專利名稱：一種制備大豆復(fù)合型外植體的方法及用該外植體制備快速轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備大豆復(fù)合型外植體的方法及用該外植體制備快速轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法。
背景技術(shù)：
大豆是高蛋白和高脂肪含量的作物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值都很高。大豆在農(nóng)作物中是糧食兼油料作物，又是家畜和輕工業(yè)的重要原料作物，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)占有重要的地位。 然而，普通栽培大豆由于遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，育種周期相對(duì)較長(zhǎng)，僅靠常規(guī)育種手段難以滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)大豆日益增長(zhǎng)的需求。隨著基因工程的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)有目的地將外源基因轉(zhuǎn)入大豆，進(jìn)而獲得綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因大豆品種，不但可以豐富栽培大豆的基因資源，拓寬栽培大豆相對(duì)狹窄的遺傳背景，而且還可使大豆在產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀上得到明顯改善。大豆是全球公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化作物之一。1988年Hinchee等首次用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以子葉為外植體，經(jīng)不定芽獲得大豆轉(zhuǎn)基因植株，但是轉(zhuǎn)化效率極其低下。后來發(fā)展了以大豆胚尖、下胚軸為外植體，但仍然傳轉(zhuǎn)效率不高，且操作繁瑣、工作量大、周期長(zhǎng)、成本高。因此， 尋求高高轉(zhuǎn)化效率的大豆外植體作為外源基因的轉(zhuǎn)化受體顯得尤其重要。本發(fā)明在前人研究的基礎(chǔ)上經(jīng)過多次的嘗試創(chuàng)新了傳統(tǒng)的大豆外植體，獲得了具有高轉(zhuǎn)化效率的大豆復(fù)合型外植體，為轉(zhuǎn)基因大豆的發(fā)展提供了很好的轉(zhuǎn)化平臺(tái)。中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)201010554668. 2 (
公開日2011年2月16日)公開了一種農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)的方法，其中外植體制備方法是將大豆種子經(jīng)乙醇和升汞消毒后浸泡在無菌水中，培養(yǎng)萌發(fā)得無菌苗，然后取子葉還未完全展開的無菌苗，剝?nèi)シN皮，切去根和大部分下胚軸，保留;T5mm的下胚軸，沿種子中線切開，分離兩片子葉，切除頂芽及初生芽，即得含子葉節(jié)的外植體。中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)03816844. 8 (
公開日2005年9月14日)公開了一種轉(zhuǎn)化大豆的方法，其中制備外植體的方法是將用氯氣釋放處理消毒兩次，每次壙18小時(shí)，培養(yǎng)種子過夜，然后去除種皮，去除部分下胚軸，保留大約0. 5cm的下胚軸，去除一個(gè)子葉及其鄰近的腋芽，保留附于剩下子葉上的初生葉，再將保留的初生葉除去一部分，保留初生葉基部， 得到外植體。上述第1種方法由于子葉節(jié)是經(jīng)過器官發(fā)生再生植株，因此轉(zhuǎn)化體容易形成嵌合體，后代篩選難度大，獲得轉(zhuǎn)化植物效率低下；上述第2種方法中由于去掉了大部分下胚軸營(yíng)養(yǎng)供給受到影響，因此外植體的再生效果差及轉(zhuǎn)化率較低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中用于作為轉(zhuǎn)基因大豆植株的外植體轉(zhuǎn)化效率低、操作繁瑣等問題，提供一種新的制備大豆復(fù)合型外植體的方法。
本發(fā)明的另一目的是利用上述大豆復(fù)合型外植體制備快速轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種制備大豆復(fù)合型外植體的方法，是將成熟大豆種子消毒(優(yōu)選在含有氯氣的密閉容器內(nèi)熏蒸消毒4飛h)，無菌條件下在萌發(fā)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)催芽，催芽24h后，從種子眼處去掉種皮，去掉胚尖兩側(cè)的第一片真葉，去掉一片子葉，保留包括胚根的完整下胚軸、胚尖及另一片子葉，即為所述大豆復(fù)合型外植體； 具體操作過程可以如下
將無創(chuàng)傷飽滿的成熟大豆種子消毒后在無菌條件下置于萌發(fā)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)催芽， 培養(yǎng)溫度優(yōu)選25 28°C，催芽24h后從種子眼處去掉種皮，用鋒利的解剖刀輕輕撥掉1片子葉，留下一片子葉，接著小心去掉胚尖兩側(cè)的第一片真葉，留下剛剛萌動(dòng)的胚尖，保留完整的下胚軸(包括胚根)，所得到的具有完整的下胚軸、胚尖及一片子葉，即為所述大豆復(fù)合型外植體，簡(jiǎn)稱CEP外植體(見圖1)。本發(fā)明制備的復(fù)合型外植體能夠克服現(xiàn)有外植體操作繁瑣、轉(zhuǎn)化體篩選困難、再生率和轉(zhuǎn)化率低的缺點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)便、再生率及轉(zhuǎn)化率高、轉(zhuǎn)化體篩選簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。所述萌發(fā)培養(yǎng)基成分為30g/L蔗糖和質(zhì)量百分濃度為0. 8 %的瓊脂，PH 5. 8。上述制備大豆復(fù)合型外植體的方法中大豆種子可以選用任何品種，如華春3號(hào)、 華春6號(hào)或馬祖1號(hào)等。一種制備快速轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法，步驟如下
(1)制備大豆CEP外植體按上述方法制備大豆外植體，將該外植體胚尖朝上垂直播種預(yù)培養(yǎng)基中，預(yù)培養(yǎng)對(duì) 2他；
(2)攜帶目的基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化外植體將攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌在YEB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心，收集沉淀，用共培養(yǎng)基稀釋成OD6tltl=L 5的菌液，將步驟(1)中預(yù)培養(yǎng)后的大豆復(fù)合型外植體轉(zhuǎn)移到菌液中，28°C黑暗環(huán)境侵染19 2池；
(3)大豆復(fù)合型外植體芽誘導(dǎo)取出侵染后的大豆復(fù)合型外植體，置于鋪有無菌濾紙的固體共培養(yǎng)基上，28°C黑暗培養(yǎng)3 7天，再取出，滅菌水洗去附著在其表面的農(nóng)桿菌，無菌濾紙吸干表面附著的液體，轉(zhuǎn)到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)2 3周(進(jìn)行篩選并誘導(dǎo)出芽)，每周轉(zhuǎn)接一次(即每周更換一次培養(yǎng)基)，培養(yǎng)至外植體長(zhǎng)出不定芽；
(5)生根培養(yǎng)及煉苗將芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的外植體不定芽轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)，根健壯時(shí)敞開瓶口煉苗2 3天，移入培養(yǎng)土中，待幼苗長(zhǎng)出兩片新葉后，再移栽到溫室中； 上述步驟中使用的培養(yǎng)基成分如下
所述預(yù)培養(yǎng)基成分MSB5，1.0 mg/L 6-BA (6-芐氨基嘌呤)，30g/L蔗糖，質(zhì)量百分濃度為0. 8 %的瓊脂，pH 5. 8 ；
所述YEB液體培養(yǎng)基成分10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl, pH 5. 8 ； 所述共培養(yǎng)基成分1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L 6_BA (6-芐氨基嘌呤)，0. 5 g/ L MES (2-嗎啉乙磺酸)，200 μ mol/L乙酰丁香酮，pH5. 8 ；
所述固體共培養(yǎng)基成分1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L ΒΑ,Ο. 5 g/L MES, 200 μ mol/L 乙酰丁香酮，0. 4% 瓊脂，pH 5. 8 ；
所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分1/2MSB5，0. 2 mg/L 6-BA, 0.2 mg/L IBA (吲哚丁酸)，300 mg/L頭孢霉素，1.25mg/L PPT (草銨膦，4-[羥基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸)，0. 8%瓊脂， ρΗ5· 6 ；
所述生根培養(yǎng)基l/2MSB5，20g/L 蔗糖，1.0mg/L IBA, 250mg/L 頭孢霉素，0. 25mg/L PPT，0· 7% 瓊脂，ρΗ5· 6。上述MSB5指MS大量元素、微量元素，Β5維生素和Β5鐵鹽。主要成分為大量元素 KNO3 1. 9 g/L, NH4NO3 16. 5 g/L, CaCl2 · 2H20 0. 44 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 37 g/L, KH2PO4 ·2Η20 0. 17 g/L;微量元素KI 0. 83mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, MnSO4 ·4Η20 22. 3 mg/ L, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025 mg/L, CoCl2 · 6H20 0.025 mg/L ;B5維生素?zé)熕酼B5O. 1 8/1，肌醇10.0 g/L，鹽酸硫胺素VB1 1.0 g/L，鹽酸吡哆醇(VB6) 0. 1 g/L ；B5 鐵鹽=FeSO4 · 7H20 5. 56g/L, NaEDTA · 7H20 7. 46 g/L。上述制備快速轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法可以用于制備一般的外源基因轉(zhuǎn)化品種，如外源基因?yàn)榭估鋬龅鞍谆騛//7，將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌(優(yōu)選EHA105菌株)，還可以同時(shí)導(dǎo)入抗除草劑基因bar作為篩選標(biāo)記，使后續(xù)的篩選工作簡(jiǎn)便快速。當(dāng)外源目的基因?yàn)榭估鋬龅鞍谆騛//7，農(nóng)桿菌菌株為EHA105菌株，且該農(nóng)桿菌還包括抗除草劑基因bar作為篩選標(biāo)記時(shí)，上述制備方法步驟(2)中攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌菌株由以下方法制備
(1)構(gòu)建外源基因表達(dá)載體將含有抗冷凍蛋白基因的pTHP5質(zhì)粒和含有如r除草劑抗性基因的PCAMBIA3301質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收含有基因的片段和含有bar除草劑抗性基因的目的片段，用DNA連接酶把兩片段連接，構(gòu)建表達(dá)載體PCAAFP66，該表達(dá)載體含有35S啟動(dòng)子、afp抗冷凍蛋白基因和如r除草劑抗性篩選標(biāo)記基因，用熱激法把載體 PCAAFP66轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌EHA105菌株中，置_80°C保存?zhèn)溆?，見文獻(xiàn)報(bào)道(趙印華，陳穎珊，郭麗瓊，覃鳳云，林俊芳.pCAAFP66表達(dá)載體的構(gòu)建及其大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究.大豆科學(xué)， 2011，30 (4) :541-545)；
(2)篩選取保存的菌株，在加入篩選抗生素的YEP固體培養(yǎng)基上劃平板，培養(yǎng)48h，挑取單菌落接種到含有相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C、220 r/min培養(yǎng)M h，即得攜帶目的基因的農(nóng)桿菌菌株；
所述抗生素為壯觀霉素(濃度優(yōu)選為100 yg / mL)、鏈霉素(濃度優(yōu)選為50 μ g / mL) 和卡那霉素(濃度優(yōu)選為50 μ g / mL)中的一種或幾種；
所述YEP固體培養(yǎng)基成分為10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，質(zhì)量百分濃度為6%的瓊脂，pH 5. 8。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(1)明顯縮短轉(zhuǎn)化周期，從農(nóng)桿菌感染到移土栽培50-60d，比其他方法的轉(zhuǎn)化周期時(shí)間縮短IOd以上；
(2)制備復(fù)合型外植體技術(shù)方法簡(jiǎn)單，步驟明了易于掌握和操作；
(3)復(fù)合型外植體再生率高達(dá)90%以上；
(4)復(fù)合型外植體的轉(zhuǎn)化效率為8%，明顯高于已報(bào)道的子葉節(jié)3%的轉(zhuǎn)化率及胚尖的5%
轉(zhuǎn)化率。
圖1. CEP外植體照片。圖2.復(fù)合型外植體(CEP)種植在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)Mh。圖3.質(zhì)粒PCAAFP66結(jié)構(gòu)示意圖，該表達(dá)載體含有35S啟動(dòng)子、抗冷凍蛋白基因和bar除草劑篩選標(biāo)記基因。圖4. CEP外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，圖示誘導(dǎo)2周的不定芽。圖5.不定芽在生根培養(yǎng)基中篩選并生根，圖中為篩選獲得的大豆轉(zhuǎn)基因植株移栽前的煉苗。圖6.大豆轉(zhuǎn)基因植株盆栽，生長(zhǎng)發(fā)育正常，圖示植株已開花。圖7.轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定結(jié)果，圖中泳道1-10顯示有目的基因afp的擴(kuò)增條帶 (400bp 左右)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式
進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但不對(duì)本發(fā)明作任何形式的限制。實(shí)施例中除作特殊說明外，均為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)施例1
表1培養(yǎng)基配方
萌發(fā)培養(yǎng)基30g/L蔗糖和質(zhì)量百分濃度為0. 8%的瓊脂，pH5. 8預(yù)培養(yǎng)基MSB5,1. 0mg/L6-BA, 30g/L蔗糖,質(zhì)量百分濃度為0. 8%的瓊脂，pH5. 8YEP固體培養(yǎng)基10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨,5g/LNaCl,質(zhì)量百分濃度為0. 6%的瓊脂，pH5. 8YEB液體培養(yǎng)基10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨,5g/LNaCl,pH5. 8共培養(yǎng)基l/2MSB5，30g/L 葡萄糖，6. 0mg/LBA,0. 5g/LMES, 200 μ mol/L 乙酰丁香酮，pH5. 8固體共培養(yǎng)1/2MSB5, 30g/L 葡萄糖,6. 0mg/L6_BA,0. 5g/LMES,200 μ mol/L 乙酰丁香酮,質(zhì)量百分濃度為 0. 4% 的瓊脂，pH5. 8芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2MSB5,0. 2mg/L6-BA,0. 2mg/LIBA (吲哚丁酸)，300mg/L 頭孢霉素，1. 2ang/LPPT,質(zhì)量百分濃度為 0. 8% 的瓊脂，pH5. 6生根培養(yǎng)基1/2MSB5，20g/L 蔗糖，1. Omg/LIBA, 250mg/L 頭孢霉素，0. 25mg/L PPT,質(zhì)量百分濃度為 0. 7% 的瓊脂,pH5. 6
1.無菌苗的制備
挑選飽滿健康成熟的華春3號(hào)大豆種子(購(gòu)自廣州新富農(nóng)生物科技有限公司)，放入含有氯氣(由50mL NaaO和2 mL濃HCl反應(yīng)生成)的密閉容器內(nèi)，消毒4飛h。在超凈工作臺(tái)上消毒后的大豆種子播種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，于25 28°C環(huán)境下光照培養(yǎng)催芽Mh。2.復(fù)合型外植體(CEP)的獲得及再生效果
將無創(chuàng)傷飽滿的成熟大豆種子消毒后，在無菌條件下置于萌發(fā)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)催芽 24L·之后從種子眼處去掉種皮，用解剖刀輕輕掰掉1片子葉，留下一片子葉，接著小心去掉胚尖兩側(cè)的第一片真葉，留下剛剛萌動(dòng)的胚尖，保留完整的下胚軸(包括胚根)，所得到的具有完整的下胚軸、胚尖及一片子葉，即為大豆轉(zhuǎn)基因復(fù)合型外植體，簡(jiǎn)稱CEP外植體。之后， CEP外植體胚尖朝上垂直播種于預(yù)培養(yǎng)基中，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)M 2 !，培養(yǎng)結(jié)果見圖2。不同大豆品種復(fù)合外植體的再生效果見表2，表2顯示了不同大豆品種CEP外植體的再生率均在 90%以上，其中華春3號(hào)最高為93. 9%。表2不同大豆品種復(fù)合外植體再生率比較
權(quán)利要求
1.一種制備大豆復(fù)合型外植體的方法，其特征在于是將成熟大豆種子消毒，無菌條件下在萌發(fā)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)催芽，催芽24h后，從種子眼處去掉種皮，去掉胚尖兩側(cè)的第一片真葉，去掉一片子葉，保留包括胚根的完整下胚軸、胚尖及另一片子葉，即為所述大豆復(fù)合型外植體；所述萌發(fā)培養(yǎng)基成分為30g/L蔗糖和質(zhì)量百分濃度為0. 8 %的瓊脂，pH 5. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備大豆復(fù)合型外植體的方法，其特征在于所述消毒是在含有氯氣的密閉容器內(nèi)熏蒸消毒4飛h。
3.一種制備快速轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法，其特征在于步驟如下(1)制備大豆復(fù)合型外植體用權(quán)利要求1或2所述方法制備大豆復(fù)合型外植體，將該外植體胚尖朝上垂直播種預(yù)培養(yǎng)基中，預(yù)培養(yǎng)^1 ；(2)攜帶目的基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化外植體將攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌在YEB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)液離心，收集沉淀，用共培養(yǎng)基稀釋成0D_=1. 5的菌液，將步驟(1) 中預(yù)培養(yǎng)后的大豆復(fù)合型外植體轉(zhuǎn)移到菌液中，28°C黑暗環(huán)境侵染191 ；(3)大豆復(fù)合型外植體芽誘導(dǎo)取出侵染后的大豆外植體，置于鋪有無菌濾紙的固體共培養(yǎng)基上，28°C黑暗培養(yǎng)3 7d，再取出，用無菌水洗去附著在其表面的農(nóng)桿菌，無菌濾紙吸干表面附著的液體，轉(zhuǎn)到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)2 3周，每周轉(zhuǎn)接一次，培養(yǎng)至外植體長(zhǎng)出不定芽；(5)生根培養(yǎng)及煉苗將芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的外植體不定芽轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)，根健壯時(shí)敞開瓶口煉苗2 3d，移入培養(yǎng)土中，待幼苗長(zhǎng)出兩片新葉后，再移栽到溫室中；所述預(yù)培養(yǎng)基成分MSB5，1.0 mg/L 6_BA，30g/L蔗糖，質(zhì)量百分濃度為0. 8 %的瓊脂， pH 5. 8 ；所述YEB液體培養(yǎng)基成分10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl, pH 5. 8 ；所述共培養(yǎng)基成分1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6. 0 mg/L ΒΑ,Ο. 5 g/L MES,200 μ mol/L 乙酰丁香酮，pH5. 8 ；所述固體共培養(yǎng)基成分1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L ΒΑ,Ο. 5 g/L MES, 200 μ mol/L 乙酰丁香酮，0. 4% 瓊脂，pH 5. 8 ；所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分1/2MSB5，0. 2 mg/L 6-BA,0. 2 mg/L IBA，300 mg/L頭孢霉素， 1. 25mg/L PPT，0· 8% 瓊脂，ρΗ5· 6 ；所述生根培養(yǎng)基l/2MSB5，20g/L 蔗糖，1.0mg/L IBA, 250mg/L 頭孢霉素，0. 25mg/L PPT，0. 7% 瓊脂，ρΗ5· 6。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備快速轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法，其特征在于步驟(2)中攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌菌株是ΕΗΑ105，外源目的基因?yàn)榭估鋬龅鞍谆騙’該農(nóng)桿菌還包括如r除草劑抗性基因作為篩選標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備快速轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法，其特征在于步驟(2)中攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌菌株由以下方法制備(1)構(gòu)建外源目的基因表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體PCAAFP66，該表達(dá)載體含有35S啟動(dòng) =f、afp抗冷凍蛋白基因和如r除草劑抗性篩選標(biāo)記基因；(2)外源目的基因轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌用熱激法把載體PCAAFP66轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌EHA105菌株中， 置-80°C保存?zhèn)溆茫?3)篩選取保存的菌株，在加入抗生素的YEP固體培養(yǎng)基上劃平板，培養(yǎng)48h，挑取單菌落接種到含有相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C、220 r/min培養(yǎng)M h，即得攜帶目的基因的農(nóng)桿菌菌株；所述抗生素為壯觀霉素、鏈霉素和卡那霉素中的一種或幾種； 所述YEP固體培養(yǎng)基成分為10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，質(zhì)量百分濃度為6%的瓊脂，pH 5. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備大豆復(fù)合型外植體的方法及用該復(fù)合型外植體制備快速轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法。本發(fā)明的方法是將成熟大豆種子消毒，無菌條件下在萌發(fā)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)催芽，催芽24h后去掉種皮、一片子葉和第一片真葉，保留下胚軸、胚尖及一片子葉，即為大豆復(fù)合型外植體。本發(fā)明方法制備的大豆復(fù)合型外植體可以用于制備快速轉(zhuǎn)基因大豆植株，外植體再生率高，達(dá)90%以上，轉(zhuǎn)化效率高，而且明顯縮短轉(zhuǎn)化周期。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102499075SQ20111030255
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者林俊芳, 覃鳳云, 趙印華, 郭麗瓊, 陳晟 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)