本發(fā)明涉及養(yǎng)殖廢棄物處理領(lǐng)域，具體而言，涉及一株四環(huán)素降解菌，經(jīng)鑒定為蠟狀芽孢桿菌，及其在畜禽糞便堆肥化處理中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
四環(huán)素類抗生素在我國(guó)獸藥抗生素中生產(chǎn)和使用比例均高于其他獸藥抗生素，但其中30～90％的四環(huán)素類抗生素不能被動(dòng)物完全吸收，將以原型或母體化合物的形式排出體外，在畜禽糞便中產(chǎn)生大量殘留。畜禽糞便應(yīng)用過(guò)程中，殘留的獸藥抗生素可通過(guò)土壤的吸附、迀移、降解和植物吸收，以各種途徑進(jìn)入到環(huán)境介質(zhì)如土壤、水體及大氣中；也可在食物鏈累積迀移，最終通過(guò)攝食進(jìn)入人體，構(gòu)成對(duì)人類健康的潛在危害。基于上述生態(tài)安全威脅，有關(guān)畜禽糞便中殘留四環(huán)素類抗生素的降解及消除方法與途徑越來(lái)越受到人們的重視，已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
四環(huán)素是四環(huán)素類抗生素的主要種類之一，目前已有多篇文章和專利報(bào)道了對(duì)其進(jìn)行降解的方法，主要包括光電催化、理物-化學(xué)氧化、水解、礦物降解和微生物降解等方法。其中，微生物降解因其條件簡(jiǎn)單、容易控制、專一性較強(qiáng)且不會(huì)引起二次污染的特點(diǎn)成為四環(huán)素主要降解途徑，也是最經(jīng)濟(jì)有效的方法。微生物降解的主要功能物為降解微生物，在與抗生素的交互作用中，降解微生物可通過(guò)各類生物酶的作用將抗生素降解轉(zhuǎn)化為能源物質(zhì)或?qū)ψ陨頍o(wú)毒害作用的其他代謝產(chǎn)物，從而降低甚至消除抗生素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。因此，篩選到合適的高效的降解菌株顯得尤為重要，微生物降解是一種很有潛力的處理有機(jī)污染物的方法，在工業(yè)生產(chǎn)的各個(gè)方面具有很高的推廣價(jià)值。目前報(bào)道的四環(huán)素降解微生物種類仍然較少，亟需補(bǔ)充新的菌種資源，且現(xiàn)有菌種的應(yīng)用方法略顯單一，降解效率難再提高。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一株四環(huán)素降解細(xì)菌，該菌的四環(huán)素降解功能此前未見(jiàn)報(bào)道；進(jìn)一步將該降解菌與堆肥化處理相結(jié)合應(yīng)用于畜禽糞便處理中，完善優(yōu)化堆肥化處理工藝和條件，可顯著提高四環(huán)素降解效率，最終減少甚至消除堆肥產(chǎn)品四環(huán)素殘留。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
一株四環(huán)素降解菌，所述菌株經(jīng)鑒定為蠟狀芽孢桿菌，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC NO.13546；保藏時(shí)間為：2017年01月09日。
篩選該菌的樣品為新鮮雞糞，培養(yǎng)于以四環(huán)素作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為30℃，170r/min搖床培養(yǎng)，通過(guò)多次轉(zhuǎn)接和耐受馴化，最終獲得能以四環(huán)素作為唯一碳源生長(zhǎng)的降解菌菌液，應(yīng)用連續(xù)梯度稀釋涂布的方法，吸取0.1mL降解菌菌液涂布于LB平板上，置于微生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度為30℃，獲得降解菌單菌落并進(jìn)行劃線純化。經(jīng)生理生化及16S rRNA基因測(cè)序鑒定，本發(fā)明所述四環(huán)素降解菌為蠟狀芽孢桿菌，拉丁學(xué)名為Bacillus cereus，菌株名為TC-1，該菌是一種好氧、中溫和產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，具有很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等活性，能產(chǎn)生抗菌素，目前已有大量研究報(bào)道了該菌在降解環(huán)境污染物如有機(jī)磷農(nóng)藥、苯酚和芘污染物上的作用及對(duì)重金屬鎘、鉻和鉛等的強(qiáng)耐受性。
有關(guān)所述降解菌在四環(huán)素降解方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。目前報(bào)道的四環(huán)素降解菌主要包括缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)和人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)、無(wú)丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacter amalonaticus)和酵母菌Trichosporon mycotoxinivorans等。本發(fā)明篩選獲得的蠟狀芽孢桿菌TC-1能以四環(huán)素作為唯一碳源生長(zhǎng)，具有降解性能，有利于豐富四環(huán)素降解菌資源庫(kù)，為四環(huán)素污染的治理提供有效的生物降解方法。
上述的經(jīng)過(guò)分離純化的蠟狀芽孢桿菌，其為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，菌落大，表面粗糙，扁平，不規(guī)則。菌體細(xì)胞桿狀，(1.0～1.2)×(3.0～5.0)微米。產(chǎn)芽孢，芽孢圓形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5微米，無(wú)莢膜，運(yùn)動(dòng)。
平板菌落形態(tài)：在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，30℃，培養(yǎng)24h，可形成圓形或近似圓形、質(zhì)地軟、無(wú)色素、稍有光澤的白色菌落(似蠟燭樣顏色)直徑5-7mm。在LB平板上菌落為灰白色，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，菌落較大。
含有所述的蠟狀芽孢桿菌的菌劑也屬于本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍。對(duì)于該菌株而言，是只要能夠加入到含有四環(huán)素的有機(jī)物中即可發(fā)揮凈化的效果。然而在實(shí)際應(yīng)用的過(guò)程中，考慮到其可能需要運(yùn)輸及分解效率等原因，有必要將其擴(kuò)大培養(yǎng)制成微生物菌劑的形式以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。
含有上述四環(huán)素降解菌的微生物菌劑，優(yōu)選的，所述微生物菌劑為液體菌劑，且在該液體菌劑中，活菌的數(shù)量是1×109-10CFU/mL。
該液體菌劑中，培養(yǎng)液可優(yōu)選為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基、或者進(jìn)一步添加葡萄糖、硫胺素、生物素和煙酸等營(yíng)養(yǎng)物。
本發(fā)明基于上述的液體微生物菌劑提供了一種制備方法，包括以下步驟：
將如上所述菌株的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；
將所述培養(yǎng)液中的細(xì)菌培養(yǎng)物離心后用無(wú)菌水重懸，得到液體菌劑。
優(yōu)選的，所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：
28℃～32℃，150r/min～190r/min搖床培養(yǎng)10h～16h后轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)60h～80h，獲得所述培養(yǎng)液。
如上所述的四環(huán)素降解菌或如上所述的微生物菌劑在畜禽糞便堆肥化處理中的應(yīng)用。
一種畜禽糞便堆肥化處理的方法，將如上所述的微生物菌劑加入堆肥原料中進(jìn)行堆肥化處理；所述堆肥原料包括畜禽糞便、蘑菇渣和米糠。
優(yōu)選的，所述畜禽糞便包括雞糞、豬糞、牛糞、羊糞、鴨糞等；最優(yōu)選采用雞糞和豬糞；
優(yōu)選的，將雞糞或豬糞、蘑菇渣和米糠按照比例(3～7)：(2～6)：1，更優(yōu)選5：4：1混合使用；
優(yōu)選的，如上所述的方法，加入所述微生物菌劑后，所述堆肥原料的水分含量控制在55wt％～60wt％得到堆體，所述微生物菌劑中的四環(huán)素降解菌在所述堆體中的初始含量為1.0×108～9CFU/g。
優(yōu)選的，如上所述的方法，所述堆肥化處理在密閉式堆肥反應(yīng)器中進(jìn)行，每隔2～3d翻堆一次所述堆體，正壓鼓風(fēng)，堆體維持高溫55～65℃達(dá)5～8d，降溫至45℃以下后干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％。
優(yōu)選的，如上所述的方法，所述堆肥化處理在槽式堆肥工藝條件下進(jìn)行，供氧方式采用翻堆和曝氣兩種方式相結(jié)合。
優(yōu)選的，如上所述的方法，所述堆肥化處理具體包括：
調(diào)整所述堆肥原料的混合比例使所述堆體的碳氮比為28～32：1，將混合均勻的堆體推入堆肥槽進(jìn)行堆肥化處理，堆肥化過(guò)程維持26～30d后將堆體移出堆肥槽，干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％；
或；
調(diào)整所述堆肥原料的混合比例使所述堆體的碳氮比為28～32：1，將混合均勻的堆體推入堆肥槽進(jìn)行堆肥化處理，堆肥化過(guò)程維持19～23d后再次在堆體中添加所述菌劑并調(diào)節(jié)堆體含水量至55wt％～60wt％，繼續(xù)處理5～9d后移出堆肥槽，干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％。
為提高堆肥化處理效率，在原料混合物期間即接種降解菌，可有效降解堆體有機(jī)殘?bào)w，釋放養(yǎng)分，加快腐熟。在堆肥化處理高溫期結(jié)束時(shí)，再次接種降解菌，保障對(duì)未完全降解的殘留四環(huán)素的降解效率，減少甚至消除雞糞或豬糞堆肥化處理產(chǎn)品中的殘留四環(huán)素含量。制成的堆肥產(chǎn)品堆肥化處理周期短、腐熟度好、四環(huán)素殘留顯著減少，應(yīng)用于土壤中可改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)和作物根部環(huán)境，增強(qiáng)根系對(duì)養(yǎng)分的吸收，從而達(dá)到省時(shí)、高效、安全的效果。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
提供了一株可應(yīng)用于降解四環(huán)素類抗生素的菌株，該菌株具有較為寬泛的生長(zhǎng)條件，可有效地實(shí)現(xiàn)消除殘留四環(huán)素類抗生素的危害的目的，為生物降解四環(huán)素類抗生素提供了一種新的途徑。
本申請(qǐng)?zhí)峁┑南灎钛挎邨U菌(Bacillus cereus)，菌株名為TC-1，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏時(shí)間為：2017年01月09日，保藏編號(hào)CGMCC NO.13546。經(jīng)保藏中心于2017年01月09日檢測(cè)為存活菌株。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1
本發(fā)明處理目標(biāo)物為新鮮雞糞，堆肥化處理添加的有機(jī)物料為蘑菇渣和米糠，所用雞糞中四環(huán)素初始含量為60mg/Kg。四環(huán)素降解菌發(fā)酵液中的降解菌數(shù)量為1.0×109CFU/mL。
堆肥化處理過(guò)程在密閉式堆肥反應(yīng)器(VTD-100)中進(jìn)行，具體步驟和工藝條件如下：
(1)將水分含量為80％的雞糞125kg、含水率為15％的蘑菇渣100kg、含水率為8％的米糠25kg用攪拌機(jī)混合均勻，此時(shí)混合堆料的水分含量約46％左右；分成2份，每份為125kg。
(2)其中一份添加上述四環(huán)素降解菌發(fā)酵液8L，與堆料進(jìn)一步混合均勻后裝入堆肥反應(yīng)器(VTD-100)，每箱裝堆料44kg，共裝3箱。
(3)另外一份作對(duì)照，添加清水8L，與堆料進(jìn)一步混合均勻，然后裝入堆肥反應(yīng)器(VTD-100)，同樣每箱裝堆料44kg，共裝3箱。
(4)堆肥反應(yīng)器按相同的反應(yīng)條件進(jìn)行堆肥化試驗(yàn)：每隔2-3d翻堆一次堆體，正壓鼓風(fēng)，堆體維持高溫55～65℃達(dá)5d以上，降溫至45℃以下后干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％。堆肥化處理進(jìn)行28d。
堆肥化處理結(jié)束時(shí)，取樣分析其中四環(huán)素殘留量，結(jié)果見(jiàn)表1。本發(fā)明的應(yīng)用方法堆肥產(chǎn)品中四環(huán)素殘留量顯著低于對(duì)照，對(duì)四環(huán)素的降解率達(dá)98.8％，而對(duì)照堆肥處理的降解率為80.6％。
表1 四環(huán)素降解菌在雞糞堆肥化處理中的應(yīng)用結(jié)果
實(shí)施例2
本發(fā)明處理目標(biāo)物為新鮮豬糞，堆肥化處理添加的有機(jī)物料為蘑菇渣和米糠，所用豬糞中四環(huán)素初始含量為78mg/Kg。四環(huán)素降解菌發(fā)酵液中的降解菌數(shù)量為1.0×109CFU/mL。
堆肥化處理過(guò)程在密閉式堆肥反應(yīng)器(VTD-100)中進(jìn)行，具體步驟和工藝條件如下：
(1)將水分含量為78％的豬糞125kg、含水率為15％的蘑菇渣100kg、含水率為8％的米糠25kg用攪拌機(jī)混合均勻，此時(shí)混合堆料的水分含量約46％左右；分成2份，每份為125kg。
(2)其中一份添加上述四環(huán)素降解菌發(fā)酵液8L，與堆料進(jìn)一步混合均勻后裝入堆肥反應(yīng)器(VTD-100)，每箱裝堆料44kg，共裝3箱。
(3)另外一份作對(duì)照，添加清水8L，與堆料進(jìn)一步混合均勻，然后裝入堆肥反應(yīng)器(VTD-100)，同樣每箱裝堆料44kg，共裝3箱。
(4)堆肥反應(yīng)器按相同的反應(yīng)條件進(jìn)行堆肥化試驗(yàn)：每隔2-3d翻堆一次堆體，正壓鼓風(fēng)，堆體維持高溫55～65℃達(dá)5d以上，降溫至45℃以下后干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％。堆肥化處理進(jìn)行28d。
(5)堆肥化處理結(jié)束時(shí)，取樣分析其中四環(huán)素殘留量，結(jié)果見(jiàn)表2。本發(fā)明的應(yīng)用方法堆肥產(chǎn)品中四環(huán)素殘留量顯著低于對(duì)照，對(duì)四環(huán)素的降解率達(dá)97.9％，而對(duì)照堆肥處理的降解率為82.4％。
表2 四環(huán)素降解菌在豬糞堆肥化處理中的應(yīng)用結(jié)果
實(shí)施例3
本發(fā)明處理目標(biāo)物為新鮮雞糞，堆肥化處理添加的有機(jī)物料為蘑菇渣和米糠，所用雞糞中四環(huán)素初始含量為60mg/Kg。四環(huán)素降解菌發(fā)酵液中的降解菌數(shù)量為1.0×109CFU/mL。
堆肥化處理過(guò)程采用槽式堆肥工藝進(jìn)行，該工藝的供氧方式采用翻堆和曝氣兩種方式相結(jié)合。
以不添加四環(huán)素降解菌的常規(guī)堆肥為對(duì)照，按常規(guī)調(diào)整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料再添加清水50kg，進(jìn)一步混合均勻，混合均勻的物料推入堆肥槽進(jìn)行堆肥化處理。第28d將堆料移出堆肥槽，取樣檢測(cè)四環(huán)素殘留量：12.32mg/Kg，降解率為79.5％。
同樣按常規(guī)調(diào)整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料添加本發(fā)明的四環(huán)素降解菌發(fā)酵液50L，進(jìn)一步混合均勻?；旌暇鶆虻奈锪贤迫攵逊什圻M(jìn)行堆肥化處理。按與對(duì)照相同的堆肥工藝參數(shù)進(jìn)行。至第28d將堆料移出堆肥槽，取樣檢測(cè)四環(huán)素殘留量結(jié)果：1.45mg/Kg，降解率達(dá)97.6％。
表3 四環(huán)素降解菌在雞糞堆肥化處理中的應(yīng)用結(jié)果
實(shí)施例4
本發(fā)明處理目標(biāo)物為新鮮豬糞，堆肥化處理添加的有機(jī)物料為蘑菇渣和米糠，所用豬糞中四環(huán)素初始含量為78mg/Kg。四環(huán)素降解菌發(fā)酵液中的降解菌數(shù)量為1.0×109CFU/mL。
堆肥化處理過(guò)程采用槽式堆肥工藝進(jìn)行，該工藝的供氧方式采用翻堆和曝氣兩種方式相結(jié)合。
以不添加四環(huán)素降解菌的常規(guī)堆肥為對(duì)照，按常規(guī)調(diào)整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料再添加清水50kg，進(jìn)一步混合均勻，混合均勻的物料推入堆肥槽進(jìn)行堆肥化處理。第28d將堆料移出堆肥槽，取樣檢測(cè)四環(huán)素殘留量：11.26mg/Kg，降解率為85.6％。
同樣按常規(guī)調(diào)整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料添加本發(fā)明的四環(huán)素降解菌發(fā)酵液50L，進(jìn)一步混合均勻?；旌暇鶆虻奈锪贤迫攵逊什圻M(jìn)行堆肥化處理。按與對(duì)照相同的堆肥工藝參數(shù)進(jìn)行。至第28d將堆料移出堆肥槽，取樣檢測(cè)四環(huán)素殘留量結(jié)果：0.83mg/Kg，降解率達(dá)98.9％。
表4 四環(huán)素降解菌在豬糞堆肥化處理中的應(yīng)用結(jié)果
實(shí)施例5
本發(fā)明處理目標(biāo)物為新鮮雞糞，堆肥化處理添加的有機(jī)物料為蘑菇渣和米糠，所用豬糞中四環(huán)素初始含量為60mg/Kg。四環(huán)素降解菌發(fā)酵液中的降解菌數(shù)量為1.0×109CFU/mL。
堆肥化處理過(guò)程采用槽式堆肥工藝進(jìn)行，該工藝的供氧方式采用翻堆和曝氣兩種方式相結(jié)合。
開(kāi)始試驗(yàn)前，以不添加四環(huán)素降解菌的常規(guī)堆肥為對(duì)照，按常規(guī)調(diào)整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料再添加清水50kg，進(jìn)一步混合均勻，混合均勻的物料推入堆肥槽進(jìn)行堆肥化處理。第28d將堆料移出堆肥槽，取樣檢測(cè)四環(huán)素殘留量：12.30mg/Kg，降解率為79.5％。
同樣按常規(guī)調(diào)整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料添加本發(fā)明的四環(huán)素降解菌發(fā)酵液50L，進(jìn)一步混合均勻?；旌暇鶆虻奈锪贤迫攵逊什圻M(jìn)行堆肥化處理。按與對(duì)照相同的堆肥工藝參數(shù)進(jìn)行。至第21d時(shí)，再次添加四環(huán)素降解菌發(fā)酵液10L，混合均勻繼續(xù)處理7d后移出堆肥槽，取樣檢測(cè)四環(huán)素殘留量結(jié)果：0.085mg/Kg，降解率達(dá)99.9％。
表5 四環(huán)素降解菌在雞糞堆肥化處理中的應(yīng)用結(jié)果
盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。