透射式差動(dòng)共焦CARS顯微光譜測試方法及裝置與流程

本發(fā)明屬于顯微光譜成像技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種透射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜探測方法及裝置，可用于精確檢測透明樣品的微區(qū)拉曼光譜和幾何形貌，并獲得高空間分辨的層析圖譜圖像。

技術(shù)背景

1990年，共焦拉曼光譜顯微技術(shù)的成功應(yīng)用，極大的提高了探索微小物體具體組織成分及形貌的可能。它將共焦顯微技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合，具備共焦顯微術(shù)的高分辨層析成像特征，又兼有無傷檢測和光譜分析能力，已成為一種重要的材料結(jié)構(gòu)測量與分析的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、石油化工、食品、藥物、刑偵等領(lǐng)域。

傳統(tǒng)的自發(fā)拉曼散射成像技術(shù)由于拉曼散射本身特性導(dǎo)致其發(fā)射信號(hào)極弱，即便用高強(qiáng)度的激光激發(fā)，要得到一副對比度好的光譜圖像，依然需要很長的作用時(shí)間。這種長時(shí)間作用限制了拉曼顯微技術(shù)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用?；谙喔衫?yīng)的相干反斯托克斯拉曼散射(cars)過程能夠很大程度上增強(qiáng)拉曼信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)快速檢測。相干拉曼效應(yīng)是通過受激激發(fā)的光將分子鎖定在振動(dòng)能級(jí)上，這種方法產(chǎn)生的振動(dòng)信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度成非線性關(guān)系，可以產(chǎn)生很強(qiáng)的信號(hào)，也稱為相干非線性拉曼光譜。它具有很強(qiáng)的能量轉(zhuǎn)換效率，曝光時(shí)間短，對樣品的損害也比較小，同時(shí)它的散射具有一定的方向性，容易與雜散光分離。

相干反斯托克斯拉曼散射(cars)的產(chǎn)生是一個(gè)三階非線性光學(xué)過程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探測光。一般而言，為了減少光源的數(shù)量，簡化過程，常用泵浦光代替探測光，它們之間的關(guān)系如圖2所示，當(dāng)泵浦光(wp)和斯托克斯光(ws)的頻率之差與拉曼活性分子的振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，將激發(fā)出cars光was，其中was＝2wp-ws。cars光的產(chǎn)生過程包含特定的拉曼活性分子的振動(dòng)模式和導(dǎo)致分子從基態(tài)至激發(fā)態(tài)振動(dòng)躍遷的入射光場的相互作用過程，它的能級(jí)示意圖如圖3所示。圖3(a)表示拉曼共振和非共振單光子增強(qiáng)對cars過程的貢獻(xiàn)，圖3(b)表示拉曼共振和非共振雙光子增強(qiáng)對cars過程的貢獻(xiàn)；當(dāng)wp和ws之間的頻差與拉曼活性分子的振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，激發(fā)出的信號(hào)得到共振增強(qiáng)，同時(shí)非共振部分也會(huì)由于電子躍遷響應(yīng)得到增強(qiáng)，因此要得到較好的cars信號(hào)，需要盡可能的抑制非共振背景信號(hào)，常見的方法是偏振cars(p-cars)方法。

p-cars的原理如圖4所示，光源1發(fā)出的頻率為ws的斯托克斯光，起偏后經(jīng)過四分之一波片和半波片后與光源2發(fā)出的頻率為wp的泵浦光(探針光)匯合，經(jīng)二向分光鏡后由反射鏡發(fā)射至水浸顯微物鏡，聚焦在樣品上，激發(fā)出載有光譜特性的cars光后，透射進(jìn)入信號(hào)采集系統(tǒng)；信號(hào)由一個(gè)油浸的顯微物鏡采集，經(jīng)過一個(gè)偏振片過濾非共振背景，然后通過一個(gè)濾光片濾除其他譜段的干擾后，被一個(gè)雪崩光電二極管所采集，即獲得特定頻譜的光譜信號(hào)。

p-cars能夠很大程度的抑制非共振信號(hào)和激發(fā)光的干擾，但是由于其采用的是兩個(gè)單波長激光器，只能獲得特定頻譜的光譜信息，因此它的廣泛使用受到了極大的限制。

傳統(tǒng)cars顯微術(shù)沒有強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)的定焦能力，導(dǎo)致實(shí)際光譜探測位置往往處于離焦位置。即便離焦位置也能激發(fā)出樣品的拉曼光譜并被針孔后的光譜儀探測，但是強(qiáng)度并不能合理表征該點(diǎn)正確的光譜信號(hào)強(qiáng)度。在cars顯微系統(tǒng)中，只有當(dāng)系統(tǒng)精確定焦，才能獲得最佳空間分辨力和最好的光譜探測能力。

此外，大多數(shù)光譜檢測技術(shù)及裝置是基于反射式結(jié)構(gòu)，在檢測透明材料時(shí)效果不佳。上述原因限制了cars顯微系統(tǒng)探測微區(qū)光譜的能力，制約了其在透明樣品微區(qū)光譜測試與分析中的應(yīng)用。基于上述情況，本發(fā)明提出將系統(tǒng)收集到的樣品中散射的強(qiáng)于樣品拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光進(jìn)行高精度探測，使其與光譜探測單元有機(jī)融合，進(jìn)行空間位置信息和光譜信息的同步探測，以實(shí)現(xiàn)高空間分辨的、高光譜分辨的差動(dòng)共焦cars圖譜成像和探測。

本發(fā)明專利的核心思想是選用超連續(xù)譜脈沖激光器和單波長脈沖激光器作為激發(fā)光源，擴(kuò)大激發(fā)光譜范圍，提高光譜激發(fā)強(qiáng)度；將共焦探測光路分成兩個(gè)部分，兩個(gè)探測光路的光電探測器分別置于焦前焦后等距位置來實(shí)現(xiàn)差動(dòng)探測，根據(jù)差動(dòng)的原理，實(shí)現(xiàn)雙極性絕對零點(diǎn)跟蹤測量，精確定焦，實(shí)現(xiàn)高空間分辨；精確定焦后，進(jìn)行光譜探測，獲得最佳光譜分辨能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種可檢測透明微小樣品幾何形貌和光譜信息的透射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜測試方法及裝置。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種透射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜測試方法：

a)在光譜激發(fā)單元(1)中，單波長脈沖激光器(2)產(chǎn)生單波長脈沖激光作為泵浦光和探測光，超連續(xù)譜激光器(3)超連續(xù)譜激光通過帶通濾光片(4)選擇特定波長范圍的激光作為斯托克斯光；兩束激光通過二向色鏡(5)混合在一起，通過調(diào)整光路，使兩束激光空間重合(泵浦光包絡(luò)于斯托克斯光)、時(shí)間一致(兩束激光到達(dá)二向色鏡的光程一致)；在光譜激發(fā)單元(6)中，混合光束經(jīng)第一反射鏡(7)反射后經(jīng)由固定在z向平移臺(tái)(8)上的顯微物鏡(9)會(huì)聚在被測樣品(11)上，激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品(11)光譜特性的cars光后被顯微物鏡(12)收集，光束中的cars光透過二向色鏡(13)進(jìn)入光譜探測單元(14)進(jìn)行光譜探測，瑞利光反射進(jìn)入差動(dòng)共焦探測單元(20)進(jìn)行幾何測量；

b)在光譜探測單元(14)中，包含cars光的光束先經(jīng)過帶通濾光片(15)，濾除光束中的非cars干擾光，然后通過第一會(huì)聚鏡(16)會(huì)聚進(jìn)入光譜儀(19)，獲得cars光譜信息；在差動(dòng)共焦探測單元(20)中，另一束載有瑞利光的光束通過半反半透棱鏡(21)分成兩束，分別進(jìn)行焦前、焦后探測，其中一束光通過第三會(huì)聚鏡(22)后通過位于焦前的第二針孔(23)濾除雜散光后被第一光電探測器(24)探測，獲得前焦信號(hào)(28)，另一束光通過第四會(huì)聚鏡(25)后通過位于焦后的第三針孔(26)濾除雜散光后被第二光電探測器(27)探測，獲得后焦信號(hào)(29)，由于第二針孔與第三針孔離焦量相同，因此對前焦信號(hào)和后焦信號(hào)做差，得到的差動(dòng)共焦信號(hào)(30)中過零點(diǎn)位置與焦點(diǎn)位置精確對應(yīng)，結(jié)合z向平移臺(tái)(8)和x-y平移臺(tái)(10)的位置，獲得的被測樣品的幾何位置信息i(x,y,z)。

c)通過計(jì)算機(jī)(40)控制z向平移臺(tái)(8)帶動(dòng)顯微物鏡(9)移動(dòng)，使顯微物鏡(9)聚焦在被測樣品(11)頂點(diǎn)處，重新獲取cars光譜信號(hào)i(λ)，利用計(jì)算機(jī)將獲得的幾何位置信息i(x,y,z)和光譜信號(hào)i(λ)融合處理，獲得被測樣品的四維測量信息i(x,y,z,λ)，即實(shí)現(xiàn)高空間分辨的微區(qū)圖譜層析成像。

特別的，在本發(fā)明方法中，通過匹配不同譜帶的濾光片，選擇不同譜段的斯托克斯光，以實(shí)現(xiàn)不同譜段的光譜探測，其中濾光片(4)與濾光片(15)的濾光譜帶關(guān)于泵浦光中心波長對稱。

特別的，在激光發(fā)射單元(1)和光譜激發(fā)單元(6)之間添加偏振片，可獲得偏振光，進(jìn)而改善激發(fā)的cars光譜的信噪比。

特別的，在本發(fā)明方法中，在激光發(fā)射單元(1)和光譜激發(fā)單元(6)之間添加光瞳濾波器(31)，可獲得結(jié)構(gòu)光束，壓縮聚焦光斑尺寸，提高系統(tǒng)橫向分辨率。

特別的，在本發(fā)明方法中，激發(fā)光產(chǎn)生的途徑還包括單波長激光器(2)加光子晶體光纖(33)產(chǎn)生超連續(xù)譜激光后與單波長激光耦合的方式；

特別的，在本發(fā)明方法中，本發(fā)明方法探測cars光譜的方法還可以是將光譜探測單元(14)中的光譜儀(19)替換成光電點(diǎn)探測器(38)，采用偏振片(37)旋轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)光譜掃描探測的方式獲得cars光譜。

特別的，本發(fā)明方法還包括反向激發(fā)、反向探測的光譜激發(fā)探測模式。

一種透射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜測試裝置，包括以下五個(gè)單元：激光發(fā)射單元(1)、光譜激發(fā)單元(6)、光譜探測單元(14)、差動(dòng)共焦探測單元(20)、計(jì)算機(jī)(40)。激光發(fā)射單元(1)位于光譜激發(fā)單元(6)中第一反射鏡(7)的入射方向，光譜探測單元(14)位于光譜激發(fā)單元(6)中二向色鏡(13)的透射方向，差動(dòng)共焦探測單元(20)位于二向色鏡(13)的反射方向。計(jì)算機(jī)(40)用于控制光譜激發(fā)單元(6)中z向平移臺(tái)(8)和x-y平移臺(tái)(10)的移動(dòng)、顯微物鏡(9)的切換、光譜儀采集的光譜數(shù)據(jù)和差動(dòng)共焦探測數(shù)據(jù)的融合處理；

在本發(fā)明裝置中，激光發(fā)射單元(1)包括單波長脈沖激光器(2)、超連續(xù)譜激光器(3)、帶通濾光片(4)、二向色鏡(5)；光譜激發(fā)單元(6)包括第一反射鏡(7)、z向平移臺(tái)(8)、顯微物鏡(9)、x-y平移臺(tái)(10)、被測樣品(11)、顯微物鏡(12)、二向色鏡(13)；光譜探測單元(14)包括帶通濾光片(15)、第一聚光鏡(16)、第一針孔(17)、第二聚光鏡(18)、光譜儀(19)；差動(dòng)共焦探測單元(20)包括分光棱鏡(21)、第三聚光鏡(22)、第二針孔(23)、第一光電探測器(24)、第四聚光鏡(25)、第三針孔(26)、第二光電探測器(27)；

在本發(fā)明裝置中，cars光譜激發(fā)的光源選擇模式包括單波長激光器(2)發(fā)出的光作為泵浦光和探測光時(shí)，連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出的連續(xù)譜激光作為斯托克斯光；單波長激光器(2)發(fā)出的光作為斯托克斯光和探測光時(shí)，連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出的連續(xù)譜激光作為泵浦光；

有益效果

本發(fā)明方法，對比已有技術(shù)具有以下顯著優(yōu)勢：

1、本發(fā)明采用透射式顯微結(jié)構(gòu)，對透明樣品光譜和幾何結(jié)構(gòu)的測量與分析更加準(zhǔn)確，獲得的光譜信號(hào)更強(qiáng)；

2、采用激光差動(dòng)共焦系統(tǒng)軸向響應(yīng)曲線的過零點(diǎn)位置與顯微物鏡焦點(diǎn)位置精確對應(yīng)這一特性，精確捕獲激發(fā)光斑焦點(diǎn)位置信息，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定焦，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高空間分辨的光譜探測。

3、本發(fā)明利用二向色分光裝置對系統(tǒng)收集到的瑞利光和載有樣品信息的cars光無損分離，其中瑞利光進(jìn)入差動(dòng)共焦探測單元，cars光進(jìn)入光譜探測單元，實(shí)現(xiàn)光能的盡可能利用，并提高系統(tǒng)光譜探測靈敏度。

4、與傳統(tǒng)共焦cars顯微系統(tǒng)比較，本發(fā)明裝置抗環(huán)境干擾能力更強(qiáng)，可顯著抑制系統(tǒng)的非線性、樣品反射率和表面傾斜等對測量結(jié)果的影響，有利于實(shí)現(xiàn)微細(xì)透明結(jié)構(gòu)的多層分析、高精度、高分辨力的測量；

5、本發(fā)明具有三種測量模式，差動(dòng)共焦顯微單元實(shí)現(xiàn)三維形貌測量，光譜探測單元實(shí)現(xiàn)光譜測量，兩者結(jié)合實(shí)現(xiàn)層析圖譜測量。

附圖說明

圖1為摘要附圖，即本發(fā)明基本實(shí)施圖；

圖2為cars光與泵浦光、斯托克斯光的關(guān)系圖；

圖3為cars光激發(fā)能級(jí)關(guān)系圖；

圖4為傳統(tǒng)偏振探測顯微光路圖；

圖5為光譜探測改進(jìn)方法示意圖；

圖6為改進(jìn)光譜探測的透射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜探測方法示意圖；

圖7為透明樣品層析測量示意圖；

圖8為加光瞳濾波器的透射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜探測方法示意圖；

圖9為單激光器的透射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜探測方法示意圖；

圖10為時(shí)域掃描的透射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜探測方法示意圖；

圖11為反向激發(fā)、反向探測的透射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜激發(fā)示意圖；

圖12為透射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜實(shí)施裝置圖，即實(shí)施例用圖；

圖中，1-激光發(fā)射單元、2-單波長激光光源、3-超連續(xù)譜激光光源、4-帶通濾光片、5-二向色鏡、6-光譜激發(fā)單元、7-第一反射鏡、8-z向平移臺(tái)、9-顯微物鏡、10-x-y平移臺(tái)、11-被測樣品、12-顯微物鏡、13-二向色鏡、14-光譜探測單元、15-帶通濾光片、16-第一聚光鏡、17-第一針孔、18-第二聚光鏡、19-光譜儀、20-差動(dòng)共焦探測單元、21-分光棱鏡、22-第三聚光鏡、23-第二針孔、24-第一光電探測器、25-第四聚光鏡、26-第三針孔、27-第二光電探測器、28-前焦曲線、29-后焦曲線、30-差動(dòng)共焦曲線、31-光瞳濾波器、32-偏振分光棱鏡、33-光子晶體光纖、34-第二反射鏡、35-光學(xué)延時(shí)器、36-第三反射鏡、37-偏振片、38-光電點(diǎn)探測器、39-減法電路、40-計(jì)算機(jī)；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1中光譜探測單元(14)由帶通濾光片(15)、第一聚光鏡(16)、光譜儀(19)組成；若在此光譜探測單元(6)中添加針孔過濾雜散光，則如圖5所示，光束經(jīng)帶通濾光片(15)濾除非cars光，然后通過第一聚光鏡(16)后通過第一針孔(17)過濾環(huán)境干擾光后由第二聚光鏡(18)會(huì)聚進(jìn)入光譜儀(19)，由此光譜探測的信噪比得到大幅提高；

圖6是結(jié)合改進(jìn)光譜探測方法的透射式差動(dòng)共焦cars顯微測試方法示意圖；選用一個(gè)單波長脈沖激光器(2)作為泵浦光源和探測光源，由它發(fā)出泵浦光(探測光)，然后選用一個(gè)頻率與之一致的超連續(xù)譜脈沖激光器(3)作為斯托克斯光源，在經(jīng)過帶通濾光片(4)后得到要求波長范圍內(nèi)的連續(xù)譜激光，通過調(diào)節(jié)光學(xué)結(jié)構(gòu)，使兩束激光通過二向色鏡(5)時(shí)間一致，空間重合；混合后的光束進(jìn)入光譜激發(fā)單元(6)，經(jīng)第一反射鏡(7)反射透過顯微物鏡(9)會(huì)聚在被測樣品(11)上，激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品光譜信息的cars光；瑞利光和cars光被顯微物鏡(12)收集，其中cars光透過二向色鏡(13)進(jìn)入光譜探測單元(14)進(jìn)行光譜探測，獲得光譜信息，瑞利光被二向色鏡(13)反射進(jìn)入差動(dòng)共焦探測單元(20)進(jìn)行幾何位置探測，獲得幾何位置信息。

如圖7所示，是測量多層透明樣品的差動(dòng)共焦曲線示意圖，圖顯示的是測量雙層樣品時(shí)的物鏡定焦情況、焦斑大小變換及最終的差動(dòng)共焦曲線(30)和光譜響應(yīng)曲線圖(31)；具體實(shí)現(xiàn)方式為，激發(fā)的瑞利光經(jīng)二向色鏡(13)反射進(jìn)入差動(dòng)共焦探測單元(20)，在差動(dòng)共焦探測單元(20)中，光束通過分光棱鏡(21)分成兩束，分別進(jìn)行焦前、焦后探測，其中一束光通過第三會(huì)聚鏡(22)后通過位于焦前的第二針孔(23)濾除雜散光后被第一光電探測器(24)探測，獲得前焦信號(hào)(28)，另一束光通過第四會(huì)聚鏡(25)后通過位于焦后的第三針孔(26)濾除雜散光后被第二光電探測器(27)探測，獲得后焦信號(hào)(29)，由于第二針孔與第三針孔離焦量相同，因此對前焦信號(hào)和后焦信號(hào)做差，得到的差動(dòng)共焦信號(hào)(30)中過零點(diǎn)位置(聚焦光斑最小)與顯微物鏡(9)焦點(diǎn)位置精確對應(yīng)；由此，可獲得被測樣品的幾何位置信息并實(shí)現(xiàn)對樣品測量面的精確定焦；精確定焦后，再結(jié)合光譜探測單元對cars光進(jìn)行cars光譜探測，結(jié)合幾何位置信息，可實(shí)現(xiàn)高空間分辨的光譜探測。

如圖8所示，若在激光發(fā)射單元(1)和光譜激發(fā)單元(7)之間添加光瞳濾波器(31)，可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光束，提高系統(tǒng)的空間分辨力，也可添加偏振片，產(chǎn)生偏振光束，提高激發(fā)光譜的信噪比。

如圖9所示，本發(fā)明不僅可以采用雙激光器進(jìn)行cars光譜激發(fā)，也可采用單激光器進(jìn)行超連續(xù)譜擴(kuò)展后進(jìn)行cars光譜激發(fā)。在激光發(fā)射單元(1)中，單波長脈沖激光器(2)發(fā)出單波長脈沖激光，經(jīng)偏振分光棱鏡(32)分光，一半光進(jìn)入光子晶體光纖(33)進(jìn)行超連續(xù)譜擴(kuò)展，另一半光經(jīng)過反射鏡(34)進(jìn)入光學(xué)延時(shí)器(35)進(jìn)行時(shí)域調(diào)整；產(chǎn)生的超連續(xù)光與單波長激光通過二向色鏡(5)混合(單波長激光包絡(luò)于超連續(xù)譜激光)，通過調(diào)整光學(xué)延時(shí)器，使兩束激光脈沖同步，由此實(shí)現(xiàn)空間重合、時(shí)間一致的cars光譜激發(fā)要求，通過高倍顯微物鏡(9)能夠?qū)Ρ粶y樣品(11)進(jìn)行cars光譜激發(fā)；

將圖9中光譜探測單元(14)中的光譜儀(19)替換成光電點(diǎn)探測器(38)，在偏振分光棱鏡(32)和光子晶體光纖(33)之間添加偏振片(37)，即構(gòu)成圖10；通過旋轉(zhuǎn)偏振片(37)，改變光束的偏振態(tài)，使光子晶體光纖(33)輸出的光束實(shí)現(xiàn)光譜掃描輸出，結(jié)合光學(xué)延時(shí)線(35)可以實(shí)現(xiàn)時(shí)域掃描cars光譜激發(fā)，進(jìn)而通過光電點(diǎn)探測器(38)實(shí)現(xiàn)寬譜帶的cars光譜探測。

如圖11所示，本發(fā)明激發(fā)cars光譜的方式不僅可以采用同向激發(fā)、反向探測的方式，還可以采用反向激發(fā)、反向探測的方式。單波長激光器(2)發(fā)出的單波長激光通過二向色鏡(5)反射通過第二顯微物鏡(12)會(huì)聚在被測樣品(11)上，而超連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出的連續(xù)譜激光通過反射鏡(7)反射進(jìn)入第一顯微物鏡(9)會(huì)聚在被測樣品(11)上；兩束光會(huì)聚在被測樣品(11)上的位置相同，保證兩束脈沖激光到達(dá)樣品位置時(shí)序一致，激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品(11)光譜特性的cars光，分別進(jìn)入光譜探測單元(14)和差動(dòng)共焦探測單元(20)進(jìn)行光譜探測和幾何位置探測。

實(shí)施例

在本實(shí)施例中，采用波長為780nm的飛秒脈沖激光器作為泵浦光源和探測光元，采用重復(fù)頻率與之一致的超連續(xù)譜皮秒脈沖激光器添加800～950nm的帶通濾光片作為斯托克斯光源，在滿足空間重合、時(shí)間一致的條件混合出射，通過光瞳濾波器獲得結(jié)構(gòu)光束后通過高倍顯微物鏡緊聚焦在樣品上，此時(shí)滿足相位匹配條件，激發(fā)出波長為780nm的瑞利光和波長范圍在600～760nm的反斯托克斯光(cars)。

如圖12所示，一種透射式差動(dòng)共焦cars顯微測試裝置由以下五個(gè)單元組成：激光發(fā)射單元(1)、光譜激發(fā)單元(6)、光譜探測單元(14)、差動(dòng)共焦探測單元(20)、計(jì)算機(jī)(40)組成；其中，激光發(fā)射單元(1)位于光譜激發(fā)單元(6)中的第一反射鏡(7)入射方向，光譜探測單元(14)位于光譜激發(fā)單元(6)中的二向色鏡(13)的透射方向，差動(dòng)共焦探測單元位于二向色鏡(13)的反射方向；計(jì)算機(jī)(40)負(fù)責(zé)光譜激發(fā)單元(6)中顯微物鏡的切換、z向平移臺(tái)(8)與x-y平移臺(tái)(10)的高精度移動(dòng)，光譜探測單元(14)和差動(dòng)共焦探測單元(20)獲得的數(shù)據(jù)處理與融合。

其測試步驟如下：

a)在激光發(fā)射單元(1)中，單波長激光器(2)發(fā)出780nm的單波長脈沖激光，作為泵浦光和探測光λ0，超連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出400～2100nm譜段超連續(xù)譜脈沖激光，經(jīng)過帶通濾光片(4)后得到范圍為800～950nm的連續(xù)譜激光，作為斯托克斯光λs；兩束激光通過二向色鏡(5)混合出射，通過調(diào)整光路，使兩束激光出射時(shí)空間一致(單波長激光包絡(luò)于連續(xù)譜激光)；

b)混合后的激光經(jīng)過光瞳濾波器(39)獲得結(jié)構(gòu)光束，進(jìn)入光譜激發(fā)單元(6)，進(jìn)行cars光譜激發(fā)；

c)在光譜激發(fā)單元(6)中，混合后的激光λ0+λs經(jīng)第一反射鏡(7)反射通過顯微物鏡(9)緊聚焦在被測樣品(11)上，激發(fā)出瑞利光λ0和載有被測樣品(11)光譜特性的cars光λas，由規(guī)格與顯微物鏡(9)一致的顯微物鏡(12)收集；其中，瑞利光λ0經(jīng)二向色鏡(13)反射進(jìn)入差動(dòng)共焦探測單元(20)進(jìn)行幾何位置探測，cars光λas經(jīng)二向色鏡(13)透射進(jìn)入光譜探測單元(14)進(jìn)行cars光譜探測。

d)在差動(dòng)共焦探測單元(20)中，瑞利光λ0先經(jīng)過一個(gè)半反半透分光棱鏡(21)分光，一半光通過第三聚光鏡(22)會(huì)聚通過位于焦前的針孔(23)，最終被第一光電探測器(24)所探測，得到前焦信號(hào)ia(v,u0+um)；另一半光通過第四聚光鏡(25)會(huì)聚通過位于焦后的針孔(26)，最終被第二光電探測器(27)所探測，得到后焦信號(hào)ib(v,u0-um)。差動(dòng)相減模塊(39)是一個(gè)減法電路，能夠?qū)⑶敖剐盘?hào)與后焦信號(hào)做差，獲得差動(dòng)信號(hào):

i(v,u)＝ia(v,uo+um)-ib(v,uo-um)

其中，i(v,u)為激光差動(dòng)共焦響應(yīng)；v為軸向歸一化光學(xué)坐標(biāo)，um為針孔軸向偏移量。差動(dòng)共焦響應(yīng)曲線(30)的“零點(diǎn)位置”與激發(fā)光束的聚焦光斑最小值點(diǎn)精確對應(yīng)，通過響應(yīng)曲線(30)的“零點(diǎn)位置”獲得被測樣品(11)的z向信息，結(jié)合連接x-y平移臺(tái)(10)的位移傳感器反饋的位置信息重構(gòu)出被測樣品(11)的表面三維形貌i(x,y,z)。

e)計(jì)算機(jī)(40)控制z向平移臺(tái)(8)移動(dòng)使激光精確聚焦在被測樣品(11)上，激發(fā)出能正確表征被測樣品光譜特性的cars光譜i(λ)，由光譜探測單元(14)采集；在光譜探測單元(14)中，光束先通過帶通濾光片(15)(600～760nm)過濾掉非cars光，再通過第一針孔(17)過濾掉環(huán)境干擾光，由第二聚光鏡(18)會(huì)聚進(jìn)入光譜儀(19)進(jìn)行cars光譜探測，獲得cars光譜信息i(λ)，其中λ為被測樣品(11)受激發(fā)光所激發(fā)出cars光的波長。

f)由計(jì)算機(jī)(40)融合位置信息i(x,y,z)和光譜信息i(λ)，完成被測樣品(11)的三維重構(gòu)及光譜信息融合i(x,y,z,λ)。

若對接收瑞利光的差動(dòng)共焦探測單元(20)獲得的差動(dòng)共焦響應(yīng)曲線(30)進(jìn)行處理，通過其絕對零點(diǎn)精確捕獲激發(fā)光斑的焦點(diǎn)位置i(x,y,z)，系統(tǒng)可以進(jìn)行高空間分辨的三維尺度層析成像。

若對接收cars光的光譜探測單元(14)獲得的光譜響應(yīng)曲線i(λ)進(jìn)行處理時(shí)，系統(tǒng)可以進(jìn)行光譜探測。

若對接收cars光的光譜探測單元(14)獲得的光譜信號(hào)i(λ)和接收瑞利光的差動(dòng)共焦探測單元(18)獲得的幾何位置信息i(x,y,z)同時(shí)進(jìn)行處理時(shí)，系統(tǒng)可以進(jìn)行高空間分辨的微區(qū)圖譜層析成像i(x,y,z,λ)，即實(shí)現(xiàn)被測樣品(11)的幾何位置信息和光譜信息的高空間分辨的“圖譜合一”成像與探測。

以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作了說明，但這些說明不能被理解為限制了本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附的權(quán)利要求書限定，任何在本發(fā)明權(quán)利要求基礎(chǔ)上進(jìn)行的改動(dòng)都是本發(fā)明的保護(hù)范圍。