一種快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法，包括制備若干與待測(cè)含油微生物相同品種的微生物菌體樣品、采集各樣品低場(chǎng)核磁信號(hào)、測(cè)定各微生物樣品的含油量真實(shí)值、構(gòu)建預(yù)測(cè)模型、采集待測(cè)樣品的低場(chǎng)核磁CPMG衰減曲線(xiàn)譜圖、檢測(cè)待測(cè)樣品含油量等。本發(fā)明方法無(wú)需破壞微生物菌體，測(cè)試速度快，準(zhǔn)確性高；本發(fā)明方法樣品不需要復(fù)雜的前處理，無(wú)需使用有毒的有機(jī)試劑，成本低，對(duì)環(huán)境污染小，充分體現(xiàn)了綠色環(huán)保的觀念；本發(fā)明方法降低含油微生物油脂含量檢測(cè)的成本、提高檢測(cè)效率，促進(jìn)微生物菌株的優(yōu)選，促進(jìn)微生物油脂產(chǎn)業(yè)發(fā)展，進(jìn)一步保證油脂原料的穩(wěn)定和連續(xù)供應(yīng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種快速測(cè)定微生物含油量的方法，屬于微生物油脂測(cè)定的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)測(cè)量微生物油脂含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯(油脂)是重要的食用品和化工原料。此外，隨著能源的短缺現(xiàn)象加劇，油脂還被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生物柴油燃料，油脂資源的需求量日益增加。目前，油脂資源的獲取以動(dòng)物油脂和植物油脂為主。然而，傳統(tǒng)的油料來(lái)源受到耕地、季節(jié)和自然條件的制約，難以保證原料的穩(wěn)定和連續(xù)供應(yīng)。
[0003]自然界中一些微生物經(jīng)過(guò)發(fā)酵，可在體內(nèi)積累油脂。部分微生物油脂的脂肪酸組成和常見(jiàn)的植物油脂如菜籽油、棕櫚油、大豆油等相似，可作為食用品、化工原料、生物柴油的替代品。此外，利用微生物生產(chǎn)油脂還具有不受季節(jié)和氣候的影響、生產(chǎn)原料來(lái)源廣泛、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品高值化等優(yōu)點(diǎn)，因此具有重要應(yīng)用前景。
[0004]目前，制約微生物油脂產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題是昂貴的生產(chǎn)成本，其根本取決于微生物菌株的含油量，而含油量的提高相對(duì)降低了生產(chǎn)成本。因此，培育出生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、油脂含量高的微生物新品種是加快其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。微生物油脂是胞內(nèi)產(chǎn)物，因此，通常采取有機(jī)溶劑提取后稱(chēng)重的方式定量。現(xiàn)常用的方法有:索氏提取法(李超.食品分析原理與技術(shù).北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1987)、溶劑浸提法(李植峰，張玲.微生物學(xué)通報(bào),2001,28(6),72),酸熱法(李植峰，張玲.微生物學(xué)通報(bào),2001,28(6),72)、超聲波輔助溶劑浸提法(Vicente G,Bautista LF,Rodriguez R,et al.B1chemical EngineeringJournal，2009 ,48( I)，22)、微波輔助溶劑浸提法(Young JC.Journal of Agriculturaland Food Chemistry,1995,43(11),2904)等。上述方法的共同特點(diǎn)是:操作復(fù)雜，樣品需要大量前處理過(guò)程，使用高毒性有機(jī)溶劑，易造成環(huán)境污染，耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿(mǎn)足含有微生物大規(guī)模篩選的要求。因而，尋找快速高效測(cè)定微生物油脂含量的方法，對(duì)于富油微生物高通量篩選及胞內(nèi)油脂含量的快速測(cè)定等具有重要意義。
[0005]低場(chǎng)核磁共振是近年來(lái)發(fā)展的一種快速檢測(cè)方法。其基本原理是通過(guò)對(duì)處于恒定磁場(chǎng)中的樣品施加射頻脈沖，使氫質(zhì)子發(fā)生共振，質(zhì)子以非輻射的方式釋放所吸收的射頻波能量返回到基態(tài)，此過(guò)程將產(chǎn)生弛豫信號(hào)，該弛豫信號(hào)強(qiáng)度與被測(cè)樣品中所含核自旋數(shù)目成正比，信號(hào)衰減過(guò)程與被測(cè)物質(zhì)的成分結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。對(duì)弛豫信號(hào)進(jìn)行反演分析，可以獲得被測(cè)樣品的各種成分和微觀結(jié)構(gòu)信息，從而達(dá)到了檢測(cè)目的。低場(chǎng)核磁共振技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于污泥中油含量的檢測(cè)(CN201510166615.6)、液態(tài)食用油品質(zhì)鑒定(CN201410495096.3、CN201010268825.3)等方面，具有分析結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，測(cè)量時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。目前，將低場(chǎng)核磁共振技術(shù)應(yīng)用于微生物胞內(nèi)產(chǎn)物檢測(cè)的技術(shù)暫未發(fā)現(xiàn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明目的在于，提供一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、環(huán)保的檢測(cè)微生物油脂含量方法，同時(shí)降低檢測(cè)成本，進(jìn)而，促進(jìn)微生物菌株的優(yōu)選，促進(jìn)微生物油脂產(chǎn)業(yè)發(fā)展，進(jìn)一步保證油脂原料的穩(wěn)定和連續(xù)供應(yīng)。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法，包括如下步驟:
[0008]S1、取若干與待測(cè)含油微生物相同品種的微生物菌體，干燥至恒重，得到微生物樣品;
[0009]S2、采集步驟SI得到的各微生物樣品的低場(chǎng)核磁CPMG衰減曲線(xiàn)譜圖；采用一維反拉普拉斯算法作為橫向弛豫時(shí)間譜反演算法，得到各微生物樣品的弛豫時(shí)間譜T2曲線(xiàn)；
[0010]S3、提取步驟SI得到的各微生物樣品的油脂、稱(chēng)重，得到各微生物樣品含油量真實(shí)值；
[0011]S4、將步驟S2得到的各樣品回波衰減曲線(xiàn)數(shù)據(jù)與步驟S3得到的各微生物樣品的含油量真實(shí)值相關(guān)聯(lián)，利用主成分分析和最小二乘回歸方法進(jìn)行擬合得到含油微生物含油量PLSR預(yù)測(cè)模型；
[0012]S5、將所述待測(cè)含油微生物烘干至恒重，得到待測(cè)含油微生物樣品；采集所述待測(cè)樣品的低場(chǎng)核磁CPMG衰減曲線(xiàn)譜圖，分析譜圖數(shù)據(jù)，調(diào)用步驟S4建立的預(yù)測(cè)模型，獲得待測(cè)含油微生物的含油量。
[0013]優(yōu)選方式下，步驟SI所述含油微生物為經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，油脂含量超過(guò)細(xì)胞干重1wt %的真菌、微藻、細(xì)菌、基因工程菌、經(jīng)過(guò)自然或人工改造的突變菌株;最優(yōu)方式下，所述真菌為圓紅冬抱酵母(Rhodosporidium toruloides)、白色隱球酵母(Cryptococcusalbidus )、彎曲隱球酵母(Cryptococcus curvatus )、亞羅解脂酵母(Yarrowialipolytica)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、乳糖紅酵母(Rhodotorula Iactosa)、小紅酵母(Rhodotorula minuta)、橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)、皮狀絲抱酵母(Trichosporon cutaneum)、發(fā)酵性絲抱酵母(Trichosporon fermentans)、健強(qiáng)地霉(Geotrichum robustum)、深黃被抱霉(Mortierella isabellina)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、小克銀漢霉(Cunn inghamella)或伯頓擬內(nèi)抱霉(Endomy copsisburtonii);所述微藻為布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、小球藻(Ch lore I la protothecoides)、微綠球藻(Nannochlorops is sp.)或裂殖壺菌(Schizochytrium Iimacinum);所述細(xì)菌為棒狀桿菌(Corynebacterium)、諾卡氏菌(Nocardia)、分枝桿菌(Mycobacterium)。
[0014]優(yōu)選方式下，步驟S2、步驟S5所述低場(chǎng)核磁分析的CPMG序列參數(shù)為:90度脈寬Pl:13ys ； 180度脈寬Ρ2: 26ys ；重復(fù)采樣等待時(shí)間Tw: 2000ms ;模擬增益RGl: [ 10到20，均為整數(shù)];數(shù)字增益DRGl: [2到5，均為整數(shù)];前置放大增益PRG: [O到3];重復(fù)采樣次數(shù)NS:4，8，16;回?fù)軅€(gè)數(shù)NECH: 2000；接收機(jī)帶寬SW:100,200,300KHz ；開(kāi)始采樣時(shí)間的控制參數(shù)RFD:0.002-0.05ms；時(shí)延DLl:0.1-0.5ms進(jìn)行核磁共振信號(hào)采集。
[0015]優(yōu)選方式下，步驟S2所述采集樣品低場(chǎng)核磁信號(hào)，每組所述含油微生物樣品低場(chǎng)核磁CPMG譜圖進(jìn)行兩次及以上的平行檢測(cè)。
[0016]每組樣品進(jìn)行多次平行檢測(cè)分析，一方面，可以了解前后兩次或多次測(cè)試數(shù)據(jù)的誤差，從而了解低場(chǎng)核磁共振方法在微生物油脂品質(zhì)鑒定中的誤判概率;另一方面，同一個(gè)樣品多測(cè)幾組，可以排除儀器誤差。
[0017]優(yōu)選方式下，步驟S3采用有機(jī)溶劑提取步驟SI制備的含油微生物樣品的油脂。最優(yōu)方式下，步驟S3提取所述含油微生物樣品油脂的方法為氯仿-甲醇法、索氏抽提法、正己烷-異丙醇法、正己烷-乙醇法、乙醚-石油醚法中的一種或幾種組合。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:
[0019]1、與傳統(tǒng)微生物含油量測(cè)定方法相比，本發(fā)明方法無(wú)需破壞微生物菌體，測(cè)試速度快，準(zhǔn)確性高。
[0020]2、本發(fā)明方法僅前期建立模型涉及到提取微生物油脂過(guò)程，一旦建立模型后，之后含油量的測(cè)定不需要再提取油脂、直接低場(chǎng)核磁分析即可。因而，采用本發(fā)明方法檢測(cè)時(shí)，樣品不需要復(fù)雜的前處理，無(wú)需使用有毒的有機(jī)試劑，成本低，對(duì)環(huán)境污染小，充分體現(xiàn)了綠色環(huán)保的觀念。
[0021]3、本發(fā)明方法降低含油微生物油脂含量檢測(cè)的成本、提高檢測(cè)效率，促進(jìn)微生物菌株的優(yōu)選，促進(jìn)微生物油脂產(chǎn)業(yè)發(fā)展，進(jìn)一步保證油脂原料的穩(wěn)定和連續(xù)供應(yīng)。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為微生物油脂含量CPMG衰減曲線(xiàn)；
[0023]圖2為微生物油脂含量橫向弛豫圖譜；
[0024]圖3為微生物油脂含量PLSR模型殘余方差和主成分?jǐn)?shù)量關(guān)系圖；
[0025]圖4為校正集微生物油脂含量PLSR模型的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值回歸譜圖；
[0026]圖5為交互驗(yàn)證集微生物油脂含量PLSR模型的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值回歸譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面通過(guò)具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0028]實(shí)施例1
[0029](I)發(fā)酵性絲抱酵母(Trichosporonf ermentans CICC1368)培養(yǎng)方式參考文獻(xiàn)(WuSG,ZhaoX, ShenHff ,WangQ, ZhaoZK.B1resourceTechnology ,2011,102(2): 1803)。發(fā)酵液50ml，經(jīng)120h限硫培養(yǎng)。其中，培養(yǎng)基中硫元素濃度設(shè)置6個(gè)梯度，硫元素(S)濃度分別為
0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，分別標(biāo)記為1，2，3，4，5，6組，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行，通過(guò)限制硫元素，獲得不同含油量的菌體。發(fā)酵完畢后，將發(fā)酵液于6000rpm離心lOmin，收集菌體。菌體105°C干燥24h至恒重，將干菌體搜集后置于2ml試管中。
[0030](2)低場(chǎng)核磁儀器(匪120-030H-1)經(jīng)過(guò)校正后，設(shè)置CPMG序列參數(shù)為:90度脈寬Pl:13ys，180度脈寬Ρ2: 26ys，重復(fù)采樣等待時(shí)間Tw: 2000ms，模擬增益RG1:12，數(shù)字增益DRGl: 2，前置放大增益PRG: I，重復(fù)采樣次數(shù)NS: 16，回?fù)軅€(gè)數(shù)NECH: 2000，接收機(jī)帶寬SW:300KHz，開(kāi)始采樣時(shí)間的控制參數(shù)RFD: 0.02ms，時(shí)延DLl: 0.2ms。將所有樣品進(jìn)行核磁共振信號(hào)采集，獲得含油菌體低場(chǎng)核磁CPMG衰減譜圖(如圖1所示)，共6組樣品。采用一維反拉普拉斯算法作為橫向弛豫時(shí)間譜反演算法，得出微生物油脂的弛豫時(shí)間譜圖T2曲線(xiàn)(如圖2所示)。
[0031 ] (3)微生物油脂的提取:(I)中所述所有菌體使用酸熱-有機(jī)溶劑法抽提獲得油脂，稱(chēng)重計(jì)算菌體油脂含量，即得到微生物油脂質(zhì)量的真實(shí)值，I，2，3，4，5，6組油脂量分別為
0.155g，0.300g，0.445g，0.180g，0.140g，0.120g，。
[0032](4)預(yù)測(cè)模型構(gòu)建:將所獲得的回波衰減曲線(xiàn)數(shù)據(jù)與所對(duì)應(yīng)的油脂質(zhì)量真實(shí)值相關(guān)聯(lián)，利用主成分分析和最小二乘回歸方法進(jìn)行擬合，獲得的CPMG序列回波衰減曲線(xiàn)數(shù)據(jù)與上述步驟中對(duì)應(yīng)的微生物油脂質(zhì)量進(jìn)行擬合，獲得微生物油脂質(zhì)量PLSR預(yù)測(cè)模型。圖4為校正集微生物油脂含量PLSR模型的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值回歸譜圖，圖5為交互驗(yàn)證集微生物油脂含量PLSR模型的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值回歸譜圖；校正集和交互驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)Rcal2和Rcv2分別為0.9264，0.9037，均大于0.9 ；校正集和交互驗(yàn)證集的標(biāo)準(zhǔn)差RMSE分別為2.09 %和2.38%，均較小，說(shuō)明利用低場(chǎng)核磁共振儀準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)微生物油脂含量的方法切實(shí)可行。通過(guò)預(yù)測(cè)殘余方差和主成分關(guān)系圖來(lái)確定建立模型所需的最佳主因子數(shù)為1(如圖3所示)。
[0033](5)未知樣品的測(cè)定:發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans CICC 1368)發(fā)酵液20ml，經(jīng)96h培養(yǎng)后，將發(fā)酵液于6000rpm離心1min，收集菌體，菌體105°C干燥24h至恒重。干菌體搜集置于2ml試管中，進(jìn)行低場(chǎng)核磁快速測(cè)定。
[0034]按照所設(shè)參數(shù)分析樣品，對(duì)所得數(shù)據(jù)利用Unscramb軟件進(jìn)行分析，再利用建立的預(yù)測(cè)模型獲得預(yù)測(cè)值為0.1186g。
[0035]利用酸熱-有機(jī)溶劑法抽提獲得油脂，實(shí)際測(cè)量值0.1205g，相對(duì)誤差為2%。因此，采用低場(chǎng)核磁技術(shù)測(cè)定的油脂含量與實(shí)測(cè)值相當(dāng)，說(shuō)明低場(chǎng)核磁法測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0036]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51、取若干與待測(cè)含油微生物相同品種的微生物菌體，干燥至恒重，得到微生物樣品； 52、采集步驟SI得到的各微生物樣品的低場(chǎng)核磁CPMG衰減曲線(xiàn)譜圖；采用一維反拉普拉斯算法作為橫向弛豫時(shí)間譜反演算法，得到各微生物樣品的弛豫時(shí)間譜T2曲線(xiàn)； 53、提取步驟SI得到的各微生物樣品的油脂、稱(chēng)重，得到各微生物樣品含油量真實(shí)值； 54、將步驟S2得到的各樣品回波衰減曲線(xiàn)數(shù)據(jù)與步驟S3得到的各微生物樣品的含油量真實(shí)值相關(guān)聯(lián)，利用主成分分析和最小二乘回歸方法進(jìn)行擬合得到含油微生物含油量PLSR預(yù)測(cè)模型； 55、將所述待測(cè)含油微生物烘干至恒重，得到待測(cè)含油微生物樣品；采集所述待測(cè)樣品的低場(chǎng)核磁CPMG衰減曲線(xiàn)譜圖，分析譜圖數(shù)據(jù)，調(diào)用步驟S4建立的預(yù)測(cè)模型，獲得待測(cè)含油微生物的含油量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法，其特征在于，步驟SI所述含油微生物為經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，油脂含量超過(guò)細(xì)胞干重10wt%的真菌、微藻、細(xì)菌、基因工程菌、經(jīng)過(guò)自然或人工改造的突變菌株。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法，其特征在于，所述真菌為圓紅冬孢酵母、白色隱球酵母、彎曲隱球酵母、亞羅解脂酵母、粘紅酵母、乳糖紅酵母、小紅酵母、橘林油脂酵母、皮狀絲孢酵母、發(fā)酵性絲孢酵母、健強(qiáng)地霉、深黃被孢霉、卷枝毛霉、小克銀漢霉或伯頓擬內(nèi)孢霉;所述微藻為布朗葡萄藻、隱甲藻、小球藻、微綠球藻或裂殖壺菌;所述細(xì)菌為棒狀桿菌、諾卡氏菌、分枝桿菌。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法，其特征在于，步驟S2、S5所述低場(chǎng)核磁分析的CPMG序列參數(shù)為:90度脈寬Pl:13ys； 180度脈寬Ρ2: 26ys;重復(fù)采樣等待時(shí)間Tw: 2000ms ；模擬增益RGl: [ 10到20，均為整數(shù)]；數(shù)字增益DRGl: [2到5，均為整數(shù)]；前置放大增益PRG: [O到3];重復(fù)采樣次數(shù)NS:4，8，16;回?fù)軅€(gè)數(shù)NECH: 2000;接收機(jī)帶寬SW: 100，200，300KHz；開(kāi)始采樣時(shí)間的控制參數(shù)RFD:0.002-0.05ms；時(shí)延DLl:0.1-0.5ms進(jìn)行核磁共振信號(hào)采集。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法，其特征在于，步驟S2所述采集樣品低場(chǎng)核磁信號(hào)，每組所述含油微生物樣品低場(chǎng)核磁CPMG衰減曲線(xiàn)譜圖進(jìn)行兩次及以上的平行檢測(cè)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法，其特征在于，步驟S3采用有機(jī)溶劑提取步驟SI制備的含油微生物樣品的油脂。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述快速檢測(cè)含油微生物含油量的方法，其特征在于，步驟S3提取所述含油微生物樣品油脂的方法為氯仿-甲醇法、索氏抽提法、正己烷-異丙醇法、正己烷-乙醇法、乙醚-石油醚法中的一種或幾種組合。
【文檔編號(hào)】G01N24/08GK105954308SQ201610279812
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】林心萍, 高寧, 譚明乾, 宋玉昆, 王震宇, 劉灑灑, 謝同舟, 王珂旎
【申請(qǐng)人】大連工業(yè)大學(xué)