一種在蛹蟲草中過表達菌絲霉素抗菌肽的方法與流程

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因
技術領域：
，特別涉及一種在蛹蟲草中過表達菌絲霉素抗菌肽的方法。
背景技術：
：抗菌肽是進化上高度保守、普遍存在的天然免疫系統(tǒng)因子，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學活性，且不易形成耐藥性和藥物殘留?？咕?antibacterialpeptides，abps)又稱抗微生物肽(antimicrobialpeptides，amps)或宿主防御肽(hostdefensepeptides，hdps)，是生物體經(jīng)誘導產(chǎn)生的具有廣譜抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)活性的一類小分子多肽，屬于機體非特異性防御系統(tǒng)的固有組成部分，幾乎存在于所有生命形式(昆蟲、兩棲動物、鳥類、魚類、哺乳動物、植物以及人體)中?？咕耐ǔＳ?2～50個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量一般在4kda左右。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽具有快速殺菌和廣譜抗菌活性，包括抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、多重耐藥細菌、真菌、寄生蟲、包膜病毒和腫瘤細胞，并且能通過趨化樹突狀細胞、單核細胞和記憶t細胞，在先天性免疫和獲得性免疫反應之間起到橋梁作用，并通過啟動獲得性免疫系統(tǒng)提高機體抵抗微生物感染的能力。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)超過1500種抗菌肽。菌絲霉素plectasin是2005年從腐生子囊菌的分泌蛋白中分離出的首例真菌防御素。菌絲霉素的成熟功能片段只有40個氨基酸,其分子量約為4.4kda，其空間結(jié)構(gòu)由一個a螺旋和兩個反相平行的β一折疊組成是典型的防御素csaβ結(jié)構(gòu)。其生物學活性主要表現(xiàn)為對革蘭氏陽性菌有較強的殺菌作用，尤其是對肺炎鏈球菌、膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等，有與青霉素、萬古霉素相當?shù)目咕饔谩４送?，菌絲霉素在體外抑菌試驗、動物試驗及一些臨床試驗中表現(xiàn)出無細胞毒性、無溶血性、腦脊液滲透性好等優(yōu)勢，且不易使(包括對傳統(tǒng)抗生素抵抗在內(nèi)的)病原菌產(chǎn)生耐藥性，因此作為新一代抗生素替代物具有相當大的治療潛力。作為傳統(tǒng)中藥，蟲草的研究和應用一直備受關注。蟲草是由子囊菌門(ascomycoa)，肉座菌目(hypocreales)，麥角菌科(clavicipitaceae)蟲草屬(cordyceps)真菌的孢子寄生于昆蟲幼蟲身上并由夏季從蟲體生出子實體所形成的菌蟲復合體。其中最著名的是寄生于高山蝙蝠蛾(hepialusarmoricanus)幼蟲的冬蟲夏草(ophiocordycepssinensis)和寄生于鱗翅目蛹的蛹蟲草(cordycepsmilitaris)(sungetal.,2007)。蟲草具有多種藥用功效，包括：抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎癥、殺蟲、抗微生物、降血脂血糖、抗衰老、神經(jīng)保護、腎保護等功能，在腫瘤治療、器官移植、肝腎移植和心臟保護等方面具有重要作用。其主要成分包括四類：1)核苷酸、2)多糖、3)多肽和糖蛋白、4)甾醇和萜烯。蟲草素作為一種新型的廣譜抗菌素有抗病毒、抗腫瘤作用。以其特有的抗菌抗病毒活性，已引起全球科技發(fā)達國家的高度重視。目前，我國蛹蟲草產(chǎn)量達到市值15億，包括直接食用及深加工產(chǎn)品。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種在蛹蟲草中過表達菌絲霉素抗菌肽的方法，該方法得到的菌株與野生型菌株相比，對原核大腸桿菌和金黃的葡萄球菌有明顯的抑菌作用，其具有替代抗生素的潛在利用價值。本發(fā)明的一種在蛹蟲草中過表達菌絲霉素抗菌肽的方法，包括：(1)收集pda上蛹蟲草菌絲，提取dna；利用引物擴增得到蛹蟲草hsp70基因的啟動子片段，將片段構(gòu)建到pdht-bar上，得到載體pdht-hsp；(2)合成菌絲霉素抗菌肽片段，酶切，連接到上述pdht-hsp上，得到pdht-hsp-ple載體；(3)利用上述pdht-hsp-ple載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，將蛹蟲草孢子和得到的農(nóng)桿菌菌株共培養(yǎng)，經(jīng)誘導和篩選得到轉(zhuǎn)基因菌株。所述步驟(1)中的hsp70基因的啟動子片段的序列如seqidno.1所示。所述步驟(1)中的引物為pr1：cggaattccccctaaatcacaagcttggtccg；pr2：tcccccggggttggcggcttctgtgtgtgta。所述步驟(1)中的pdht-bar的序列如seqidno.2所示。所述步驟(2)中的菌絲霉素抗菌肽片段的序列(ple序列)如seqidno.3所示。所述步驟(2)中的合成菌絲霉素抗菌肽片段所用引物為f：tcccccgggatgggcttcggctgcaacgg；r：cgggatccttagtagcacttgcaaacaaaac。所述步驟(2)中的酶切位點為smai/bamhi。所述步驟(3)中的共培養(yǎng)采用含50μg/ml卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基。所述步驟(3)中的誘導和篩選采用含300μg/ml頭孢霉素和300μg/ml草銨膦的m-100培養(yǎng)基。所述步驟(3)中得到的轉(zhuǎn)基因菌株在復合培養(yǎng)基sdb中培養(yǎng)，25℃、220rpm振蕩培養(yǎng)，液體發(fā)酵3天；超聲破碎，離心獲取蛋白，定量并檢測蛋白的抑菌活性。有益效果本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因的方法獲得了轉(zhuǎn)天蠶素抗菌肽的蛹蟲草菌株，該菌株與野生型菌株相比，對原核大腸桿菌和金黃的葡萄球菌有明顯的抑菌作用，其具有替代抗生素的潛在利用價值；每年蛹蟲草生產(chǎn)產(chǎn)生大量的菌渣，很大一部分菌渣直接作為動物飼料使用，如果利用該菌株，將會為養(yǎng)殖業(yè)帶來不可估量的價值，這為蛹蟲草的進一步應用提供了更為廣泛的前景。附圖說明圖1為載體構(gòu)建的pcr圖；其中，1為dl-2000；2、8為本發(fā)明得到的轉(zhuǎn)基因菌株；4-6為cm01野生型菌株；圖2為蛋白標準曲線圖；圖3為野生型菌株、突變菌株的抑菌活性試驗；其中，a為pbs；b為cm01野生型菌株；c為本發(fā)明得到的轉(zhuǎn)基因菌株；d為amp抗生素；圖4為野生型菌株、突變菌株的抑菌圈直徑。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。蛹蟲草菌株所用培養(yǎng)基：pda培養(yǎng)基：購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。配方：馬鈴薯淀粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，瓊脂粉15.0g/l。sdb培養(yǎng)基：購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。配方：動物組織胃蛋白酶消化物5.0g/l，胰酶消化酪蛋白胨5.0g/l，葡萄糖20.0g/l。m-100培養(yǎng)基：m-100saltsolution62.5ml/l，葡萄糖10g/l，kno33g/l，瓊脂粉15g/l。做覆蓋用時，瓊脂粉減為0.75g/l。m-100saltsolution：kh2po416g/l，na2so44g/l，kcl8g/l，mgso4.7h2o2g/l，cacl21g/l，m-100traceelementsolution8ml/l。m-100traceelementsolution：h3bo30.06g/l，mncl2·4h2o0.14g/l，zncl20.40g/l，na2moo4·2h2o0.04g/l，fecl3·6h2o0.10g/l，cuso4·5h2o0.40g/l。細菌菌株所用培養(yǎng)基：lb培養(yǎng)基：購自mdbio(青島生工生物科技有限公司)。配方：tryptone10g/l，nacl10g/l，yeastextract5g/l。若要配制固體培養(yǎng)基，則再添加15g/l瓊脂粉。農(nóng)桿菌誘導培養(yǎng)基im(液體)：2.5×mmsaltsolution400ml/l，葡萄糖1.8g/l，甘油5ml/l，加水定容至940ml。高壓滅菌并冷卻至50℃后，每升加入40ml1mmes(ph5.5，過濾除菌)，20ml10mmas(乙酰丁香酮，dmso(二甲基亞砜)配制，過濾除菌)。若配置固體培養(yǎng)基，葡萄糖減為0.9g/l，并加入瓊脂粉15.0g/l。2.5×mmsaltsolution：kh2po43.625g/l，k2hpo45.125g/l，mgso4.7h2o1.250g/l，nacl0.375g/l，cacl2·2h2o0.165g/l，feso4·7h2o0.0062g/l(先配制6.2g/l的溶液，用時移取1ml)，(nh4)2so41.250g/l。實施例1過表達載體的構(gòu)建：(1)收集pda上蛹蟲草菌絲，提取dna；利用引物pr1/pr2擴增得到蛹蟲草hsp70基因的啟動子片段，利用酶切位點ecrori/smai，酶切、消化、連接pdht-bar，獲得重組載體pdht-hsp；pr1：cggaattccccctaaatcacaagcttggtccg；pr2：tcccccggggttggcggcttctgtgtgtgta。pcr反應體系為：試劑reagent體積(μl)pcrmagicmix2.025primer12primer22templatedna3ddh2o18total50pcr反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共30個循環(huán)；最后在72℃下補平10min，10℃保存。(2)利用引物上游引物plefortcccccgggatgggcttcggctgcaacgg；下游引物ple-bamhi-revcgggatccttagtagcacttgcaaacaaaac擴增獲得ple序列。利用酶切位點smai/bamhi，酶切、消化、連接，獲得重組載體pdht-hsp-ple。實施例2同源重組載體蛹蟲草中的轉(zhuǎn)化(根癌農(nóng)桿菌介導的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化)1)從lb平板(含50μg/ml卡那霉素)上挑選一新鮮培養(yǎng)的含pdht-hsp-ple載體的農(nóng)桿菌agl-1單菌落，接種于5mllb液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素)中，220rpm，28℃過夜培養(yǎng)。2)次日離心收集菌體，用等體積的液體誘導培養(yǎng)基im重懸，移取適量的重懸液至5ml液體誘導培養(yǎng)基im使od660＝0.14-0.2。3)28℃、220rpm振蕩培養(yǎng)4-6h，菌液濃度至od660＝0.5-0.8之間即可。4)蛹蟲草孢子的培養(yǎng)和收集：在超凈工作中，將在pda培養(yǎng)基上活化好(25℃，20d)的新鮮菌絲轉(zhuǎn)移至均質(zhì)儀中，加入50mlsdb液體培養(yǎng)基，均質(zhì)30s(低速10s，高速10s，低速10s)后，移取10ml至100mlsdb液體培養(yǎng)基中，25℃，150rmp，搖床培養(yǎng)7d至芽生孢子量達到108-109。無紡布過濾收集芽生孢子，儲存在4℃待用，一個月內(nèi)可用。5)取上述農(nóng)桿菌菌液和用0.05％tween20稀釋至1×106個/ml的孢子懸液各100μl充分混勻后涂布于im平板，28℃共培養(yǎng)2d。6)加入1ml0.05％tween20溶液至上述平板，用涂布器充分洗滌(刮取)混勻共培養(yǎng)物。將洗滌下來的培養(yǎng)物按每板200μl均勻涂布在含300μg/ml頭孢霉素和300μg/ml草銨膦的m-100培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3～5d至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，即得轉(zhuǎn)基因菌株。7)挑取轉(zhuǎn)化子至含300μg/ml頭孢霉素的m-100培養(yǎng)基上，待其長至直徑為1-2cm時小量提取基因組進行pcr驗證，pcr產(chǎn)物回收，測序，具體序列為：atgggcttcggctgcaacggcccctgggacgaggacgacatgcagtgccacaaccactgcaagtccattaagggctacaagggcggttactgcgctaaaggcggttttgtttgcaagtgctactaa。實施例3轉(zhuǎn)基因菌株的抑菌效果檢測1)菌絲培養(yǎng)分別收集野生型菌株和實施例2的轉(zhuǎn)基因菌株的新鮮孢子懸浮液，濃度調(diào)至108個/ml，吸取300μl，接種到100ml的sdb培養(yǎng)基中，25℃、150rmp搖床培養(yǎng)3d；2)過濾收集菌絲，冷凍干燥，-80℃保藏備用；3)菌絲在pbs緩沖液中，勻漿破碎，4℃、8000rmp離心5min，收集上清液；4)蛋白定量采用bradford法。抑菌實驗：將保存于-80℃大腸桿菌dh5a用接種環(huán)接種于5ml的lb培養(yǎng)基中，37℃、250rpm搖床過夜培養(yǎng)10-12小時。將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌按1％的比例接種到新鮮的lb培養(yǎng)基中,37℃、250rpm搖床培養(yǎng)約2小時至對數(shù)生長中期。加樣及活性檢測：10μlpbs和amp(50μg/1ml)分別做陰性和陽性對照，10μg的轉(zhuǎn)基因菌株提取蛋白及野生型蛹蟲草的提取蛋白，分別點在同一塊平板上，37℃在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16小時，觀察抑菌圈大小。由圖3和4可知，過表達菌株的蛋白提取液的抑菌活性要高于野生型菌株的蛋白提取液。sequencelisting<110>上海市農(nóng)業(yè)科學院<120>一種在蛹蟲草中過表達菌絲霉素抗菌肽的方法<130>1<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>1898<212>dna<213>人工序列<400>1aagacagctccatatcgcatcgtcgcacataagcgaagcggcggcaggctatcagcgcgc60agagccatctctcagggtagaggccaagccagtgacccttctggcctgagagttcgacac120cattgcaagctttgggaacgcaaccggcatcaagcagttacgtggctacctaactagctg180gatggaagcatctgtagacgacccatggcccccgcatgagtcgtttcggatgggcgggta240gcagtaggctgaagaggctgttgggccgtgacggaaggagactgaacccaagtgaatgaa300tgtagagcttattaggcgaagttgagtgaagctcgcctacttaggcgactggatttcctt360tcaacatggaaccgccgagctccaaatttttcatcgggcccctaaatcacaagcttggtc420cgtttgccgtctcattgtccattacgaccggaatcgaggagccacaaaattttcgtcact480gattgtcatgttttttctttcttcgaccggcgcgccccgccgttgtgcttggttgcttgg540gcacggctgcagccacaggcggctggtacagtggtacgtaccggctctgtatctgcgccc600caccatctgccacacaaggaaggcggagctccgttcgttgcctcgccactgcagagcttt660ccgcgagctgccttgcaacggggcgctatctggtaattggatctgacagacgtcaagaac720cagggaattttcgttggccggggaagcaatgtgagggaaattatccgtttgcggcagggc780ggtgagcgcgatacccagccacgtttcgttcggagcgcttcgttcgattcgggtcgcggg840gtaatacaaacagagctcggctgcatgtgtgagaagccacctctagcgttaatgggacag900ctgggaatgcatcgtaaaaaagatttcgagactcgctggtcgcttcgaggcagatccatc960gctttcgaaccttgctgtagctccgtcaatggaggcgttctggaaagccctcaccagccc1020actatgacgcctgttccaacaatcgccgcgttggaggggcatgcgggtgacaaaaaaaag1080gccggacacgtaagtctacactctattaaaactaggaaaaggaaaagcggaattagcata1140agtataagcaagataagaaatataagcaaaataggaaatataagcaatataagaaaaata1200ggaagaataaggaagaggttagtattcctaaccggcgggttactatgtcttggtgagggg1260cagaaggtaaaaaatagaggtggggccgtaaagtactcagtacctccatacaccgccata1320aggcggctccaaaaggcacgggtgaatgtactcgggacttgctcgggtgccccgcggtgg1380aagagtgaagtagctcatcgaaaactggtgctccgtgatggaagcccaaagtgaagacag1440tgagaggcgaacaagaaaagagcgcagaagacactcacgttacccaggttactcacccgc1500aaggttgcgcaggaagacgaccgccttttgtaaaagaatctggtgggtgcgtccagcacc1560ctgcagctctcttcaggtagctccagcaagctccagctgttgccagagacttccacaggc1620ccctgccacactctagtgggctccgctggaaaagtttcgaagcacatagaagcgcccgct1680tcttcttatttagatgcatcctactcaccaagaattgtctattagcttttctctcatttc1740attctcacacacacattataccccctcttcaatccatcatcgagaggaagaactagctct1800cctgcttgctcccattttcaaacacactcgagtgtttattttctcttcaacatcccaaaa1860cccctcctcccctccatacacacacagaagccgccaac1898<210>2<211>7076<212>dna<213>人工序列<400>2aattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggca60ctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgc120cttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgc180ccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgctagagcagcttgagcttggatcag240attgtcgtttcccgccttcagtttaaactatcagtgtttgacaggatatattggcgggta300aacctaagagaaaagagcgtttattagaataacggatatttaaaagggcgtgaaaaggtt360tatccgttcgtccatttgtatgtgcatgccaaccacagggttcccctcgggatcaaagta420ctttgatccaacccctccgctgctatagtgcagtcggcttctgacgttcagtgcagccgt480cttctgaaaacgacatgtcgcacaagtcctaagttacgcgacaggctgccgccctgccct540tttcctggcgttttcttgtcgcgtgttttagtcgcataaagtagaatacttgcgactaga600accggagacattacgccatgaacaagagcgccgccgctggcctgctgggctatgcccgcg660tcagcaccgacgaccaggacttgaccaaccaacgggccgaactgcacgcggccggctgca720ccaagctgttttccgagaagatcaccggcaccaggcgcgaccgcccggagctggccagga780tgcttgaccacctacgccctggcgacgttgtgacagtgaccaggctagaccgcctggccc840gcagcacccgcgacctactggacattgccgagcgcatccaggaggccggcgcgggcctgc900gtagcctggcagagccgtgggccgacaccaccacgccggccggccgcatggtgttgaccg960tgttcgccggcattgccgagttcgagcgttccctaatcatcgaccgcacccggagcgggc1020gcgaggccgccaaggcccgaggcgtgaagtttggcccccgccctaccctcaccccggcac1080agatcgcgcacgcccgcgagctgatcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcggctg1140cactgcttggcgtgcatcgctcgaccctgtaccgcgcacttgagcgcagcgaggaagtga1200cgcccaccgaggccaggcggcgcggtgccttccgtgaggacgcattgaccgaggccgacg1260ccctggcggccgccgagaatgaacgccaagaggaacaagcatgaaaccgcaccaggacgg1320ccaggacgaaccgtttttcattaccgaagagatcgaggcggagatgatcgcggccgggta1380cgtgttcgagccgcccgcgcacgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccggttt1440gtctgatgccaagctggcggcctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgccg1500ccgtctaaaaaggtgatgtgtatttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgta1560tatgatgcgatgagtaaataaacaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgta1620cttaaccagaaaggcgggtcaggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccctg1680caactcgccggggccgatgttctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcgat1740tgggcggccgtgcgggaagatcaaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgatt1800gaccgcgacgtgaaggccatcggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgccccag1860gcggcggacttggctgtgtccgcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggtgcag1920ccaagcccttacgacatatgggccaccgccgacctggtggagctggttaagcagcgcatt1980gaggtcacggatggaaggctacaagcggcctttgtcgtgtcgcgggcgatcaaaggcacg2040cgcatcggcggtgaggttgccgaggcgctggccgggtacgagctgcccattcttgagtcc2100cgtatcacgcagcgcgtgagctacccaggcactgccgccgccggcacaaccgttcttgaa2160tcagaacccgagggcgacgctgcccgcgaggtccaggcgctggccgctgaaattaaatca2220aaactcatttgagttaatgaggtaaagagaaaatgagcaaaagcacaaacacgctaagtg2280ccggccgtccgagcgcacgcagcagcaaggctgcaacgttggccagcctggcagacacgc2340cagccatgaagcgggtcaactttcagttgccggcggaggatcacaccaagctgaagatgt2400acgcggtacgccaaggcaagaccattaccgagctgctatctgaatacatcgcgcagctac2460cagagtaaatgagaaatgaataaatgagtagatgaattttagcggctaaaggaggcggca2520tggaaaatcaagaacaaccaggcaccgacgccgtggaatgccccatgtgtggaggaacgg2580gcggttggccaggcgtaagcggctgggttgtctgccggccctgcaatggcactggaaccc2640ccaagcccgaggaatcggcgtgacggtcgcaaaccatccggcccggtacaaatcggcgcg2700gcgctgggtgatgacctggtggagaagttgaaggccgcgcaggccgcccagcggcaacgc2760atcgaggcagaagcacgccccggtgaatcgtggcaagcggccgctgatcgaatccgcaaa2820gaatcccggcaaccgccggcagccggtgcgccgtcgattaggaagccgcccaagggcgac2880gagcaaccagattttttcgttccgatgctctatgacgtgggcacccgcgatagtcgcagc2940atcatggacgtggccgttttccgtctgtcgaagcgtgaccgacgagctggcgaggtgatc3000cgctacgagcttccagacgggcacgtagaggtttccgcagggccggccggcatggccagt3060gtgtgggattacgacctggtactgatggcggtttcccatctaaccgaatccatgaaccga3120taccgggaagggaagggagacaagcccggccgcgtgttccgtccacacgttgcggacgta3180ctcaagttctgccggcgagccgatggcggaaagcagaaagacgacctggtagaaacctgc3240attcggttaaacaccacgcacgttgccatgcagcgtacgaagaaggccaagaacggccgc3300ctggtgacggtatccgagggtgaagccttgattagccgctacaagatcgtaaagagcgaa3360accgggcggccggagtacatcgagatcgagctagctgattggatgtaccgcgagatcaca3420gaaggcaagaacccggacgtgctgacggttcaccccgattactttttgatcgatcccggc3480atcggccgttttctctaccgcctggcacgccgcgccgcaggcaaggcagaagccagatgg3540ttgttcaagacgatctacgaacgcagtggcagcgccggagagttcaagaagttctgtttc3600accgtgcgcaagctgatcgggtcaaatgacctgccggagtacgatttgaaggaggaggcg3660gggcaggctggcccgatcctagtcatgcgctaccgcaacctgatcgagggcgaagcatcc3720gccggttcctaatgtacggagcagatgctagggcaaattgccctagcaggggaaaaaggt3780cgaaaaggtctctttcctgtggatagcacgtacattgggaacccaaagccgtacattggg3840aaccggaacccgtacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggtcacacatgtaa3900gtgactgatataaaagagaaaaaaggcgatttttccgcctaaaactctttaaaacttatt3960aaaactcttaaaacccgcctggcctgtgcataactgtctggccagcgcacagccgaagag4020ctgcaaaaagcgcctacccttcggtcgctgcgctccctacgccccgccgcttcgcgtcgg4080cctatcgcggccgctggccgctcaaaaatggctggcctacggccaggcaatctaccaggg4140cgcggacaagccgcgccgtcgccactcgaccgccggcgcccacatcaaggcaccctgcct4200cgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcac4260agcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgt4320tggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactgg4380cttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaata4440ccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcact4500gactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggta4560atacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccag4620caaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccc4680cctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggacta4740taaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctg4800ccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagc4860tcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcac4920gaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaac4980ccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcg5040aggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactaga5100aggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggt5160agctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcag5220cagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtct5280gacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgcattctaggtactaa5340aacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagt5400aagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacg5460cagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagcca5520cttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagaca5580agttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaat5640ggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaa5700tccaattcggctaagcggctgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatg5760gagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgataatcttttcagggctttgttca5820tcttcatactcttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccag5880ccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagc5940atcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatt6000tttaaatataggttttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattcct6060tccgtatcttttacgcagcggtatttttcgatcagttttttcaattccggtgatattctc6120attttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaag6180ctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaatacc6240agaaaacagctttttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagc6300cgattttgaaaccgcggtgatcacaggcagcaacgctctgtcatcgttacaatcaacatg6360ctaccctccgcgagatcatccgtgtttcaaacccggcagcttagttgccgttcttccgaa6420tagcatcggtaacatgagcaaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgtc6480ccggactgatgggctgcctgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcggggag6540ctgttggctggctggtggcaggat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