一種特異性識別及靈敏檢測人血清蛋白的熒光試劑合成方法及應用與流程

發(fā)明涉及到一種熒光探針法測定人血清蛋白濃度及識別其與牛血清蛋白的方法，屬于生物大分子含量及結(jié)構(gòu)研究領域。

背景技術：

在臨床診斷中，尿液中人血清蛋白的識別鑒定是腎臟疾病的早期信號，并且人血清中蛋白含量的不足也能預示提示肝功能的衰竭。除此之外，在生物化學或藥理學應用領域，低成本的牛血清白蛋白(BSA)被廣泛用來替代人血清白蛋白(HSA)。然而，牛血清白蛋白只有75.8％的生物功能與人血清白蛋白相似，是不能代替人血清蛋白去替換流體并幫助手術患者修復血容量的。因此，在治療過程中區(qū)分人血清蛋白和牛血清蛋白，同時實現(xiàn)對蛋白含量的定量檢測就顯得尤為重要。目前，針對白蛋白檢測的免疫化學方法層出不窮，但多數(shù)由于程序較為復雜且試劑和儀器較昂貴，不利于日常檢測。而隨著科學技術的發(fā)展，操作簡單，靈敏度高且無破壞性的非共價熒光探針技術受到了廣泛關注。

本文報道了一個合成簡單，成本低廉的熒光探針，DB-15C5。DB-15C5具有典型的扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移特征，因此在生理緩沖體系(PBS緩沖液)中幾乎沒有熒光，若一旦進入到HSA或者BSA結(jié)構(gòu)中，就會發(fā)出綠色熒光，而對比其他幾種蛋白并沒有明顯現(xiàn)象。DB-15C5與HSA結(jié)合后的熒光強度遠遠高于與BSA結(jié)合的熒光強度，紫外燈下照射就可以看出其區(qū)別，可以實現(xiàn)快速鑒別人血清蛋白和牛血清蛋白。熒光強度與HSA濃度之間存在很好的劑量關系，可以作為一種靈敏的HSA識別探針試劑，定量測定生理緩沖液以及人工尿液中血清蛋白的含量。探針試劑的濃度50μM，能對5μM的人血清蛋白進行識別。生理緩沖液中定量檢測人血清蛋白范圍0-5.6μM，最低檢測限0.112mg/L；人工尿液中范圍0.0-1.2μM，最低檢測限1.95mg/L。此類方法較為直觀，具有操作簡單，靈敏度高和成本低廉等特點，值得推廣。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單，靈敏度高和成本低廉的熒光探針法測定人血清蛋白濃度及鑒別其與牛血清蛋白。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

(1)合成熒光探針試劑DB-15C5：稱量二苯氨基-4-苯甲醛0.27g(1mmol)，加入50毫升三頸瓶中，溫度設定為85℃，加入無水乙醇，加熱回流至剛好全溶。稱量4-氨基苯并-15-冠-5-醚0.28g(1mmol)，加入無水乙醇溶解，緩慢滴加到醛溶液中，冷凝回流4h，反應完成后靜置過夜，析出黃綠色晶體，過濾，真空干燥得到產(chǎn)物DB-15C5。

(2)熒光識別HSA測定方法：取DB-15C5母液10μL于石英熒光比色皿中，再加入1mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.4)，得到5.0×10^-5mol/L的待測液。加入蛋白儲備液200μL，在熒光分光光度計上設置360nm為激發(fā)波長，磷酸鹽緩沖液體系激發(fā)和發(fā)射狹縫調(diào)為2.5，5nm，人工尿液體系均為2.5nm。得到DB-15C5在不同蛋白存在時的熒光光譜。

(3)定量測定HSA含量：通過DB-15C5在不同濃度HSA存在時的熒光光譜，固定發(fā)射波長500nm，讀取熒光強度，以熒光強度(I)對HSA濃度(C_HSA)作圖，建立得到標準曲線。測定DB-15C5在未知樣品中的熒光強度，通過標準曲線得到HSA含量。

所述熒光試劑DB-15C5的結(jié)構(gòu)以核磁共振(NMR)譜以及質(zhì)譜(MS)鑒定：¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ8.637(s,1H),7.720(d,J＝8.8Hz,2H),7.319(m,4H),7.154(m,8H),6.890(m,3H),4.191(m,4H),3.937(t,J＝4.8Hz,4H),3.772(s,8H).¹³C NMR(CDCl₃,100MHz):δ158.144,150.535,149.499,147.322,146.944,146.285,129.667,129.560,129.438,125.356,123.926,121.615,114.579,112.566,107.789,71.066,71.022,70.526,70.417,69.658,69.517,69.444,68.759.HRMScalcd for C₃₃H₃₄N₂O₅[M+Na]⁺561.2665,found 561.2665，產(chǎn)率33.4％，產(chǎn)品純度95％以上。

所述的熒光測定時溶液配制緩沖液所用水均為二次蒸餾水或更高純度的水。

所述的緩沖液為由NaCl 8g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄ 1.44g(如果是Na₂HPO₄·12H₂O，則3.63g)溶于1000mL水中配制而成。

所述的人工尿液由尿素1.02068g,乳酸0.0099088g,檸檬酸0.042028g,碳酸氫鈉0.210025g,氯化鈣0.027745g,氯化鈉0.52596g,七水硫酸鎂0.049294g,硫酸鈉0.14204g,磷酸二氫鉀0.095263g,磷酸氫二鉀0.159754g,氯化銨0.133725g溶于100ml蒸餾水并調(diào)節(jié)pH為6.0配制而成。

根據(jù)權利要求1所述的DB-15C5溶液配制采用1％(v％)乙醇助溶。

所述的熒光光譜需要在熒光分光光度計上測試得到。

本發(fā)明將用于熒光鑒別HSA與其他蛋白，尤其是HSA與BSA，并可以定量檢測HSA。

DB-15C5在生理緩沖液中的熒光強度非常微弱，一旦進入到HSA結(jié)構(gòu)中，就會發(fā)出綠色熒光，而對比其他幾種蛋白并沒有明顯現(xiàn)象。DB-15C5與HSA結(jié)合后的熒光強度遠遠高于與BSA結(jié)合的熒光強度，紫外燈下照射就可以看出其區(qū)別，可以實現(xiàn)快速鑒別人血清蛋白和牛血清蛋白。熒光強度與HSA濃度之間存在很好的劑量關系，可以作為一種靈敏的HSA識別探針試劑，定量檢測HSA含量。此類鑒別方法較為直觀，具有操作簡單，靈敏度高和成本低廉等特點，值得推廣。

附圖說明

圖1為檢測試劑DB-15C5的合成路線。

圖2為熒光試劑DB-15C5(50μM)在人工尿液中(左)、加入HSA(10μM)(中)、加入BSA(10μM)(右)體系中的熒光圖。

圖3為熒光試劑在PBS體系中對不同蛋白的熒光響應圖譜(A)及在不同蛋白中的熒光強度(B)。

圖4為PBS體系中DB-15C5在不同濃度HSA存在時的熒光光譜及標準曲線。

圖5為熒光試劑在人工尿液中對不同蛋白的熒光響應圖譜(A)及在不同蛋白中的熒光強度(B)。

圖6為人工尿液體系中DB-15C5在不同濃度HSA存在時的熒光光譜及標準曲線。

圖7為不同pH中，DB-15C5(50μM)和DB-15C5+HSA(5μM)的熒光強度。

圖8為分子對接計算得到的DB-15C5與HSA結(jié)合能最低時的結(jié)合模式。

具體實施方式

下述試驗和實例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。

(1)在PBS介質(zhì)中，DB-15C5用于鑒別HSA和BSA，方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10^-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同時，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩沖液配制成1.0×10^-4mol/L溶液備用。

取DB-15C5母液10μL于石英熒光比色皿中，再加入1mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.4)，得到5.0×10^-5mol/L的待測液。加入蛋白儲備液200μL，在熒光分光光度計上設置360nm為激發(fā)波長。激發(fā)和發(fā)射狹縫調(diào)為2.5，5nm。在370～700nm范圍進行掃描，得到DB-15C5在不同蛋白存在時的熒光光譜(圖3)。

DB-15C5由于TICT性質(zhì)，在PBS體系中幾乎沒有熒光，但是5μM的HSA的加入，可以迅速點亮化合物熒光，熒光強度增加了接近32倍，靈敏度較高。相比之下，DB-15C5在BSA體系中，熒光強度僅為前者的1/6，可以明顯區(qū)分HSA與BSA。

(2)PBS介質(zhì)中DB-15C5定量測定HSA含量，其方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10^-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同時，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩沖液配制成1.0×10^-4mol/L溶液備用。

取1.0×10^-4mol/L DB-15C5溶液40μL加入石英熒光比色皿中，加入960μL磷酸鹽緩沖液混合均勻，依次加入HSA溶液(0～8.0μM)，在熒光分光光度計上設置360nm為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射狹縫調(diào)為5nm，10nm，在370～700nm范圍進行掃描，得到DB-15C5在不同濃度HSA存在時的熒光光譜(圖4)。

讀取DB-15C5在不同濃度HSA存在時、發(fā)射波長500nm的熒光強度，以熒光強度(I)對HSA濃度(C_HSA)作圖，建立得到標準曲線(I＝191.6047+1152.3207C_HSA,R²＝0.9955)。線性范圍0.0to 5.6μM，檢測限1.7nM(0.112mg/L)。測定DB-15C5在樣品中的熒光強度，通過標準曲線得到HSA含量。

(4)人工尿液介質(zhì)中DB-15C5定量測定HSA含量，其方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10^-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同時，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩沖液配制成1.0×10^-4mol/L溶液備用。

取DB-15C5母液10μL于石英熒光比色皿中，再加入1mL人工尿液(pH 6.0)，得到5.0×10-5mol/L的待測液。加入蛋白儲備液200μL，在熒光分光光度計上設置360nm為激發(fā)波長。激發(fā)和發(fā)射狹縫調(diào)均為2.5nm。在370～700nm范圍進行掃描，得到DB-15C5在不同蛋白存在時的熒光光譜(圖5)。

DB-15C5由于TICT性質(zhì)，在尿液中幾乎沒有熒光，但是5μM的HSA的加入，可以迅速點亮化合物熒光，熒光強度增加了接近32倍，靈敏度較高。除此之外，DB-15C5也有較好的選擇性，我們一共測試了八種蛋白的熒光響應圖譜，發(fā)現(xiàn)HSA，BSA，酪蛋白能夠點亮化合物熒光，但是在HSA中熒光明顯比后兩者強。說明DB-15C5可以實現(xiàn)人工尿液中的HSA識別。

(5)人工尿液中DB-15C5定量測定HSA含量，其方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10^-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同時，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩沖液配制成1.0×10^-4mol/L溶液備用。

取1.0×10^-4mol/L DB-15C5溶液40μL加入石英熒光比色皿中，加入960μL人工尿液混合均勻，依次加入HSA溶液(0.0–1.2μM)，在熒光分光光度計上設置360nm為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射狹縫調(diào)為5，10nm，在370～700nm范圍進行掃描，得到DB-15C5在不同濃度HSA存在時的熒光光譜(圖6)。

讀取DB-15C5在不同濃度HSA存在時、發(fā)射波長500nm的熒光強度，以熒光強度(I)對HSA濃度(C_HSA)作圖，建立得到標準曲線(I＝1166.0110+1845.8791C_HSA,R²＝0.9954)，檢測限：29.5nM(1.95mg L^-1)。測定DB-15C5在樣品中的熒光強度，通過標準曲線得到HSA含量，將計算得到的含量值與實際加入值相比較，得到回收率(表1)，判斷方法可行。

表1.標準加入法測定結(jié)果

(4)pH對檢測體系影響小

檢測體系較為穩(wěn)定。由圖7看出，在不同pH條件下，體系的熒光強度值變化不大，尤其是在pH 6-10之間，體系熒光強度穩(wěn)定，因此，在生理環(huán)境及產(chǎn)生異樣的情況下，HSA含量檢測不受影響。

(5)DB-15C5對HSA產(chǎn)生特異性識別的工作原理

借助分子對接理論模擬，得出DB-15C5與HSA產(chǎn)生結(jié)合的位點。如圖8所示，DB-15C5可以進入到HSA位于subdomains IIA(Sudlow site I)和IIIA(Sudlow site II)的α-螺旋區(qū)域，結(jié)合自由能達到-10.47kcal/mol。結(jié)合中冠醚基團與組氨酸His242殘基之間有氫鍵作用力表明冠醚基團在識別過程中發(fā)揮重要作用。