專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物的方法及其專(zhuān)用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物的方法及其專(zhuān)用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
：紅霉素類(lèi)化合物屬大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，主要用于抗畜禽細(xì)菌及支原體感染，亦可作豬的飼料添加劑以促進(jìn)增重和提高飼料轉(zhuǎn)換率。但是紅霉素類(lèi)化合物能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一些副作用，如胃腸道反應(yīng)、膽汁郁積性黃疸以及靜滴時(shí)引起靜脈炎等，還能引起壞死性肝病、精神障礙和關(guān)節(jié)炎綜合征等，因此，紅霉素類(lèi)化合物在畜禽生產(chǎn)上的大量應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致其在畜禽產(chǎn)品中殘留，危害公眾健康。目前農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件中已規(guī)定，該藥物的最高殘留限量為20(Hig/kg。檢測(cè)紅霉素殘留量的化學(xué)方法主要為氣相色譜法、氣相色譜一質(zhì)譜法等儀器方法，由于儀器設(shè)備的復(fù)雜和操作過(guò)程的繁瑣，儀器方法不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩査。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括紅霉素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為紅霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)紅霉素半抗原；當(dāng)所述包被原為紅霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)紅霉素半抗原；所述紅霉素特異性抗體為紅霉素的單克隆抗體或紅霉素的多克隆抗體；所述紅霉素類(lèi)化合物為紅霉素、硫氫酸紅霉素和琥乙紅霉素中的至少一種；所述紅霉素為紅霉素A。為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還可包括紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色液、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液。所述濃縮洗滌液可以為含有1.0%-1.5%吐溫-20、0.001-0.004%疊氮化鈉防腐劑、pH值為7.0-7.4、0.02-0.05M的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液可以為含有4-6%牛血清白蛋白、pH值為7.2-7.6、0.01-0.03M的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量；所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液可以為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色液B液可以為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液可以為l2mol/L硫酸或鹽酸溶液。所述濃縮洗滌液具體可以為含有1.25%吐溫-20、0.003%疊氮化鈉防腐劑、pH值為7.4、0.05M的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液具體可以為含有5%牛血清白蛋白、pH值為7.4、0.02M的磷酸鹽緩沖液；所述包被緩沖液具體可以為pH值為9.4的0.lmol/L的碳酸鹽沖液；所述封閉液是含有0.5%人血清白蛋白、0.15%吐溫-20和O.1X維生素C的pH值為9.0的0.02M的硼酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量；所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液具體可以為過(guò)氧化脲，顯色液B液具體可以為四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液具體可以為2mol/L鹽酸溶液。在洗滌液中加入一定量吐溫20和疊氮化鈉的作用在于緩沖液中吐溫20會(huì)減少抗體的非特異性吸附，還能對(duì)蛋白起到一定的保護(hù)作用，加入疊氮化鈉后，則疊氮鈉在溶液中抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)溶液的穩(wěn)定性其到一個(gè)保護(hù)作用。所述紅霉素半抗原可以按照如下方法得到將紅霉素溶于無(wú)水乙醇中，與鹽酸羥胺水溶液混合，0X:條件下反應(yīng)2.5小時(shí)，過(guò)濾，收集沉淀；將所述沉淀溶于二甲基甲酰胺水溶液中，加入琥珀酸酐，室溫反應(yīng)2h;得到紅霉素半抗原。所述紅霉素特異性抗體是用所述紅霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白為甲狀腺蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、血藍(lán)蛋白、纖維蛋白原或卵清蛋白。紅霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明采用碳化二亞胺法將紅霉素與載體蛋白偶聯(lián)，突出了紅霉素的特征結(jié)構(gòu)，同時(shí)也增加了紅霉素半抗原的免疫源性和特異性。其中，紅霉素半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過(guò)低或過(guò)高都對(duì)免疫不利，半抗原與載體蛋白(如血藍(lán)蛋白)的結(jié)合摩爾比為(10-12):1。所述紅霉素多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體。所述紅霉素單克隆抗體為由保藏號(hào)為CGMCCNo.2542的對(duì)紅霉素藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-l-3分泌的抗體。所述酶標(biāo)抗抗體是采用過(guò)碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的；所述過(guò)碘酸鈉方法中，所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2:1;所述標(biāo)記酶為堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶，優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶。該改良的過(guò)碘酸鈉法省略了封閉酶上氨基的步驟，節(jié)省了時(shí)間，又降低了辣根過(guò)氧化物酶(服P)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物的方法，包括以下步驟-1)樣品前處理每2.0g動(dòng)物組織勻漿物中，加入6-10ml乙腈，混勻，3000g以上室溫離心10min，收集上清液；將每2ml所述上清液吹干，加入權(quán)利要求7所述試劑盒中的濃縮復(fù)溶液l-4ml，混勻，取樣進(jìn)行分析；所述乙腈的體積優(yōu)選為8ml;所述濃縮復(fù)溶液的體積優(yōu)選為2ml。樣品的前處理主要是為了從樣品中獲得紅霉素溶液，從而用于后續(xù)的檢測(cè)。2)用上述任一種酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)1)中所述樣品。3)分析檢測(cè)結(jié)果。由保藏號(hào)為CGMCCNo.2542的對(duì)紅霉素藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-3分泌的紅霉素單克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。保藏號(hào)為CGMCCNo.2542的紅霉素藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-3也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)樣品中紅霉素類(lèi)化合物的殘留量；本試劑盒對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批量樣品；本試劑盒采用高特異性的紅霉素單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，能夠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本的定性和定量篩查，將在紅霉素的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的步驟，縮短了檢測(cè)的時(shí)間，具有可觀的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>圖l為以紅霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中所使用的紅霉素藥物如無(wú)特殊說(shuō)明均為紅霉素A。實(shí)施例1、以紅霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原的試劑盒及其檢測(cè)方法一、以紅霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的檢測(cè)原理如下當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被紅霉素偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，隨即加入酶標(biāo)二抗，再加入紅霉素特異性抗體溶液，樣本中殘留的紅霉素藥物與酶標(biāo)板上包被的紅霉素偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)紅霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與紅霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中紅霉素的殘留量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中紅霉素殘留量的濃度范圍。二、以紅霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒一般可以包括如下組成1、包被有包被原(包被原為紅霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物)的酶標(biāo)板包被原的濃度可以為0.05-0.1Ug/ml;2、酶標(biāo)抗抗體工作液用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；酶標(biāo)二抗的稀釋液為含有0.5。/。牛血清白蛋白的pH值為7.2-7.6、0.02M磷酸鹽緩沖液，酶標(biāo)抗抗體工作液稀釋度為1:500，所述百分含量為質(zhì)量百分含量。3、紅霉素特異性抗體工作液可以為紅霉素多克隆抗體或紅霉素單克隆抗體工作液；4、紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品(上海安普，貨號(hào)114-07-8)溶液6瓶，濃度分別為Ol^g/L,0.2Pg/L，0.6Pg/L，1.8Mg/L，5.扭g/L,16.2Pg/L，稀釋溶液為含有5%牛血清白蛋白、pH值為7.4、0.02M的磷酸鹽緩沖液。5、底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲或過(guò)氧化氫，7ml/瓶，l瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺，7ml/瓶，1瓶。6、終止液l-2mol/L鹽酸或硫酸；7、濃縮洗滌液含有1.0%-1.5%(質(zhì)量百分含量)吐溫20和0.01-0.04%。疊氮化鈉防腐劑，pH值為7.0-7.4、0.02-0.05M的磷酸鹽緩沖液；40ral/瓶，1瓶。8、濃縮復(fù)溶液含有4-6%(質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白、pH值為7.2-7.6、0.02-0.05M的磷酸鹽緩沖液；200ml/瓶，1瓶。三、本實(shí)驗(yàn)中以紅霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒具體包括1、包被有包被原(包被原為紅霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物)的酶標(biāo)板；2、酶標(biāo)抗抗體工作液用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；酶標(biāo)二抗的稀釋液為含有0.5。/。牛血清白蛋白的pH值為7.2-7.6、0.02M磷酸鹽緩沖液，酶標(biāo)抗抗體工作液稀釋度為1:500，所述百分含量為質(zhì)量百分含量。3、紅霉素單克隆抗體工作液是按照以下方法制備的用稀釋液將紅霉素單克隆抗體稀釋1000倍，得到單抗工作液，所述稀釋液為含有2.5%(質(zhì)量百分含量)酪蛋白和0.03%。(質(zhì)量含量)的疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液。4、紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品(上海安普，貨號(hào)114-07-8)溶液6瓶，濃度分別為OPg/L，0.2Pg/L，0.6Pg/L，1,g/L，5.4Pg/L,16.2Pg/L，稀釋溶液為含有5%牛血清白蛋白、pH值為7.4、0.02M的磷酸鹽緩沖液。5、底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲，7ml/瓶，1瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺，7ml/瓶，1瓶。6、終止液2mol/L鹽酸;7、濃縮洗滌液含有1.25%(質(zhì)量百分含量)吐溫20和0.03%。疊氮化鈉防腐劑、pH值為7.4、0.05M的磷酸鹽緩沖液；40ml/瓶，1瓶。8、濃縮復(fù)溶液含有5%牛血清白蛋白、pH值為7.4、0.02M的磷酸鹽緩沖液；200ral/瓶，l瓶。其中，包被有紅霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板、紅霉素單克隆抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液的制備方法如下所用的包被緩沖液和封閉液如下包被緩沖液pH值為9.4的0.lmol/L的碳酸鹽沖液。封閉液含有0.5%人血清白蛋白、0.15%吐溫-20和0.1X維生素C的pH值為9.0的0.02M的硼酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。1、包被有紅霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板的制備(1)紅霉素半抗原的制備稱(chēng)取20rag紅霉素(上海安普，貨號(hào)114-07-8)溶于2.5ml無(wú)水乙醇，與溶于lml雙蒸水的5mg鹽酸羥胺混合，在冰浴條件下反應(yīng)2.5h，其間滴入0.05mol/L的NaOH溶液約lml。反應(yīng)后滴入0.2mol/L、pH4的醋酸鹽緩沖液約lml，并加入碎冰約4mg，出現(xiàn)白色沉淀，在4t:下靜置l天。將反應(yīng)液離心10min，棄去上清液，收集白色沉淀。白色沉淀用2.5ml二甲基甲酰胺溶解后，加入6mg琥珀酸酐，室溫反應(yīng)2h。得到紅霉素半抗原。(2)包被原的制備將紅霉素半抗原和卵清蛋白采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原，具體步驟如下取紅霉素半抗原1.3ml，冷卻至1(TC，加入氯甲酸異丁酯5ul，l(TC攪拌反應(yīng)30min，得到反應(yīng)液I液；稱(chēng)取卵清蛋白36nig溶解在2mL50mmol/L碳酸鈉溶液中得II液，其中紅霉素半抗原與所述卵清蛋白的摩爾配比為60:1;將反應(yīng)液I逐滴緩慢滴加到反應(yīng)液n液中，10。C反應(yīng)4h，然后4。C過(guò)夜，得到包被原。(3)包被有包被原的酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將紅霉素半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物稀釋成0.05-0.1iig/ml，每孔加入100ul，37T:溫育2h或4'C過(guò)夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200(^1封閉液，37'C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。2、紅霉素單克隆抗體的制備(1)免疫原的制備紅霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性，這樣突出了紅霉素分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)，使制備的紅霉素抗體對(duì)紅霉素的特異性很高。將紅霉素半抗原和血藍(lán)蛋白，采用碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原，具體步驟如下稱(chēng)取60mg血藍(lán)蛋白溶于10ml0.01raol/L的磷酸鹽溶液中，加入12.5mgEDC，然后加入紅霉素半抗原1.3ml，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)lh，再加6mg碳化二亞胺(EDC)，暗處攪拌反應(yīng)并過(guò)夜，即可得到紅霉素免疫原。其中，紅霉素半抗原與血藍(lán)蛋白的摩爾配比為11:1。(2)制備單抗a.動(dòng)物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100ug/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體。b.細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按8:1(數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌紅霉素單克隆抗體的對(duì)紅霉素藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，將此細(xì)胞株命名為B-l-3，該細(xì)胞株已于2008年06月04日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2542。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成lX109個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37'C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.9ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5X109個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入-2(TC環(huán)境保存。3、紅霉素多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以紅霉素與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.5mg/kg體重，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔34周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫IO天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，用硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。4、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備(1)抗抗體的制備羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。羊抗兔抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。(2)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備將抗抗體與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)采用改良后的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過(guò)碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4:1;由于辣根過(guò)氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，這樣活化的辣根過(guò)氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體。本發(fā)明采用改良的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行抗體的標(biāo)記，其操作省去了氨基的封閉過(guò)程，因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。降低了辣根過(guò)氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2:1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡(jiǎn)便，對(duì)酶的活性的損失減少。四、用步驟三所述試劑盒檢測(cè)樣品中殘留的紅霉素1、組織(肌肉、肝臟)樣品前處理稱(chēng)取2.0士0.05g均質(zhì)物，加入8ml乙腈，振蕩10min，3000g以上室溫離心10min，取上清液2ml，將其置于10ml干凈的玻璃試管中，于506(TC水浴氮?dú)饬飨麓蹈?，?ml復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物，取50pl用于分析。2、檢測(cè)向包被有紅霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板微孔中加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50W，隨即加入酶標(biāo)二抗工作液50W，再加入單克隆抗體工作液50W，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，37"C避光環(huán)境中反應(yīng)40min。倒出孔中液體，每孔加入稀釋后的洗滌液，10s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液A液過(guò)氧化脲50W，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)50W，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，37t:避光環(huán)境中反應(yīng)15min。每孔加入終止液50W，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定在450nm處，測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。3、檢測(cè)結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B。)再乘以100%，得到百分吸光度值。百分吸光度值(％)=-^-xl0()%B0公式中B為標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B。為OPg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均吸光度值。以紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(網(wǎng)/L)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖l)。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中紅霉素的殘留量。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專(zhuān)業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需1.0小時(shí)可以完成。實(shí)施例2、試劑盒精確度、準(zhǔn)確度和保存期試驗(yàn)一、標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)從實(shí)施例l中步驟三中三個(gè)不同的時(shí)間段制備的三個(gè)不同批次的試劑盒中各抽取10個(gè)試劑盒，從每個(gè)試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定1.8pg/L紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果如表l所示。表l、標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)(CV%)12345678910cv%01批6.99.63.54.85.07.44.411.36.97.403批8.59.76.910.54.89.15.86.78.79.106批9.04.54.13.87.48.56.95.512.67.0實(shí)驗(yàn)表明，每批試劑盒各測(cè)定10次標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)均在3.5%-12.6%之間，符合精密度小于或等于20%的規(guī)定。二、樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)(一)樣品精密度試驗(yàn)向不含紅霉素的雞肉、雞肝、豬肉或豬肝中添加終濃度為4(Hig/L的紅霉素，然后按照實(shí)施例l的方法進(jìn)行樣品前處理。從實(shí)施例l中步驟三中所述的不同時(shí)間段制備的三個(gè)批次的試劑盒(Ol批、03、06批)中各抽取3個(gè)試劑盒，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果如表2-5所示(各表中的數(shù)值為5次重復(fù)的平均值)。結(jié)果表明，豬肉、豬肝、雞肉、雞肝樣本中的變異系數(shù)在5.4%-15.4%之間，均低于20%，符合規(guī)定。表2、豬肉可重復(fù)性試驗(yàn)批號(hào)實(shí)測(cè)值(嗎/L)CV%31.239.829.936.538.412.50138.428.833.829.129.613.036.332.831.829.728.69.428.731.630.927.830.75.40331.533.730.239.137.411.030.536.531.732.829.78.20629.834.334.728.729.69.11238.634.739.934.730.910.031.633.729.634.130.46.2表3、豬肝樣品可重復(fù)性試驗(yàn)批號(hào)實(shí)測(cè)值(嗎/kg)變異系數(shù)CV0/o34.928.937.229.530.311.4012728.929.534.733.710.734.428.730.433.631.97.329.628.826.337.730.614.00331.531.728.536.933.79.532.429.837.028.231.510.528.529.631.536.629.610.40633.731.534.736.928.49.829.830,633.839.433.211,3表4、雞肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)批號(hào)實(shí)測(cè)值(Mg/kg)變異系數(shù)CV%30.529.531.628.539.714.00136.528.731.535.227.412.433.635.632.926.738.112.736.735.632.931.931.37.00336.429.631.427.530.710.635.637.530.734.730.98.834.836.929.830.431.19.50636.927.635.633.938.712.331.439.428.529.829.014.2表5、雞肝樣品可重復(fù)性試驗(yàn)實(shí)測(cè)值(ng/kg)變異系數(shù)批號(hào)CV%29.635.633.536.731.88.60128.529.637.232.635.711.536.629.339.627.737.215.437.231.236.634.735.76.7032631.130.429.335.210.931.529.628.536.929.111.038.533.631.528.829.811.90631.729.528.829.334.77.930.428.628.933.629.66.7(二)樣本準(zhǔn)確度試驗(yàn)向不含紅霉素的雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚(yú)或蝦組織中分別添加紅霉素，使紅霉素的終濃度分別為4(Hig/kg(L)禾卩80)ig/kg(L)，然后按照實(shí)施例l中所述的樣品前處理方法進(jìn)行處理；再用實(shí)施例l中步驟三中所述的試劑盒檢測(cè)組織中的紅霉素，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度(準(zhǔn)確度=實(shí)測(cè)值/添加值)。結(jié)果如表6所示。結(jié)果表明豬肉、雞肉、豬肝、雞肝樣品添加準(zhǔn)確度均在70.9%-98.7%之間。表6、試劑盒的準(zhǔn)確度<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>三、交叉反應(yīng)率試驗(yàn):選擇與紅霉素有類(lèi)似結(jié)構(gòu)和類(lèi)似功能的6種藥物測(cè)定交叉反應(yīng)率。通各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計(jì)算步驟三中試劑盒對(duì)其它藥物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)越大，那么此試劑盒對(duì)紅霉素的檢測(cè)的特異性就越好。重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。交叉反應(yīng)率(％)=(引起50%抑制紅霉素的濃度/引起50%抑制的紅霉素類(lèi)似物濃度)x100%表7、試劑盒的特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明試劑盒對(duì)紅霉素A、硫氫酸紅霉素和琥乙紅霉素的特異性好，即本發(fā)明試劑盒可以檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物。四、試劑盒保存期試驗(yàn)試劑盒保存條件為2-8'C，經(jīng)過(guò)6個(gè)月的測(cè)定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50%抑制濃度、紅霉素添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮在運(yùn)輸和使用過(guò)程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37'C保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8'C至少可以保存6個(gè)月以上。五、試劑盒的最低檢測(cè)限取不含紅霉素類(lèi)藥物的陰性動(dòng)物組織樣本用本發(fā)明所制試劑盒分別進(jìn)行20次檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為試劑盒的最低檢測(cè)限。表8、陰性組織樣本測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表pg/kg<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>測(cè)定值0.430.270.220.310.390.290.120.46樣品號(hào)測(cè)定值170.27180.21190.22200.02平均值0.26標(biāo)準(zhǔn)差0.13最低檢測(cè)限0.66由表8可知，試劑盒的最低檢測(cè)限為0.66pg/kg。權(quán)利要求1、一種檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括紅霉素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為紅霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)紅霉素半抗原；當(dāng)所述包被原為紅霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)紅霉素半抗原；所述紅霉素特異性抗體為紅霉素的單克隆抗體或紅霉素的多克隆抗體；所述紅霉素類(lèi)化合物為紅霉素、硫氫酸紅霉素和琥乙紅霉素中的至少一種；所述紅霉素為紅霉素A。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色液、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液；所述濃縮洗滌液為含有1.0%-1.5%吐溫-20、0.001-0.004%疊氮化鈉防腐劑、pH值為7.0-7,4、0.02-0.05M的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為含有4-6%牛血清白蛋白、pH值為7.2-7.6、0.01-0.03M的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量；所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為12mol/L硫酸或鹽酸溶液。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為含有1.25%吐溫-20、0.003%疊氮化鈉防腐劑、pH值為7.4、0.05M的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為含有5%牛血清白蛋白、pH值為7.4、0.02M的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量；所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過(guò)氧化脲，顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為2mol/L鹽酸溶液。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述紅霉素半抗原是按照如下方法得到的將紅霉素溶于無(wú)水乙醇中，與鹽酸羥胺水溶液混合，0'C條件下反應(yīng)2.5小時(shí)，過(guò)濾，收集沉淀；將所述沉淀溶于二甲基甲酰胺水溶液中，加入琥珀酸酐，室溫反應(yīng)2h，得到紅霉素半抗原。5、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述紅霉素特異性抗體是用所述紅霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白為甲狀腺蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、血藍(lán)蛋白、纖維蛋白原或卵清蛋白。6、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述紅霉素單克隆抗體為由保藏號(hào)為CGMCCNo.2542的對(duì)紅霉素藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-l-3分泌的抗體。7、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)抗抗體是采用過(guò)碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的；所述過(guò)碘酸鈉方法中，所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2:1;所述標(biāo)記酶為堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶，優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶。8、一種檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物的方法，包括以下步驟1)樣品前處理每2.0g動(dòng)物組織勻漿物中，加入6-10ml乙腈，混勻，3000g以上室溫離心10min，收集上清液；將每2ml所述上清液吹干，加入權(quán)利要求7所述試劑盒中的濃縮復(fù)溶液1-4ml，混勻，取樣進(jìn)行分析；所述乙腈的體積優(yōu)選為8ml;所述濃縮復(fù)溶液的體積優(yōu)選為2ml;2)利用權(quán)利要求1一7中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)1)中所述樣品。9、由保藏號(hào)為CGMCCNo.2542的對(duì)紅霉素藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-3分泌的紅霉素單克隆抗體。10、保藏號(hào)為CGMCCNo.2542的對(duì)紅霉素藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-l-3。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)紅霉素類(lèi)化合物的方法及其專(zhuān)用酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括紅霉素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述紅霉素特異性抗體為紅霉素的單克隆抗體或紅霉素的多克隆抗體；所述紅霉素類(lèi)化合物為紅霉素、硫氫酸紅霉素和琥乙紅霉素中的至少一種；所述紅霉素為紅霉素A。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，能夠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本的定性和定量篩查，將在紅霉素的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。文檔編號(hào)G01N33/577GK101299046SQ20081011575公開(kāi)日2008年11月5日申請(qǐng)日期2008年6月27日優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日發(fā)明者萬(wàn)宇平,何方洋,馮才偉,馮才茂,劉玉梅,汪善良,沈建忠,羅曉琴,趙正苗申請(qǐng)人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司;北京望爾生物技術(shù)有限公司