專利名稱：多元蛋白芯片及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測用的實驗片，特別是涉及一種可直接同時檢測多種生物分子相互作用和生物分子活性的多元蛋白芯片及其制法和用途。
免疫熒光技術是一種免疫分子檢測技術，以熒光染料為待測分子標記物，識別和測定免疫分子活性。該方法特異性強，速度快(染色步驟和顯微鏡檢查能在1-2小時內完成)，敏感性高。但是也有缺點如非特異性染色問題未解決、結果判定的客觀性不足、技術程序也比較復雜、需要特殊的昂貴設備，即熒光顯微鏡。而且染色標本只能作短期觀察，不能長期保存。熒光的強度隨PH值和熒光染料與抗體的比例而改變，而且對熒光強度的判定帶有一定的主觀性。如文獻1楊宜為編著，“免疫檢測技術”，科學出版社，158(1991)，一書中介紹的。又如文獻2朱培坤，“免疫酶技術”，山東科學技術出版社，3(1983)，一書中所介紹的免疫酶技術，是將抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反應相結合的免疫分子檢測技術，敏感性和特異性同免疫熒光技術相當，不需特殊的熒光顯微鏡，應用范圍廣泛。其中使酶與抗體(或抗原)交聯起來的方法與條件，直接影響酶標抗體(或抗原)的活性，從而影響免疫酶技術的使用。只有獲得一定數量的純化酶才能用于對抗體(或抗原)的標記，或者在非標記免疫酶技術中作為抗原使用。在免疫酶技術的固相載體方法中，固相載體的選擇是否合適，會直接影響實驗結果。在免疫酶技術的組織化學方法中，則要注意消除組織中內源酶染色與非特異性染色的干擾，否則會使實驗達不到預期的目的。
在文獻1一書中還介紹了放射免疫測定方法，該方法是目前使用最廣泛的免疫分子檢測方法，它有特異性強，靈敏度高，能夠精確地測定體液中的微量活性物質的優(yōu)點。但是，嚴重的缺點是，不得不使用放射性物質為分子標記物，同時需要特殊的檢測儀器和安全防護器材。實驗設備昂貴，實驗操作要求嚴格，實驗室中各種試劑、各種儀器、各個步驟等方面的細微變化，都可能造成測定誤差。該技術是使用放射性物質，易對環(huán)境和操作者造成污染和傷害。
此外在與本發(fā)明相關的發(fā)明名稱為“三物活性探針及制法和用途”的專利申請文件中，公開了一種新的快速、靈敏檢測生物活性分子的探針和方法，但是這種探針只能一次實時觀測一種生物分子，因而有極大的局限性。另外，如檢測多種生物分子混合溶液時，需用多種生物活性分子的探針一個一個的檢測，既費工又費時造成浪費。
本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術的缺點，為了節(jié)約時間和人工；為了實時觀測在研究或生產過程中所使用的含有多種生物分子混合溶液中，部分或全部種類的生物分子與芯片感應表面上的對應分子之間的相互作用過程，以進行生物分子動力學研究和多種生物化學樣品檢查；從而建立一種操作簡單，結果直觀，檢測費用低廉，并且無需任何標記物，可對一生物分子混合溶液直接同時檢測多種生物分子相互作用和生物分子活性的多元蛋白芯片及制法和用途。
本發(fā)明的目的是這樣實現的利用具有生物活性的矩陣式分布的多元蛋白感應表面及生物分子的特異結合性，形成在橢偏成像觀察下的，可以直接同時測定一生物分子混合溶液中多種生物分子活性的蛋白芯片。
本發(fā)明的提供的可直接同時檢測多種生物分子活性的多元蛋白芯片，其組成包括三層結構第一層為在固體基片上，經光刻加工，形成矩陣式分布的多表面單元；第二層為在第一層多表面單元上經親或疏水化學極化處理，形成親或疏水極化表面層；第三層為在第二層的各個單元表面上，分別滴加各種具有生物活性的分子溶液，以形成可以同時探測多種生物分子活性的感應表面層。
當檢測時將多元蛋白芯片的感應表面放入含有待測分子的溶液中，由于生物分子的特異結合性，溶液中的活性分子與感應表面上的相應活性分子相結合，而形成復合分子，使感應表面的相應單元的表面形貌發(fā)生變化，即出現表面復合膜層或復合分子進入溶液使多元蛋白芯片的原表面的感應膜層部分或全部消失；而不發(fā)生特異性生物分子反應的單元的表面形貌保持不變。此表面形貌的變化可以通過橢偏成像系統觀察到，并且同時觀測溶液中多種生物分子的存在和多元分子的反應過程。
本發(fā)明提供的多元蛋白芯片的制作方法，依下列步驟進行1、固體基片表面處理，按常規(guī)半導體工藝將固體基片表面作成矩陣式分布的多表面單元；(1)．光刻a．按常規(guī)方法在制版玻璃上鍍Cr膜；由圖形發(fā)生器生成所需矩陣圖案；經感光、顯影，制成矩陣式掩膜版；b．按常規(guī)CVD法，在固體基片上生成SiO2膜層；c．按常規(guī)方法在SiO2膜層上涂感光膠、固化、加掩膜、光照、顯影，以去除矩陣間隔部分的SiO2的基片；d．按常規(guī)方法將上述步驟c．制成的基片上用堿腐蝕，使間隔部分(沒有SiO2的地方)絨面化；其中NaOH堿腐蝕液濃度為20％，在80℃條件下，腐蝕10分鐘；e．緩沖氫氟酸(BHF∶HF∶NH4F∶H2O)，去除原始SiO2；f．CVD生長SiO2減反射層，約150納米，以觀察生長SiO2顏色至深藍為止；g．經常規(guī)方法去除矩陣格點處的SiO2；h．用H2SO4∶H2O2，5∶1 V/V的清潔液，清潔表面；2、表面親水化處理a．將上述步驟(1)得到的表面矩陣化的固體基片先在清洗液1中清洗5分鐘，再在清洗液2中清洗5分鐘，制備出在表面矩陣化的固體基片上具有親水極化層；其中清洗液1為H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶NH4OH(濃度25％wt)=5∶1∶1(V/V)清洗液2為H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶HCl(濃度37％wt)=6∶1∶1(V/V)b．或者表面疏水化c．將上述步驟獲得的具有親水極化層的固體基片表面放入硅烷溶液，其配比為硅烷∶三氯乙烯=1∶4(V/V)，浸泡5分鐘時間，制備出在表面矩陣化的固體基片上具有疏水極化層；3、活性生物分子感應膜層制備將上述步驟處理好的固體基片矩陣化表面上各個格點表面上，分別用加樣槍滴加不同種類的活性生物分子溶液，使不同生物分子自然吸附在各格點表面上，持續(xù)30分鐘，然后用去離子水洗凈，即得活性生物分子感應膜層；其中所述的固體基片包括各種半導體基片如硅片、鍺片等；玻璃，金屬，塑料和固體復合材料，如半導體表面鍍金屬膜等。
其中所述的生物分子包括各種具有特異性結合的生物分子。
本發(fā)明的多元蛋白芯片進行生物分子的活性探測采用如下步驟將一制好的多元蛋白芯片感應表面浸入待測的混合物溶液，經一定反應時間后，溶液中的生物分子與感應表面上相應格點上的特定分子特異性結合，形成分子復合物。使感應表面上相應格點的形貌發(fā)生變化，即出現表面復合膜層或復合分子進入溶液，使原表面的感應膜層部分或全部消失。而不發(fā)生特異性分子結合的格點處的表面形貌保持不變。此表面形貌的變化可以通過橢偏成像系統觀察到，以此同時觀測多種生物分子的相互作用或待測物中的各種活性生物分子存在情況。
本發(fā)明的多元蛋白芯片有以下用途1)優(yōu)化免疫測定；2)篩選，鑒定受體或配體；3)免疫特異識別機理的研究；4)內分泌激素檢測；5)生物活性探測；6)藥物篩選；7)常規(guī)門診免疫檢查；可用于內分泌學、免疫病理學、血液學、寄生蟲學、微生物學、人體及動物病毒學、植物病毒學、獸醫(yī)學、腫瘤學、細胞生物學、遺傳學、生物化學、分子生物學、醫(yī)學及藥物學、食品衛(wèi)生學等學科的研究。
可用于醫(yī)院臨床疾病和健康狀況診斷。
本發(fā)明的優(yōu)點及效果1、本發(fā)明克服了已有檢測技術的缺點，對待測分析物無特殊要求，提供可直接、快速地同時檢測多種生物分子活性的多元蛋白芯片。
2、應用本發(fā)明的多元蛋白芯片進行檢測時，檢測樣品無需任何標記物，這樣避免許多麻煩和污染問題，檢測靈敏度高，同放射免疫法相當。
3、直接測量非純化的多種生物分子的混合物。
4、樣品用量少，操作簡單，檢測速度快，即使對于檢測多種生物分子的混合物溶液一般僅需30分鐘。
5、實時檢測多元生物分子相互作用的動態(tài)過程。
6、具有分辨和排除干擾信號能力。
7、適用范圍廣，可在氣、液相中檢測。
8、結果直觀，其表面形貌的變化可以通過橢偏成像系統直接觀察到。
下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細說明
圖1是本發(fā)明的多元蛋白芯片結構示意2是本發(fā)明的多元蛋白芯片經過浸進測試液后的變化3是本發(fā)明的多元蛋白芯片實時檢測圖實施例1(1)固體基片(1)表面處理固體基片(1)采用p型<100>晶向，5-10Ω-cm，2英寸直徑的雙拋光面硅片，在硅片上進行光刻，制備矩陣化表面a．在制版玻璃上Cr膜+感光膠；由圖形發(fā)生器生成1.5×1.5mm方格，間隔1mm矩陣周期2.5mm圖案；感光、顯影，制成矩陣式掩膜；b．CVD法，在固體基片上生成250nmSiO2膜層；c．在SiO2膜層上涂感光膠、固化、加掩膜、光照、顯影，以去除矩陣間隔部分的SiO2；d．堿腐蝕(NaOH 20％,80℃,10分鐘)，使間隔部分絨面化；e．緩沖氫氟酸(BHF∶HF∶NH4F∶H2O)，去除原始SiO2；f．CVD生長SiO2減反射層，約150納米，以觀色至深藍；g．去掩膜、光照、顯影，去除矩陣格點處的SiO2；h．用H2SO4∶H2O2，5∶1 V/V，清潔表面；i．立體鏡觀測表面，并切成4×10矩陣網格式表面?zhèn)溆谩?br>
(2)表面親水極化處理將表面矩陣化的硅片先在清洗1液中清洗，再在清洗2液中清洗，即可。其中所用清洗液配方如下清洗1液H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶NH4OH(濃度25％wt)=5∶1∶1(V/V)清洗2液H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶HCl(濃度37％wt)=6∶1∶1(V/V)3)活性生物分子感應膜層制備將上述經過表面疏水化的、具有如下矩陣化表面的固體基片(1,1),(1,2),(2,1)和(2,2)；(1,3),(1,4),(2,3)和(2,4)；(3,1),(3,2),(4,1)和(4,2)(3,3),(3,4),(4,3)和(4,4)；在其格點表面上分別滴加BSA,IgG,Fib,HSA等蛋白質溶液(1mg/ml)，使不同蛋白分子自然吸附在上述對應格點表面上，持續(xù)30分鐘時間，然后洗凈，即形成了檢測上述四種蛋白抗體的多元蛋白芯片。
3)應用上述四種蛋白抗體的多元蛋白芯片進行生物分子的活性探測將該芯片感應表面浸入含有其中一種、兩種、三種、以至四種抗體的溶液，經一定反應時間后，感應表面上相應格點上的特定生物分子與對應滴液中的抗體分子特異性結合，形成抗原-抗體分子復合物，使感應表面上相應格點出現表面復合膜層。而不發(fā)生特異性分子結合的格點處的表面形貌保持不變。此表面形貌的變化可以通過橢偏成像系統觀察到，以斷定溶液中有哪種抗體或哪幾種抗體存在，如圖1-3所示。
本實施例的多元蛋白芯片的實驗方法還可用于免疫學研究及多種免疫檢測。
實施例2完全按實施例1的工藝制備出親水極化表面的固體基片后，直接制備活性生物分子感應膜層，即可得到本發(fā)明的多元蛋白芯片。
權利要求
1.一種多元蛋白芯片，其特征在于包括三層結構第一層為在固體基片上，經光刻加工形成矩陣式分布的多個表面單元；第二層為在多個表面單元上經親或疏水化學極化表面層；第三層為在第二層的各個單元表面上，分別滴加具有生物活性的多元分子溶液形成的生物分子的感應膜層。
2.一種制備權利要求1所述的多元蛋白芯片的方法，其特征在于依下列步驟進行(1)．固體基片表面處理按常規(guī)半導體工藝將固體基片表面作成矩陣式分布的多單元表面(2)．固體基片表面極化處理a．將上述步驟(1)得到的表面矩陣化的固體基片進行親水極化處理，先在清洗液1中清洗5分鐘，再在清洗液2中清洗5分鐘；(3)．活性生物分子感應膜層的制備將上述步驟處理好的固體基片矩陣化表面的各個格點上，分別用加樣槍滴加不同種類的活性生物分子溶液，使不同生物分子自然吸附在各格點表面上，持續(xù)30分鐘，然后用去離子水洗凈；
3.按權利要求2所述的一種多元蛋白芯片制備方法，其特征在于所說的固體基片表面處理按常規(guī)半導體工藝步驟如下a．按常規(guī)方法在制版玻璃上鍍Cr膜；由圖形發(fā)生器生成所需矩陣圖案；經感光、顯影，制成矩陣式掩膜版；b．按常規(guī)CVD法，在固體基片上生成SiO2膜層；c．按常規(guī)方法在SiO2膜層上涂感光膠、固化、加掩膜、光照、顯影，以去除矩陣間隔部分的SiO2的基片；d．按常規(guī)方法將上述步驟c．制成的基片上用堿腐蝕，使間隔部分(沒有SiO2的地方)絨面化；其中堿腐蝕液為NaOH 20％，在80℃條件下，腐蝕10分鐘；e．緩沖氫氟酸(BHF∶HF∶NH4F∶H2O)，去除原始SiO2；f．CVD生長SiO2減反射層，約150納米，以觀察生長SiO2顏色至深藍為止；g．經常規(guī)方法去除矩陣格點處的SiO2；h．用H2SO4∶H2O2，5∶1 V/V的清潔液，清潔表面；
4.按權利要求2所述的一種多元蛋白芯片制備方法，其特征在于所說的清洗液1配方為H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶NH4OH(濃度25％wt)=5∶1∶1(V/V)；清洗液2配方為H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶HCl(濃度37％wt)=6∶1∶1(V/V)。
5.按權利要求2所述的一種多元蛋白芯片制備方法，其特征在于所說的固體基片表面極化處理還包括表面疏水化處理將上述步驟制得的親水表面固體基片放入4∶1(V/V)三氯乙烯∶硅烷液，浸泡5分鐘時間。
6.應用權利要求1所述的一種多元蛋白芯片同時檢測多種生物分子的活性的方法，其特征在于采用如下步驟將多元蛋白芯片的感應表面浸入待測的多元分析物溶液，經一定反應時間后，溶液中的多元分子與感應表面上相應格點上的特定分子特異性結合，形成分子復合物，使感應表面上相應格點的形貌發(fā)生變化，當出現表面復合膜層或復合分子進入溶液，使原表面的感應膜層部分或全部消失；而不發(fā)生特異性分子結合的格點處的表面形貌保持不變，該表面形貌的變化通過橢偏成像系統觀察，并且同時觀測多元生物分子的相互作用或檢測待測的多種生物分子混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可直接同時檢測多種生物分子相互作用和生物分子活性的多元蛋白芯片和制備方法。該芯片由在固體基片上,經加工形成矩陣式分布的表面單元;再經處理形成親或疏水極化層,后在其各個單元面積內,分別滴加具有生物活性的溶液形成多種生物分子的感應表面層組成。本發(fā)明對待測分析物無特殊要求,無需任何標記物,檢測靈敏度高,樣品用量少,操作簡單,檢測速度快可直接、快速地同時檢測多種生物分子活性。
文檔編號G01N33/50GK1288955SQ9911948
公開日2001年3月28日 申請日期1999年9月20日 優(yōu)先權日1999年9月20日
發(fā)明者靳剛 申請人:中國科學院力學研究所