基于未修飾納米金與雙鏈dna相互作用的比色法檢測(cè)dna的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種基于未修飾納米金與雙鏈DNA相互作用的新型比色法檢測(cè)DNA。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、物理等學(xué)科領(lǐng)域的研究人員都對(duì)納米金產(chǎn)生了濃厚的 興趣。與常規(guī)的宏觀粒子比較，納米金具有非常獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)W:(l)納米金易于 制備；（2)具有納米顆粒所特有的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)；（3)具有獨(dú)特的電學(xué)效應(yīng)、光學(xué) 效應(yīng)、磁學(xué)效應(yīng)、催化效應(yīng)和特殊的生物親和效應(yīng)。運(yùn)些效應(yīng)使得金納米粒子廣泛應(yīng)用于臨 床、材料學(xué)等領(lǐng)域，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域金標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為目前的第四大標(biāo)記技術(shù)。
[0003] 用巧樣酸鋼還原氯金酸法制備出的納米金由于表面吸附了帶負(fù)電荷的巧樣酸根 離子而相互排斥，在溶液中處于均勻分散的穩(wěn)定狀態(tài)，顏色呈透亮的酒紅色。但若加入一 定量的鹽，穩(wěn)定狀態(tài)即被打破，納米金發(fā)生團(tuán)聚，粒子間距小于平均粒子直徑，導(dǎo)致溶液顏 色很快由紅色轉(zhuǎn)為紫色最后呈藍(lán)灰色溶液顏色，而且運(yùn)種變化是不可逆的?；谶\(yùn)個(gè)原理 發(fā)展了一系列的納米金檢測(cè)DNA的方法，可歸納為兩種。
[0004] 一是修飾的納米金檢測(cè)技術(shù)；納米金上通常修飾有單鏈DNA(ssDNA)，如果此 ssDNA與待檢測(cè)DNA相匹配而形成雙鏈，顏色發(fā)生轉(zhuǎn)變W。運(yùn)種方法也存在不足，如納米金 團(tuán)聚的時(shí)間太長(zhǎng)，修飾的過(guò)程比較費(fèi)時(shí)。在金納米粒子表面修飾的物質(zhì)如抗體、DNA、半脫氨 酸等都是通過(guò)Au-S鍵結(jié)合的，運(yùn)些帶琉基的物質(zhì)價(jià)格都比較貴、難W獲得。
[000引二是未修飾的納米金檢測(cè)技術(shù)；Li和RothbergW指出，未修飾的納米金對(duì)單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA(dsDNA)有不同的靜電作用。ssDNA的單鏈具有足夠的柔初性 在溶液中得W部分展開(kāi)，使其堿基暴露，堿基帶正電，與帶負(fù)電的納米金通過(guò)靜電作用力相 結(jié)合，能吸附在納米金上。在加入鹽溶液后，ssDNA保護(hù)納米金不聚集，顏色保持紅色。而 dsDNA由于帶負(fù)電與納米金相互排斥，不能吸附在納米金上，在加鹽后顏色變成藍(lán)色至灰 色。此方法價(jià)格低廉，不需要額外的檢測(cè)儀器，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單。通過(guò)利用運(yùn)一原理，化SUb Lee在其文章中成功利用未修飾的納米金檢測(cè)了點(diǎn)突變W。
[0006] 現(xiàn)有的未修飾的納米金檢測(cè)DNA看似簡(jiǎn)單可行，價(jià)格低廉，但實(shí)際應(yīng)用并不廣泛。 此原理2004年被提出，但截至2015年，只利用此原理檢測(cè)實(shí)際樣品的做法很少。本發(fā)明希 望找出其中的問(wèn)題所在。而其余的DNA檢測(cè)方法，如瓊脂糖電泳，污染環(huán)境，操作繁瑣；而如 qPCR費(fèi)用昂貴，要使用特殊昂貴的儀器，不便推廣。
[0007] 上述設(shè)及到的參考文獻(xiàn)如下：
[1] 姚素薇，鄒毅，張衛(wèi)國(guó).金納米粒子的特性、制備及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化工進(jìn) 展，2007 (03) :310-314.
[2] 李靜.納米金比色法檢測(cè)克倫特羅和凝血酶[M]:陜西師范大學(xué)，2012:68
[3] Li,比，Rothbe巧.，L.，2004.PNAS. 101，14036-14039.
[4] Lee,比，Kang,T.,Yoon,K.A.,Lee,S.Y.,Joo,S.W.,Lee,K., 2010b. Biosens.Bioelectron. 25巧），1669-1674。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 為了解決上述存在的問(wèn)題，本發(fā)明探討了dsDNA與未修飾的納米金之間的相互作 用，找到了能運(yùn)用于實(shí)際的未修飾納米金檢測(cè)DNA的方法。本發(fā)明利用未修飾納米金與 dsDNA相互作用的性質(zhì)，建立一種快速簡(jiǎn)單，無(wú)需用到額外的儀器（肉眼可見(jiàn))，不污染環(huán)境， 結(jié)果可靠，靈敏度高的新型檢測(cè)方法。
[0009] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種檢測(cè)雙鏈DNA的方法，包括W下步驟：將待測(cè)樣品加入含有未修飾的納米金的溶 液中，混勻，再加入鹽，混勻，若溶液顏色仍然保持紅色說(shuō)明樣品中含有雙鏈DNA。
[0010] 進(jìn)一步的，上述鹽為能夠使納米金發(fā)生聚團(tuán)的鹽。
[0011] 一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的方法，包括W下步驟： 1) 根據(jù)需要檢測(cè)的基因，對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行等位特異性PCR擴(kuò)增，PCR的引物根據(jù)突 變位點(diǎn)設(shè)計(jì)，只能擴(kuò)增出發(fā)生點(diǎn)突變的基因； 2) 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入含有未修飾納米金的溶液中，混勻，再加入鹽，混勻，若溶液顏 色保持紅色說(shuō)明該樣品發(fā)生了相應(yīng)的基因點(diǎn)突變。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是： O本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了dsDNA能吸附于未修飾的納米金上。
[0013] 2)本發(fā)明基于dsDNA能吸附于未修飾的納米金的原理，建立的新型比色法檢測(cè) DNA。
[0014] 3)本發(fā)明基于dsDNA能吸附于未修飾的納米金的原理建立了BRAFV600E的點(diǎn)突 變檢測(cè)。同時(shí)此方法可W推廣至各種點(diǎn)突變的檢測(cè)，及病毒檢測(cè)。
[0015] 4)本發(fā)明方法快速簡(jiǎn)單，無(wú)需用到額外的儀器（肉眼可見(jiàn))，不污染環(huán)境，結(jié)果可 靠，靈敏度高的新型檢測(cè)DNA的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為納米金的表征，其中A為納米金的TEM圖，B為納米金的紫外光譜圖； 圖2為dsDNA與未修飾納米金之間相互作用的研究。A為各組溶液中羅丹明B的巧光 發(fā)射光譜圖；B為各組溶液中dsDNAz的巧光發(fā)射光譜；C為羅丹明B(RB)、dsDNAi和納米金 (AuNPs)相互作用巧光強(qiáng)度變化原理圖，其中實(shí)屯、球體表示納米金；D為dsDNAz和納米金 (AuNPs)相互作用巧光強(qiáng)度原理圖，其中實(shí)屯、球體表示納米金，G為連在dsDNAz5'的巧光 分子羅丹明綠. 圖3為dsDNAz溶液體系與納米金溶液巧光滴定圖，A為在溫度308K時(shí)的巧光滴定圖， 其中1~5曲線對(duì)應(yīng)的納米金溶液濃度分別為0molL1、0. 98X10 1°molL1、1. 96X10 1° molL1、29. 4X10"molL1、3. 9X10"molLSb為dsDNA2與納米金的Van't-Hoff圖； 圖4為未修飾的納米金檢測(cè)dsDNA的結(jié)果圖，A為不同濃度的dsDNAi與納米金溶液混 合后的顏色變化情況；B為未修飾的納米金比色法檢測(cè)dsDNA原理圖； 圖5 (A)未修飾的納米金檢測(cè)BRAFV600E突變的結(jié)果圖和度）各細(xì)胞的直接測(cè)序的 結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 一種檢測(cè)雙鏈DNA的方法 1) 準(zhǔn)備好未修飾納米金溶液； 2) 將待測(cè)樣品加入未修飾納米金溶液中，混勻； 3) 往上述混合液中再加入鹽，混勻后，若溶液顏色仍然保持紅色說(shuō)明樣品中含有雙鏈 DNA。
[0018] 優(yōu)選的，步驟1)中未修飾納米金溶液的濃度為達(dá)到肉眼可識(shí)別其顏色為紅色即 可，更優(yōu)選的，未修飾納米金溶液的濃度為0. 37nM及W上；更優(yōu)選的納米金濃度為0. 37 nM~2. 46nM。
[0019] 上述未修飾的納米金粒徑使納米金溶液肉眼可見(jiàn)呈紅色即可，本發(fā)明實(shí)施例所用 納米金粒徑為17. 5皿。
[0020] 優(yōu)選的，上述步驟2)中待測(cè)樣品與未修飾納米金溶液的體積比為1 : (1~50)。該 體比可根據(jù)納米金粒徑的不同、納米金濃度的不同、DNA序列長(zhǎng)度的不同、鹽的用量等具體 情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖儭?br>[0021] 優(yōu)選的，上述步驟3)中所述的鹽為能夠使納米金發(fā)生聚團(tuán)的鹽。
[0022] 優(yōu)選的，上述步驟3)中鹽在如為化Cl溶液，其加入量為使鹽的終濃度為0. 05M。
[0023] 一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的方法 1) 根據(jù)需要檢測(cè)的基因，對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行等位特異性PCR擴(kuò)增，即PCR的引物根據(jù) 突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)，只能擴(kuò)增出發(fā)生點(diǎn)突變的基因； 2) 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入含有未修飾納米金的溶液中，混勻，再加入鹽，混勻，若溶液顏 色保持紅色說(shuō)明該樣品發(fā)生了相應(yīng)的基因點(diǎn)突變。
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[00巧]實(shí)施例1dsDNA與未修飾的納米金表面具有吸附結(jié)合作用 1.納米金的合成與表征 方法：將圓底燒瓶中加入95血超純水，1血1%氯金酸，磁力攬拌下加熱至100。開(kāi)始沸 騰后迅速一次性加入4ml1%巧樣酸S鋼，充分?jǐn)埌璨⒃?00°C下保持沸騰至溶液呈酒紅色 后加熱20min，自然冷卻至室溫，所得溶液即為納米金溶膠，于4°C下避光保存?zhèn)溆谩?br>[0026] 利用透射電子顯微鏡（TEM)對(duì)膠體金溶液的形貌和粒子大小進(jìn)行觀察；把制備的 溶膠樣品直接滴在鍛有碳膜的銅網(wǎng)上，紅外燈下干燥30min后，放入透射電鏡樣品臺(tái)拍攝 TEM圖像，操作電壓為200kV。采用紫外一可見(jiàn)分光光度法，在波長(zhǎng)為450~600nm范圍內(nèi) 測(cè)定金溶膠的吸收光譜，觀察其特征吸收曲線。
[0027] 結(jié)果：納米金的TEM圖像如圖IA所示，由TEM圖計(jì)算出納米金的粒徑為17. 5nm， 納米金的紫外光譜圖如圖IB所示，從中計(jì)算出納米金的濃度為2.71nM。
[0028] 的制備 雜交緩沖液為10ml化is(pH7. 5 - 8. 0)與50ml化Cl。把兩條不同序列的ssDNA加入雜交緩沖液中95 °C加熱5min后，逐漸冷卻至室溫即得dsDNA。dsDNAi由ssDNAi ssDNAz雜交制成，dsDNAz由ssDNAz與SSDNA3雜交形成，具體的堿基序列如表1所示。
[0029] 表1核巧酸序列表
注：;rhodaminegreen為羅丹明綠。
[0030] 與未修飾納米金間的相互作用 方法：羅丹明B能吸附在納米金表面而使其自身巧光被澤滅。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了W下四組 溶液中羅丹明B的巧光強(qiáng)度： a:羅丹明B; b:羅丹明B、dsDNAi和納米金（dsDNA1和納米金先混勻靜置IOmin再加入羅丹明B);C:羅丹明B和dsDNAi; d:羅丹明B和納米金； 上述四組溶液體積均為310化，納米金用量為20化，羅丹明B的終濃度均為3. 2X10 5mol?L，dsDNAi的終濃度為1. 29剛。羅丹明B巧光的激發(fā)波長(zhǎng)為510皿。
[0031] 結(jié)果：上述a、b、c、d四組溶液中羅丹明B的巧光檢測(cè)結(jié)果如圖2A所示，從中可W 看出未加入dsDNAi和納米金的羅丹明B巧光強(qiáng)度最強(qiáng)（a);當(dāng)溶液中含有dsDNA1 (C)或納 米金（d)時(shí)，羅丹明B的巧光強(qiáng)度均會(huì)變低，說(shuō)明dsDNAi、納米金均能與羅丹明B相互作用， 澤滅羅丹明B的巧光；然而，將dsDNAi和納米金先混合后再加入到羅丹明B溶液中，dsDNA1 和納米金對(duì)羅丹明B巧光的澤滅能力下降，運(yùn)說(shuō)明dsDNAi與納米金發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致 溶液中游離的納米金和dsDNAi減少，從而與羅丹明B結(jié)合的納米金和dsDNA1減少，即表現(xiàn) 出對(duì)羅丹明B巧光的澤滅能力下降。此原理可用圖2C作進(jìn)一步解釋，當(dāng)沒(méi)有dsDNA存在時(shí)， 納米金只和羅丹明B結(jié)合，當(dāng)有dsDNA存在時(shí)，dsDNA與羅丹明B競(jìng)爭(zhēng)性地與納米金結(jié)合， 與納米金結(jié)合的羅丹明B必須減少，從而減少對(duì)羅丹明B巧光的澤滅。
[0032] 方法：dsDNAz的5'有巧光分子羅丹明綠(見(jiàn)表1)，激發(fā)波長(zhǎng)為489皿。本實(shí)驗(yàn)檢 測(cè)W下兩組溶液的巧光強(qiáng)度： A:d