8.64Hz,4H),7.49(t,J = 7.84Hz,2H),7.33(t ,J = 7.4Hz,lH),7.22(d ,J = 8.4Hz,2H),7.17(d ,J = 8.56Hz,4H).
[0030] 1-十二烷基-4-甲基吡啶-1碘化物的合成
[0031] 將4-甲基吡啶（2mL，20mmol)和1-碘十二烷混合，以乙醇為溶劑，加熱回流。24小時(shí) 后反應(yīng)結(jié)束，真空蒸餾除去乙醇，得到粗產(chǎn)品。然后用乙醇沖洗3遍，石油醚沖洗三遍，得到 最終產(chǎn)物。
[0032] ΧΗ NMR(400MHz,DMS0-d6)：5(ppm)8.93(d,J = 6.4Hz,2H),7.99(d,J = 6.4Hz,2H), 4.52(t,J = 7.4Hz,2H),2.61(s,3H),1.89(q ,J = 7.2Hz,2H), 1.23( s,18H) ,0.85( t,J = 6.8Hz,3H).
[0033] N，N-二（（4-(2'-(4"-十二烷基)啦啶-4"碘化物）乙烯)苯基)苯胺的合成
[0034] 將N，N-二甲?；桨泛?-十二烷基-4-甲基吡啶-1碘化物混合，以乙醇為溶劑，哌 啶作為催化劑，回流反應(yīng)24小時(shí)后，固體析出，直接過濾得到粗產(chǎn)品。然后用乙醇沖洗3遍， 石油醚沖洗三遍，得到最終產(chǎn)物。
[0035] ΧΗ NMR(400MHz,DMS0-d6)：5(ppm)8.91(d,J = 6.8Hz,4H),8.20(d,J = 6.8Hz,4H), 8.01(d,J=16Hz,2H) ,4.47(t,J = 7.2Hz,4H) ,1.91(d,J = 6.4Hz,4H) ,1.27(d,J = 5.2Hz, 8H),1.24(s,28H),0.85(t ,J = 6.8Hz,6H).
[0036] 實(shí)施例2:永生化的癌細(xì)胞(HeLa和SiHa)和正常細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)
[0037] HeLa、SiHa、HUVEC細(xì)胞株均是在37°C，5%C02的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。HeLa和SiHa 細(xì)胞株在內(nèi)含1 〇 %胎牛血清和1 %雙抗的H-DMEM培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)。HUVEC細(xì)胞株于內(nèi)含 10 %胎牛血清和2ng/mL FGF-2M199培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)。等細(xì)胞生長到對(duì)數(shù)期，接片培養(yǎng):① 將蓋玻片于無水乙醇中浸泡30min，酒精燈烘干后放入一次性35mm培養(yǎng)皿中；②將100mL細(xì) 胞瓶中的細(xì)胞用PBS洗三遍，用lmL 0.25%胰酶消化3-5分鐘，小心地倒出培養(yǎng)基，加入少量 新鮮培養(yǎng)基吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，留下合適密度的細(xì)胞，將培養(yǎng)基加至所需體積(控制細(xì) 胞終濃度為1 X 1〇5)，接種至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中，放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞爬片生 長。
[0038]實(shí)施例3: T1染色HeLa細(xì)胞的雙光子熒光顯微實(shí)驗(yàn)
[0039] 將接好的細(xì)胞爬片用2μΜ T1染色，在C02培養(yǎng)箱中孵育20min。吸出培養(yǎng)液后用roS 洗三遍，將細(xì)胞爬片取出，細(xì)胞生長面朝下蓋在載玻片上，在雙光子熒光顯微鏡下進(jìn)行觀 察，發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜被T1均勻連續(xù)地著色。因此，本發(fā)明所述探針T1是一個(gè)雙光子的細(xì)胞膜探 針。
[0040] 結(jié)果見圖1(1)。用T1染色后在800nm激光輻照下得到的雙光子照片。其中a圖為雙 光子熒光照片;b圖為明場激光掃描的微分干涉照片;c圖為a、b的疊加圖。
[0041 ]實(shí)施例4: T1染色活細(xì)胞的證明實(shí)驗(yàn)及T1可與其他探針兼容性的實(shí)驗(yàn) [0042] S-11348為一種商業(yè)化的只染凋亡細(xì)胞或死細(xì)胞的核酸的熒光染料。將接種好的 細(xì)胞爬片用2μΜ T1進(jìn)行染色，在C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min。吸出培養(yǎng)液后，然后再用5μΜ的S-11348染色細(xì)胞，在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5min。然后用PBS洗三遍，將細(xì)胞爬片取出，細(xì)胞生長面 朝下蓋在載玻片上，在共聚焦顯微鏡(激發(fā)波長:488nm)分兩個(gè)通道分別收集T1和S-11348 的信號(hào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能夠被T1均勻連續(xù)染色細(xì)胞膜的細(xì)胞均沒有來自S-11348的熒光，因此 可證明T1能夠染色活細(xì)胞。
[0043]結(jié)果如圖1(11)。分別用T1和S-11348染色細(xì)胞后的共聚焦熒光照片。其中d圖為用 T1染色后在488nm激光輻照下得到的照片;e圖為用S-11348染色后的在405nm激光輻照下得 到的照片;f圖為d、e的疊加圖。
[0044] Hoechst 33342是一種商業(yè)化的可染色DNA的細(xì)胞核染料。將接種好的細(xì)胞爬片用 2μΜ T1進(jìn)行染色，在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min。吸出培養(yǎng)液后，然后再用5μΜ的Hoechst 33342 染色細(xì)胞，在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。然后用PBS洗三遍，將細(xì)胞爬片取出，細(xì)胞生長面朝下 蓋在載玻片上，在共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長分別為488nm和405nm下分兩個(gè)通道分別收集T1 和Hoechst 33342的信號(hào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凡是細(xì)胞膜被T1著色的細(xì)胞同時(shí)其細(xì)胞核也被 Hoechst 33342著色，可見T1能夠和Hoechst相兼容。
[0045] 結(jié)果見圖1(111)。分別用T1和Hoechst 33342染色細(xì)胞后的共聚焦熒光照片。其中 g圖為用T1染色后在488nm激光輻照下得到的照片；h圖為用Hoechst 33342染色后的在 405nm激光福照下得到的照片；i圖為g、h的疊加圖。
[0046] 實(shí)施例5:T1染色SiHa、HUVEC細(xì)胞
[0047] 將接好的細(xì)胞爬片用2μΜ T1染色，在C02培養(yǎng)箱中孵育20min。吸出培養(yǎng)液后用roS 洗三遍，細(xì)胞生長面朝下蓋在載玻片上，在共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜被T1 均勻連續(xù)地著色。因此，本發(fā)明所述探針T1也能專一性地成像SiHa、HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞膜。
[0048] 結(jié)果見圖2。11分別染色SiHa細(xì)胞(I圖）和HUVEC細(xì)胞(II圖）的共聚焦熒光照片。其 中a、d為488nm激光福照下得到的照片;b、e圖為明場激光掃描的微分干涉照片;c圖為a、b的 疊加圖，f圖為d、e的疊加圖。
[0049] 實(shí)施例6:T1染色HeLa細(xì)胞的共聚焦、雙光子照片及連續(xù)激光輻照下光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0050] 將接種好的細(xì)胞爬片用2μΜ T1進(jìn)行染色，在⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min。吸出培養(yǎng)液 后用PBS洗三遍，將細(xì)胞爬片取出，細(xì)胞生長面朝下蓋在載玻片上，分別在共聚焦顯微鏡(激 發(fā)波長:488nm)和TPM(激發(fā)波長:800nm，平均飛秒脈沖功率為3mW)下進(jìn)行連續(xù)輻照一系列 時(shí)間觀察細(xì)胞。
[0051] 結(jié)果見圖3。1!染色HeLa細(xì)胞的共聚焦（I圖）和雙光子（II圖）熒光照片。其中l(wèi)a圖 為488nm激光輻照下得到的照片，lid圖為800nm激光輻照下得到的雙光子照片;b、e圖為明 場激光掃描的微分干涉照片;c圖為a、b的疊加圖，f圖為d、e的疊加圖。T1染色HeLa細(xì)胞后在 488nm和800nm激光連續(xù)輻照下獲得的一系列不同時(shí)間的共聚焦（III圖）和雙光子（IV圖）熒 光照片。
[0052] 實(shí)施例7:T1染色小鼠肌肉組織和肝臟組織的雙光子顯微實(shí)驗(yàn)
[0053] 將從小鼠體內(nèi)取出的肌肉組織和肝臟組織分別培養(yǎng)在裝有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)小 皿中，然后用1〇μΜ的Τ1染色，在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40min。吸出培養(yǎng)液后用roS洗三遍。然后在 TPM(激發(fā)波長:800nm)下進(jìn)行觀察。
[0054] 結(jié)果見圖4。用T1染色小鼠肌肉組織（I圖）和肝臟組織（II圖）后在800nm激光輻照 下得到的雙光子熒光照片。其中a、d圖為雙光子熒光照片;b、e圖為明場激光掃描的微分干 涉照片;c圖為a、b的疊加圖，f圖為d、e的疊加圖。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種轉(zhuǎn)子型的雙光子深紅發(fā)射細(xì)胞膜巧光探針，為Ξ苯胺衍生物，其特征在于:所述 探針化學(xué)名稱為Ν，Ν-二（（4-(2'-(4"-十二烷基）化晚-4"艦化物）乙締）苯基）苯胺，其化學(xué) 結(jié)構(gòu)通式如式(I)所示：2. 權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)子型的雙光子深紅發(fā)射細(xì)胞膜巧光探針在標(biāo)記或顯示組織中的細(xì) 胞膜形態(tài)和活細(xì)胞中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述組織為小鼠肌肉組織和肝臟組織;所述 活細(xì)胞為永生化細(xì)胞和正常細(xì)胞。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述永生化細(xì)胞是化La細(xì)胞和Si化細(xì)胞，所 述正常細(xì)胞是HUVEC細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于分子轉(zhuǎn)子的用于成像組織中細(xì)胞膜的雙光子深紅發(fā)射的熒光探針，該探針化學(xué)名稱為N,N-二((4-(2’-(4”-十二烷基)吡啶-4”碘化物)乙烯)苯基)苯胺，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如式(I)所示。本發(fā)明還公開了所述熒光探針在標(biāo)記或顯示組織中的細(xì)胞膜形態(tài)和活細(xì)胞中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的探針能夠均勻連續(xù)地染色細(xì)胞膜，而且由于其是轉(zhuǎn)子型分子，綁定到高粘度的細(xì)胞膜后能夠發(fā)出明亮的雙光子深紅光，預(yù)示其作為細(xì)胞膜熒光探針具有很好的前景，有望填補(bǔ)細(xì)胞膜探針在組織成像方面的空缺。同時(shí)本發(fā)明的探針具有適用范圍廣，光穩(wěn)定性好，細(xì)胞毒性低，以及能在活性細(xì)胞中專一成像細(xì)胞膜的特點(diǎn)。
【IPC分類】C07D213/38, G01N21/64, C09K11/06
【公開號(hào)】CN105566207
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610140754
【發(fā)明人】于曉強(qiáng), 郭麗方, 孫渝明, 田明剛
【申請(qǐng)人】山東大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年3月11日