施例10-18均采用MS為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8-6.2，其中加入30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂，并加入激素NAA(萘乙酸)和KT(激動素)，每個實施例中NAA和KT添加量如表2所示。實施例19-27(培養(yǎng)基)實施例19-27均采用MS為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8-6.2，其中加入30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂，并加入激素NAA(萘乙酸)和6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)，每個實施例中NAA和6-BA添加量如表3所示。試驗方法1、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件本次試驗采用實施例1-27的培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照時間12h/d，光照強度30-40μmol/m·s。2、無菌苗獲得將鷓鴣茶的成熟種子用流水沖洗3h，70％酒精消毒5min，去除種皮至于無菌水中，在超凈工作臺中用40％過氧化氫進行消毒處理10min，無菌水沖洗3次，將無菌材料接于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40d后即可獲得鷓鴣茶無菌苗。3、胚軸愈傷組織的誘導選取長勢良好一致的鷓鴣茶無菌苗，取其剛出芽的胚軸，將胚軸切成1cm長的小段，接種于實施例1-27的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，試驗采用完全隨機設計，每個處理接種60個胚軸，重復3次。30d后統(tǒng)計愈傷組織平均誘導率和愈傷組織長勢。4、數據處理采用Excel軟件統(tǒng)計數據，使用SPSS18.0軟件進行數據處理和統(tǒng)計分析。5、結果與分析5.1不同NAA和2,4-D濃度對胚軸愈傷組織誘導的影響在不同NAA和2,4-D濃度對胚軸愈傷組織誘導影響的實驗中，通過添加不同濃度的NAA和2,4-D能夠有效的誘導出愈傷組織。通過試驗結果(表1)表明，實施例1-9均能夠有效的進行愈傷組織誘導，其中出愈傷總數在22-57個之間，平均出愈傷率在0.37-0.95之間。綜合考慮胚軸愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為實施例5(MS+0.3mg/LNAA+1mg/L2,4-D)(圖1A)，出愈傷總數可以達到57個，平均出愈傷率可以達到0.95。表1不同NAA和24-D濃度對胚軸愈傷組織誘導的影響NAA(mg/L)2,4-D(mg/L)接種總數(個)出愈傷總數(個)平均出愈傷率實施例10.10.560240.4實施例20.1160310.52實施例30.11.560220.37實施例40.30.560450.75實施例50.3160570.95實施例60.31.560470.78實施例70.50.560450.75實施例80.5160350.58實施例90.51.560230.385.2不同NAA和KT濃度對胚軸愈傷組織誘導的影響在不同NAA和KT濃度對胚軸愈傷組織誘導影響的實驗中，通過添加不同濃度的NAA和KT能夠有效的誘導出愈傷組織。通過試驗結果(表2)表明，實施例10-18均能夠有效的進行愈傷組織誘導，同時各組試驗具有顯著影響，其中出愈傷總數在21-59個之間，平均出愈傷率在0.35-0.98之間。綜合考慮胚軸愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為實施例15(MS+0.3mg、LNAA+1.5mg/LKT)(圖1B)，出愈傷總數可以達到59個，平均出愈傷率可以達到0.98。表2不同NAA和KT濃度對胚軸愈傷組織誘導的影響NAA(mg/L)KT(mg/L)接種總數(個)出愈傷總數(個)平均出愈傷率實施例100.10.560210.35實施例110.1160350.58實施例120.11.560260.43實施例130.30.560430.72實施例140.3160540.9實施例150.31.560590.98實施例160.50.560410.68實施例170.5160380.63實施例180.51.560340.572.3不同NAA和6-BA濃度對胚軸愈傷組織誘導的影響在不同NAA和6-BA濃度對胚軸愈傷組織誘導影響的實驗中，通過添加不同濃度的NAA和6-BA能夠有效的誘導出愈傷組織。通過試驗結果(表3)表明，實施例19-27均能夠有效的進行愈傷組織誘導，同時各組試驗具有顯著影響，其中出愈傷總數在34-59個之間，平均出愈傷率在0.57-0.98之間。綜合考慮胚軸愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為實施例24(MS+0.3mg/LNAA+1.5mg/L6-BA)(圖1C和圖2)，出愈傷總數可以達到59個，平均出愈傷率可以達到0.98。表3不同NAA和6-BA濃度對胚軸愈傷組織誘導的影響以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。當前第1頁1 2 3