本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段鑒定中藥的方法，具體為一種用于鑒定中藥川貝母的引物對(duì)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：川貝母為百合科貝母屬多種植物的干燥鱗莖，是最具有代表性的川產(chǎn)名貴藥材之一。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為其具有清熱潤肺，化痰止咳，散結(jié)，降壓解痙等功效，主治肺熱燥咳、咳痰帶血、痰多胸悶等癥，為止咳潤肺之“圣藥”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有較好的鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗菌、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、心血管活性、抗?jié)?、抗血小板聚集、抗腫瘤等作用。由于川貝母生長周期長、資源緊缺，已成為中藥材中價(jià)格最昂貴的根莖類藥材之一。2010版《中華人民共和國藥典》中收錄川貝母基源植物包括川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、太白貝母和瓦布貝母，但我國已查明貝母屬植物超過50種，其中伊犁貝母、平貝母、米貝母、輪葉貝母等作為川貝母的混偽品頻繁出現(xiàn)，甚至葫蘆科有毒植物土貝母的鱗莖也被發(fā)現(xiàn)冒充川貝母出售。隨著需求量的增加，川貝母基源混亂的現(xiàn)象呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，直接影響到川貝母臨床用藥的安全、療效。因此開展川貝母藥材更深入的鑒定研究，針對(duì)其制定一種高效、簡便的基源物種鑒定方法，對(duì)于川貝母臨床用藥，質(zhì)量控制以及合理開發(fā)利用川貝母屬植物資源具有重要意義。dna條形碼技術(shù)是利用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)短序列來進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)，由于該技術(shù)基于dna片段進(jìn)行物種鑒定和親緣關(guān)系的定位，了解其分支來源，甚至可以預(yù)知其進(jìn)化方向等諸多用途，使其成為近年來生物分類學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。在中藥鑒定領(lǐng)域中，相對(duì)傳統(tǒng)中藥材鑒別方法(性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別)，其具有不受物種外在形狀特征、發(fā)育階段等因素影響的特點(diǎn)。目前已有蕓香料、薔薇科、豆科、重樓屬等多個(gè)藥用植物豐富的植物科屬展開了dna條形碼研究并取得良好鑒定效果。其中核糖體dna中的its2區(qū)具有進(jìn)化速率快，高度重復(fù)、長度適中等優(yōu)點(diǎn)，成為藥用植物dna條形碼研究中最為重要候選序列之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種采用分子生物學(xué)手段鑒定川貝母混偽品，具有高效、簡便的的特點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種用于鑒定中藥川貝母的引物對(duì)及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于鑒定中藥川貝母的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優(yōu)選的，所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。表1引物對(duì)及發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列名稱序列(5，-3，)seqidno.p1-fggcataataggcgggcgagctaatc1p1-rgcggtgagattagatcataatttcggtg2p2-fgctattagcattaatcgatcgaattc3p2-rgggatcgaattcatggattagtacacaat4p3-fgatccgggtctcttgagccccttg5p3-rgtaccgtgttcacgattgcctcagg6發(fā)卡結(jié)構(gòu)cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物對(duì)在制備鑒定中藥川貝母試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。優(yōu)選的，所述試劑盒鑒定中藥川貝母的步驟包括：(1)提取川貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋20～200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優(yōu)選的，所述川貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。有益效果：(1)本發(fā)明所述引物對(duì)特異性好，靈敏度高，能夠準(zhǔn)確識(shí)別目標(biāo)片段；(2)本發(fā)明所述方法高效、簡便；(3)本發(fā)明所述方法能夠準(zhǔn)確鑒定市售混偽品，為川貝母的鑒定分析提供科學(xué)依據(jù)。附圖說明圖1是實(shí)施例1～3pcr鑒定結(jié)果電泳圖；其中m為分子量為2000的maker；1為實(shí)施例1pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；2為實(shí)施例2pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；3為實(shí)施例3pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種用于鑒定中藥川貝母的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對(duì)在制備鑒定中藥川貝母試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥川貝母的步驟包括：(1)提取川貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述川貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。實(shí)施例2一種用于鑒定中藥川貝母的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對(duì)在制備鑒定中藥川貝母試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥川貝母的步驟包括：(1)提取川貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋80倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述川貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。實(shí)施例3一種用于鑒定中藥川貝母的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對(duì)在制備鑒定中藥川貝母試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥川貝母的步驟包括：(1)提取川貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋20倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述川貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。sequencelisting<110>蘇州市李良濟(jì)健康產(chǎn)業(yè)有限公司<120>一種用于鑒定中藥川貝母的引物對(duì)及其應(yīng)用<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列<400>1ggcataataggcgggcgagctaatc25<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列<400>2gcggtgagattagatcataatttcggtg28<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列<400>3gctattagcattaatcgatcgaattc26<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列<400>4gggatcgaattcatggattagtacacaat29<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<400>5gatccgggtctcttgagccccttg24<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<400>6gtaccgtgttcacgattgcctcagg25<210>7<211>40<212>dna<213>人工序列<400>7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40當(dāng)前第1頁12