rimeSTARDNA聚合酶 0? 5y1，補(bǔ)水至 50y1。PCR條件為 98°C預(yù) 變性 2min，27 個(gè)循環(huán)：98°C10s，65°C10s，72°C6min30s，最后 72°C10min。經(jīng) 0.9%瓊 脂糖凝膠電泳分析PCR為陽性后，取PCR溶液20y1，加入1y1DpnI，37 °C酶切3h去除模 板質(zhì)粒DNA，65°C滅活10min，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21 (DE3)，涂布含卡那霉素（50yg/ ml)的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜，獲得飽和突變體庫。利用手性氣相色譜分析各個(gè)突變體轉(zhuǎn) 化底物所得產(chǎn)物環(huán)氧氯丙烷的ee值，篩選出ee值提高的陽性突變體，從篩選的陽性克隆中 抽提質(zhì)粒，送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用DNAssist軟件與野生型鹵 醇脫鹵酶基因序列進(jìn)行比對，確認(rèn)突變前后基因序列及相應(yīng)的氨基酸序列的差異，獲得將 重組鹵醇脫鹵酶編碼基因的137位的V(Val)突變?yōu)镮(lie)的突變體（氨基酸序列為SEQ IDNo. 4所示，核苷酸序列為SEQIDNo. 3所示）。
[0033] 實(shí)施例3重組鹵醇脫鹵酶的表達(dá)
[0034] 將實(shí)施例1和實(shí)施例2所得的重組大腸桿菌，分別接種至含終濃度50mg/L硫酸卡 那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按1% (v/v)的接種量接入裝有100mLLB培養(yǎng) 基的500mL三角瓶中，置37°C、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的0D600達(dá)到0. 6時(shí)，加入 終濃度為〇. 5mM的IPTG作為誘導(dǎo)劑，28°C誘導(dǎo)10h，將培養(yǎng)液離心，收集細(xì)胞（即濕菌體）， 并用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，得靜息細(xì)胞。將所得靜息細(xì)胞懸浮于20mLpH8.0的緩沖液 中，在冰浴中超聲破碎15min，離心，收集上清，即為重組鹵醇脫鹵酶的粗酶液。粗酶液經(jīng)聚 丙烯酰胺凝膠電泳分析（圖2)，重組蛋白在細(xì)胞中可溶的形式存在。
[0035] 實(shí)施例4:鹵醇脫鹵酶和突變體V137I催化1，3-二氯丙醇合成（S)-環(huán)氧氯丙烷
[0036] 野生型轉(zhuǎn)化體系組成及轉(zhuǎn)化操作如下：在10mL甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 (pH10. 0)中加入0. 2g野生型鹵醇脫鹵酶濕菌體（實(shí)施例3制備）和30mM的1，3-二氯丙 醇，在35°C、150r/min條件下?lián)u床反應(yīng)，反應(yīng)2. 5min后，將反應(yīng)液用2倍體積乙酸乙酯進(jìn) 行萃取，萃取兩次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用氣相色譜分析測定底物的轉(zhuǎn)化率和 ee值。反應(yīng)2. 5min后，1，3_二氯丙醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上，（S)-環(huán)氧氯丙烷的收率達(dá) 88. 6%，ee值達(dá)到 84. 5%。
[0037] 突變體轉(zhuǎn)化體系組成及轉(zhuǎn)化操作如下：在10mL甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 (pH10. 0)中加入0. 2g突變體V137I濕菌體（實(shí)施例3制備）和30mM的1，3-二氯丙醇，在 35°C、150r/min條件下?lián)u床反應(yīng)，反應(yīng)6min后，將反應(yīng)液用2倍體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃 取兩次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用氣相色譜分析測定底物的轉(zhuǎn)化率和ee值。反 應(yīng)6min后，1,3-二氯丙醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%以上，（S)-環(huán)氧氯丙烷的收率達(dá)90.6%，ee 值達(dá)到92. 5%。
[0038] 采用氣相檢測環(huán)氧氯丙烷的濃度和ee值，采用GC-14C系統(tǒng)，色譜柱類型：BGB_175 毛細(xì)管柱；色譜條件：柱溫90°C，進(jìn)樣室溫度220°C，F(xiàn)ID檢測器220°C，氦氣流量為1. 6mL/ min;分流比為40:1。酶活單位⑶定義為：在35°C、pH10. 0條件下，在lmin內(nèi)催化1，3-二 氯丙醇生成1Umol環(huán)氧氯丙烷所需要的酶量定義為1U。根據(jù)體系中環(huán)氧氯丙烷的生成量 推知重組菌酶活。測定結(jié)果見表1，以實(shí)施例3中未誘導(dǎo)的野生型重組菌、不含載體的宿主 菌以及含空載體的宿主菌為對照。
[0039] 表1:野生型齒醇脫齒酶和突變體酶活力比較
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組鹵醇脫鹵酶制備的突變體，其特征在于所述突變體是將SEQ ID N〇:2所示 氨基酸序列第137位纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷?br>2. -種由權(quán)利要求1所述重組鹵醇脫鹵酶突變體構(gòu)建的重組基因工程菌。
3. -種權(quán)利要求1所述重組鹵醇脫鹵酶突變體在催化鹵代醇制備手性環(huán)氧化物中的 應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶突變體基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲 得的濕菌體為催化劑，以鹵代醇為底物，在pH值為8~10的緩沖液中，于35°C、150r/min 條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物；所述鹵代醇為1，3-二氯 丙醇、1，3-二溴丙醇或2, 3-二溴丙醇，所述濕菌體的用量為l-50g/L緩沖液，所述底物的初 始濃度為5-60mmol/L緩沖液。
4. 一種權(quán)利要求1所述重組鹵醇脫鹵酶突變體在拆分環(huán)氧化物制備手性環(huán)氧化物 中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶突變體基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培 養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以環(huán)氧化物為底物，加入親核試劑，在PH值為5~8的緩沖液 中，于30°C、150r/min條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物；所 述環(huán)氧化物為環(huán)氧氯丙烷，所述濕菌體的用量為l_50g/L緩沖液，所述底物的初始濃度為 10-lOOmmol/L緩沖液，所述親核試劑為NaN 3、NaN02、NaCN或NaBr，所述親核試劑的加入量 為 20-200mmol/L 緩沖液。
5. -種權(quán)利要求1所述重組鹵醇脫鹵酶在制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用，其特征在于 所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶突變體基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化 劑，以（S)-4-氯-3-羥基丁腈或（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，在pH值為8~10的 緩沖液中，于35°C、150r/min條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得手性環(huán)氧 化物；所述濕菌體的用量為10_50g/L緩沖液，所述底物的初始濃度為5-60mmol/L緩沖液。
6. -種用于構(gòu)建權(quán)利要求1所述重組鹵醇脫鹵酶突變體的重組鹵醇脫鹵酶，其特征在 于所述重組鹵醇脫鹵酶的氨基酸序列為SEQ ID N〇:2所示。
7. -種由權(quán)利要求6所述重組鹵醇脫鹵酶構(gòu)建的重組基因工程菌。
8. -種權(quán)利要求6所述重組鹵醇脫鹵酶在催化鹵代醇制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用，其 特征在于所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶編碼基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體 為催化劑，以鹵代醇為底物，在pH值為8~10的緩沖液中，于10-50°C、150r/min條件下 反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物；所述鹵代醇為1，3-二氯丙醇、 1，3-二溴丙醇、2-氯-1-苯乙醇或2, 3-二溴丙醇，所述濕菌體的用量為l-50g/L緩沖液， 所述底物的初始濃度為5-60mmol/L緩沖液。
9. 一種權(quán)利要求6所述重組鹵醇脫鹵酶在拆分環(huán)氧化物制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用， 其特征在于所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為 催化劑，以環(huán)氧化物為底物，加入親核試劑，在pH值為4~7的緩沖液中，于10-50°C、150r/ min條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物；所述環(huán)氧化物為環(huán) 氧氯丙烷，所述濕菌體的用量為l_50g/L緩沖液，所述底物的初始濃度為10-100mm 〇l/L緩 沖液，所述親核試劑為NaN3、NaN02、NaCN或NaBr，所述親核試劑的加入量為20-200mmol/L 緩沖液。
10. -種權(quán)利要求6所述重組鹵醇脫鹵酶在制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用，其特征在于 所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶編碼基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化 劑，以（S)-4-氯-3-羥基丁腈或（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，在pH值為8~10的 緩沖液中，于35°C、150r/min條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得手性環(huán)氧 化物；所述濕菌體的用量為10_50g/L緩沖液，所述底物的初始濃度為5-60mmol/L緩沖液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組鹵醇脫鹵酶、突變體、工程菌及其應(yīng)用，所述重組鹵醇脫鹵酶的氨基酸序列為SEQ ID No:2所示；本發(fā)明還公開了重組鹵醇脫鹵酶及其突變體催化1,3-二氯丙醇不對稱脫鹵合成(S)-環(huán)氧氯丙烷及在制備其它手性環(huán)氧化物以及β-取代醇的應(yīng)用；相對于其它鹵醇脫鹵酶，本發(fā)明獲得鹵醇脫鹵酶及其突變體具有更高的對映選擇性，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N15-70, C12P41-00, C12N1-21, C12P7-62, C12P17-02, C12P13-00, C12N15-60, C12N9-88, C12R1-19
【公開號(hào)】CN104745556
【申請?zhí)枴緾N201510097830
【發(fā)明人】柳志強(qiáng), 鄭裕國, 薛鋒, 朱杭芹, 王亞軍, 沈寅初
【申請人】浙江工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月5日