一種檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途的制作方法

本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途。

背景技術(shù)：

牛支原體(mycoplasmabovis，m.bovis)是感染牛的一種重要的致病性病原體，1961年hale在美國(guó)首次從患乳腺炎的牛乳中分離到該病原，它屬于柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬，可以引起牛肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道炎和流產(chǎn)等多種臨床疾病。我國(guó)在2008年從患肺炎的犢牛肺臟中首次分離到該病原，此后相繼在重慶、甘肅、寧夏、貴州、山西、吉林等大部分省份報(bào)道了牛支原體病。我國(guó)牛場(chǎng)牛支原體肺炎的發(fā)病率在50％～100％，病死率高達(dá)10％～50％，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

牛支原體的主要傳播途徑是通過(guò)飛沫呼吸道傳播，在養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中感染牛支原體的帶菌牛可通過(guò)咳嗽以及呼出的氣體、乳汁等將病原排出體外，漂浮在空氣中，在避免陽(yáng)光直射條件下可存活數(shù)周，因此，健康動(dòng)物經(jīng)呼吸道吸入牛支原體氣溶膠后即可感染，引發(fā)疾病。

目前國(guó)內(nèi)外還沒有理想的疫苗可以預(yù)防本病，許多研究顯示牛支原體疫苗的保護(hù)作用甚微弱，所以通過(guò)疫苗增強(qiáng)牛的免疫力目前還難以實(shí)現(xiàn)。支原體沒有細(xì)胞壁，而多數(shù)細(xì)菌都有細(xì)胞壁，這使得現(xiàn)有抗生素對(duì)支原體的殺菌效果不明顯。因此，通過(guò)定期監(jiān)測(cè)，結(jié)合衛(wèi)生消毒及生物安全防控等可有效預(yù)防本病的發(fā)生?，F(xiàn)有常用的牛支原體診斷方法如病原的分離培養(yǎng)、核酸檢測(cè)以及血清學(xué)方法都很難做到早期預(yù)警和隱性感染牛的篩查。

以環(huán)境氣溶膠樣本為監(jiān)測(cè)對(duì)象，應(yīng)用靈敏、特異和快速的real-timepcr方法可以有效地進(jìn)行群體監(jiān)測(cè)，并對(duì)牛場(chǎng)衛(wèi)生消毒和生物安全效果進(jìn)行評(píng)估。但由于牛支原體氣溶膠中細(xì)菌的含量很低，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度要求很高，再加之氣溶膠樣本的采集相對(duì)較困難，因此，目前還未有針對(duì)牛支原體氣溶膠采用taqman技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的引物和探針組合，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示，探針序列如seqidno.3所示。

具體序列如下：

正向引物：5′-agctgatggcggtatacaacaa-3′；(seqidno.1)

反向引物：5′-catatctaggtcaattaaggctttggt-3′；(seqidno.2)

探針：5′-(vic)acgcttaatataaacatccctgtta(bhq-2)-3′(seqidno.3)。

第二方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合。

進(jìn)一步的，該試劑盒中還包括：陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對(duì)照和實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)試劑。

所述陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如seqidno.4所示(141個(gè)堿基)的核苷酸片段構(gòu)成的peasy-t3重組質(zhì)粒組成；具體如下：

5'-gacttagttatagctgatggcggtatacaacaagttaatgaagctaaaaaaacgcttaaaacgcttaatataaacatccctgttattggattagtaaaaaatgagtttcacaaaaccaaagccttaattgacctagatatg-3'；(seqidno.4)

所述陰性對(duì)照為peasy-y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)試劑為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)試劑。

第三方面，本發(fā)明提供一種非診斷目的的檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的方法，步驟如下：

(1)采集環(huán)境氣溶膠樣本；

(2)提取氣溶膠樣本的基因組總dna；

(3)以提取的基因組總dna為模板，采用上述的試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增體系的擴(kuò)增曲線對(duì)環(huán)境氣溶膠樣本中是否含有牛支原體進(jìn)行判斷，擴(kuò)增曲線ct值≤37.0時(shí)，擴(kuò)增曲線成s型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有牛支原體病原核酸，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；當(dāng)擴(kuò)增曲線ct值＞37.0時(shí)，擴(kuò)增曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有牛支原體病原核酸，檢測(cè)結(jié)果為陰性。

步驟(1)中，采集環(huán)境氣溶膠樣本的方法為：采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的全玻璃液體沖擊式采樣器(all-glass-impinger，簡(jiǎn)稱agi)，以30ml含0.01％(v/v)牛血清白蛋白的pbs(ph7.0)為采樣介質(zhì)，按照12.5l/min的采樣流量采集30min，收集養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中的氣溶膠樣本。

步驟(2)中，提取氣溶膠樣本的基因組總dna的方法為：將采集到的氣溶膠樣本在室溫下離心，棄上清液，應(yīng)用細(xì)菌基因組dna試劑盒(商業(yè)化產(chǎn)品，現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑盒)提取總dna。

步驟(3)中，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl，包括2×probeqpcrmix10μl，模板1μl，10μmol/l的正向引物和反向引物各0.9μl，probe0.8μl，rnasefreeddh2o6.4μl。

步驟(3)中，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：預(yù)變性95℃30s，然后95℃變性5s、60℃退火延伸30s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號(hào)，最后40℃30s反應(yīng)結(jié)束。

本發(fā)明的有益效果：

(1)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)牛支原體的防治現(xiàn)狀及危害的分析，本發(fā)明選擇牛支原體所共有的uvrc基因序列設(shè)計(jì)合成引物，建立taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr，可對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)氣溶膠樣本中牛支原體與其它病原進(jìn)行區(qū)分，并在養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中開展牛支原體病的流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)中不同環(huán)境區(qū)域，包括動(dòng)物飼養(yǎng)舍、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、擠奶廳及產(chǎn)房等采集氣溶膠樣本，利用taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)牛支原體的含量及其分布情況，為場(chǎng)區(qū)衛(wèi)生消毒試劑的選擇、使用次數(shù)及重點(diǎn)消毒區(qū)域的確定提供參考。

(2)本發(fā)明的試劑盒可以檢測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境氣溶膠中牛支原體，具有簡(jiǎn)捷快速、靈敏特異、低廉準(zhǔn)確及實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。利用本發(fā)明的方法可以對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境氣溶膠中的牛支原體的流行與隱性感染進(jìn)行群體監(jiān)測(cè)，為養(yǎng)殖場(chǎng)牛支原體病的防控提供技術(shù)支持，也可以開展牛支原體病的流行病學(xué)調(diào)查，為牛支原體病的科學(xué)防控提供理論支撐。

(3)本發(fā)明建立的taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法，通過(guò)倍比稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，最低濃度為4.0拷貝/反應(yīng)。以牛支原體、無(wú)乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種sc型、絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種、溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌基因組dna等為模板，在建立的檢測(cè)方法下進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明僅有牛支原體有陽(yáng)性擴(kuò)增，其他菌株擴(kuò)增均為陰性，表明與其他菌株無(wú)交叉反應(yīng)，具有很強(qiáng)的特異性。

對(duì)3個(gè)不同濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了批內(nèi)檢測(cè)和批間檢測(cè)，計(jì)算出批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，其批內(nèi)誤差和批間誤差均小于10％。批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)ct值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：相同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒ct值之間差異均不顯著(p>0.05)。

本發(fā)明所述的檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途，既可應(yīng)用于養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境氣溶膠中牛支原體的檢測(cè)與鑒定，也可用于臨床血液、血清、奶樣、鼻拭子、組織等樣本的檢測(cè)與鑒定。本發(fā)明的方法可用于養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中臨床樣本的直接檢測(cè)，也可用于科學(xué)研究等非疾病的診斷。

附圖說(shuō)明

構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書附圖用來(lái)提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。

圖1：taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)牛支原體標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(熒光定量pcr儀自動(dòng)生成)，利用480ⅱ中g(shù)enescanningsoftwareversion1.5的absquant/2ndderivativemax分析模式建立擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，圖中，曲線1-9代表4.0×10⁸-4.0×10⁰拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，曲線10為陰性對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

圖2：taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)牛支原體標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用480ⅱ中g(shù)enescanningsoftwareversion1.5的absquant/2ndderivativemax分析模式分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果各點(diǎn)基本在一條直線上，圖中，各點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度從左到右依次為4.0×10²-4.0×10⁸拷貝數(shù)/反應(yīng)。

圖3：普通pcr檢測(cè)牛支原體靈敏性擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，圖中，1-9號(hào)泳道分別是模板為4.0×10⁸-4.0×10⁰拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，10號(hào)泳道為陰性對(duì)照。

圖4：taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)牛支原體特異性擴(kuò)增曲線，其中，曲線1和2的模板分別為，4.0×10⁴拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和牛支原體dna，均為s型曲線；曲線3-10分別為：無(wú)乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種sc型、絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種、溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌，均為一條直線，擴(kuò)增反應(yīng)為陰性；曲線11為陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說(shuō)明書中使用術(shù)語(yǔ)“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中還未針對(duì)牛支原體氣溶膠采用taqman技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道?；诖?，本發(fā)明提出了一種檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途。

在本申請(qǐng)的一種實(shí)施方案中，提供了一種用于檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的引物和探針組合，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示，探針序列如seqidno.3所示。

具體序列如下：

正向引物：5′-agctgatggcggtatacaacaa-3′；(seqidno.1)

反向引物：5′-catatctaggtcaattaaggctttggt-3′；(seqidno.2)

探針：5′-(vic)acgcttaatataaacatccctgtta(bhq-2)-3′(seqidno.3)。

上述探針的5′端標(biāo)記vic，3′端標(biāo)記bhq-2。

檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的難點(diǎn)主要為：

一方面，氣溶膠(aerosol)是指懸浮在氣體中的固體和/或液體微粒與氣體載體共同組成的多相體系。根據(jù)微粒的成分可以劃分為生物氣溶膠和化學(xué)氣溶膠。在氣溶膠的體系中，把具有生命的氣溶膠粒子和活性粒子以及由有生命活性的機(jī)體所釋放到空氣中的各種質(zhì)粒統(tǒng)稱為生物氣溶膠，又稱為微生物氣溶膠，主要分為細(xì)菌氣溶膠、病毒氣溶膠和真菌氣溶膠等，與人類及動(dòng)物的健康密切相關(guān)。通過(guò)監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中氣溶膠微生物，可以有效地預(yù)警預(yù)測(cè)傳染病的暴發(fā)流行。

但由于氣溶膠樣本的采集相對(duì)較困難，而且氣溶膠中牛支原體的含量較低，若有效檢出氣溶膠中的目標(biāo)病原體，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度要求很高。因此，目前對(duì)于牛支原體多采用鼻拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)，針對(duì)的是單一個(gè)體，難以實(shí)現(xiàn)群體監(jiān)測(cè)。

另一方面，牛支原體的保守16srna序列與無(wú)乳支原體pg2株同源性高達(dá)99％，但是其表面膜蛋白的同源性非常低，可以通過(guò)p81基因的體外表達(dá)產(chǎn)物建立一種敏感的血清學(xué)診斷方法。因此，金云云等人為快速檢測(cè)牛支原體，根據(jù)genbank中登錄的牛支原體p81基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)條件優(yōu)化，建立了牛支原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。

關(guān)于牛支原體致病機(jī)理的研究目前尚無(wú)統(tǒng)一定論，但是眾多學(xué)者認(rèn)為其對(duì)宿主細(xì)胞的黏附作用是其感染宿主的第一步，而這種黏附作用主要由牛支原體表面的眾多脂蛋白來(lái)完成，p48蛋白作為牛支原體表面的一種脂蛋白，具有高度的保守性。因此，有報(bào)道根據(jù)牛支原體p48脂蛋白基因和無(wú)乳支原體基因之間的差異，設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)特異性pcr擴(kuò)增引物，建立了牛支原體的pcr快速檢測(cè)方法。

oppd/f是寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)atp結(jié)合蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)稱，是牛支原體特異性基因，編碼牛支原體2條短肽。有報(bào)道根據(jù)牛支原體oppd/f基因的特異性保守序列設(shè)計(jì)的，用以定性、定量檢測(cè)待測(cè)樣品中的牛支原體。

因此，對(duì)于牛支原體而言，能夠作為靶標(biāo)序列的保守基因種類很多，以不同的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物不同，對(duì)于牛支原體的診斷和檢測(cè)效果并不相同。本申請(qǐng)對(duì)用于設(shè)計(jì)引物的牛支原體的靶標(biāo)序列進(jìn)行了優(yōu)化篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以u(píng)vrc基因作為靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物，靈敏度高，特異性強(qiáng)。

本申請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)過(guò)程中，設(shè)計(jì)了多組不同的引物和探針，并分別進(jìn)行組合，經(jīng)反應(yīng)后分別檢測(cè)其特異性和擴(kuò)增效率，以篩選最優(yōu)的可用于臨床檢測(cè)的引物和探針組合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上述的引物和探針組合對(duì)牛支原體進(jìn)行檢測(cè)的特異性和靈敏度最優(yōu)，能夠適用于牛支原體氣溶膠樣本的檢測(cè)。而其他的引物和探針組合則不能滿足對(duì)于氣溶膠中牛支原體檢測(cè)的靈敏度要求。

在本申請(qǐng)的另一種實(shí)施方案中，提供了一種用于檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合；還包括：陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對(duì)照和實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)試劑。

所述陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如seqidno.4所示(141個(gè)堿基)的核苷酸片段構(gòu)成的peasy-t3重組質(zhì)粒組成；具體如下：

5'-gacttagttatagctgatggcggtatacaacaagttaatgaagctaaaaaaacgcttaaaacgcttaatataaacatccctgttattggattagtaaaaaatgagtttcacaaaaccaaagccttaattgacctagatatg-3'；(seqidno.4)

所述陰性對(duì)照為peasy-y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

本申請(qǐng)利用taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)牛支原體的含量及其分布情況，預(yù)報(bào)牛支原體發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，為場(chǎng)區(qū)衛(wèi)生消毒試劑的選擇、使用次數(shù)及重點(diǎn)消毒區(qū)域的確定提供參考。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本申請(qǐng)的技術(shù)方案。

480ⅱ熒光定量pcr儀(羅氏公司)，梯度pcr儀(takara公司)，ms-i型多功能微生物采樣器(青島眾瑞智能儀器有限公司)。細(xì)菌基因組dna提取試劑盒(目錄號(hào)：dp302)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(目錄號(hào)：dp209)和高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(目錄號(hào)：dp107)購(gòu)自天跟生化科技(北京)有限公司；peasy-t3載體試劑盒購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。probeqpcrmix試劑盒(codeno.：rr391)、lataq(codeno.：rr02ma)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

無(wú)乳支原體(mycoplasmaagalactiae)pg2株、絲狀支原體絲狀亞種sc型(mycoplasmamycoidessubsp.mycoidessmallcolony，mmmsc)pg1株、絲狀支原體山羊亞種(mycoplasmamycoidessubsp.capri,mmc)pg3株、綿羊肺炎支原體(mycoplasmaovipneumonia，mo)y98株、山羊支原體山羊肺炎亞種(mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae，mccp)87001株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；臨床上確診為牛支原體陽(yáng)性的氣溶膠dna樣本由山東師范大學(xué)反芻動(dòng)物疾病研究中心保存。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的未進(jìn)行具體說(shuō)明試驗(yàn)材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗(yàn)材料，均可通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買得到。

實(shí)施例1：引物與探針的設(shè)計(jì)

參考genebank中牛支原體特異性的uvrc基因(gengbankno.af003959)和oppd基因(gengbankno.af130119.1)，利用primerexpress3.0軟件設(shè)計(jì)七對(duì)特異性引物和探針，具體序列見表1。設(shè)計(jì)引物時(shí)，首先在genebank數(shù)據(jù)上blast了引物設(shè)計(jì)區(qū)域uvrc基因和oppd-oppf基因的保守性，均與現(xiàn)有牛支原體菌株序列100％匹配。再對(duì)設(shè)計(jì)的上下游引物和探針進(jìn)行blast對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均不與其他基因序列相匹配，保證了引物序列的特異性。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選了一對(duì)最佳的引物(如seqidno.1、2所示)和探針(如seqidno.3所示)，由華大基因合成，預(yù)期擴(kuò)增dna產(chǎn)物130bp。

表1牛支原體特異性的引物對(duì)與探針序列

實(shí)施例2：檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體方法的建立及檢測(cè)方法的靈敏性、特異性考察

1、牛支原體uvrc基因部分片段的擴(kuò)增

以牛支原體陽(yáng)性病料dna作為模板，應(yīng)用上游引物mb-141-f：5'-gacttagttatagctgatggcggtatac-3'和下游引物mb-r：5'-catatctaggtcaattaaggctttggt-3'(seqidno.2所示)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μl：10×lapcrbufferii(mg²⁺plus)5μl、2.5mmdntpmixture8μl、lataq0.5μl(5u/μl)、模板2μl，10μmol/l的上、下游引物分別為1μl，滅菌超純水32.5μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)入94℃30s，58℃30s，72℃30s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，最后停止于4℃。對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳鑒定，然后按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行切膠純化。

2、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將回收的目的片斷克隆至peast-t3載體，重組質(zhì)粒送華大基因測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與序列表中seqidno.4所示的序列進(jìn)行比對(duì)，正確的重組質(zhì)粒命名為peast-t3-uvrc。以該質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度為850ng/μl，按照下述公式計(jì)算出每μl質(zhì)粒中的dna拷貝數(shù)為4.0×10¹⁰拷貝/μl。

質(zhì)?？截悢?shù)濃度(copies/μl)＝質(zhì)粒濃度×(6.02×10²³)/dna堿基數(shù)×2×324.5(堿基的平均分子量)

3、taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr的擴(kuò)增條件的建立

設(shè)立上下游引物和探針終濃度梯度為0.1-1.0mol/l，以確定反應(yīng)的最佳引物和探針濃度；設(shè)立溫度梯度為59-62℃，根據(jù)pcr擴(kuò)增結(jié)果，選取最佳退火溫度。以ct最小值、熒光最高值為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)退火溫度、引物濃度、探針濃度、循環(huán)條件進(jìn)行優(yōu)化(接下來(lái)的步驟4中的各項(xiàng)參數(shù)即為優(yōu)化結(jié)果)。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將質(zhì)粒peast-t3-uvrc按10倍進(jìn)行倍比稀釋至4.0×10⁸-4.0×10⁰拷貝數(shù)/μl，以每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(每一濃度平行做3管重復(fù))和待測(cè)樣本為模板進(jìn)行taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl：2×probeqpcrmix10μl，質(zhì)粒peast-t3-uvrc：1μl，濃度為10μmol/l的上游引物和下游引物(分別如seqidno.1、2所示)各0.9μl，濃度為10μmol/l的probe(如seqidno.3所示)0.8μl，rnasefreeddh2o6.4μl。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，進(jìn)行擴(kuò)增，選擇533-580nm波長(zhǎng)的vic通道吸收熒光信號(hào)，反應(yīng)程序如下：

預(yù)變性：95℃30s(升溫速率4.4℃/s)，1cycle。

pcr：分析模式：定量分析，95℃5s(升溫速率4.4℃/s)，60℃30s(升溫速率2.2℃/s，acquisitionmode:single)，45cycles。

降溫：40℃30s(升溫速率2.2℃/s)，1cycle。

如圖1、2所示，根據(jù)待測(cè)樣品中目的基因的拷貝數(shù)，便可以推導(dǎo)出所檢測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的濃度(copies/m³air)。

5、靈敏性檢測(cè)

按照上述步驟4建立的taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)，如圖1所示，每個(gè)擴(kuò)增曲線模板為4.0×10⁸-4.0×10⁰拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，曲線10為陰性對(duì)照，最低檢測(cè)限為4.0拷貝。常規(guī)pcr(引物同定量引物)的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，最低可以觀察到4.0×10¹拷貝數(shù)/反應(yīng)的模板量的電泳條帶，表明taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr比普通pcr的靈敏性高10倍。

6、特異性檢測(cè)

按照上述步驟4建立的taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示，1和2號(hào)曲線分別是以4.0×10⁴拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和牛支原體dna為模板的擴(kuò)增曲線，3-11分別為無(wú)乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種sc型、絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種、溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌和陰性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，均沒有特異性熒光曲線。證實(shí)所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增牛支原體特異性好，與其它菌株無(wú)交叉反應(yīng)。因此，步驟4用mb-f、mb-r和mb-probe建立的taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法可用于鑒定未知樣本是否有牛支原體核酸的存在。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的牛支原體檢測(cè)方法之所以具有靈敏性高(檢測(cè)限達(dá)4.0拷貝/反應(yīng))、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，是基于特殊的靶標(biāo)(uvrc基因)設(shè)計(jì)引物，并對(duì)引物進(jìn)行優(yōu)化篩選而實(shí)現(xiàn)的。目前已報(bào)道的涉及牛支原體分型診斷的保守基因序列有多個(gè)，但如何從眾多的保守基因序列中選擇靶標(biāo)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是方案設(shè)計(jì)的難點(diǎn)所在。

本申請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中以不同的保守基因作為靶標(biāo)區(qū)域，設(shè)計(jì)了多組引物，但在檢測(cè)過(guò)程中有出現(xiàn)與其他細(xì)菌之間的交叉反應(yīng)，檢測(cè)的特異性不如以u(píng)vrc基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的引物。

本申請(qǐng)還以u(píng)vrc基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)了多組引物和不同的探針序列，通過(guò)不同的引物和探針的組合，考察檢測(cè)的靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同引物和探針的組合，其檢測(cè)的靈敏度相差較大，以seqidno.1、2和3所示的引物和探針組合的檢測(cè)靈敏度最優(yōu)，能夠適用于針對(duì)氣溶膠樣本的痕量檢測(cè)的要求；而其他的引物和探針組合的檢測(cè)靈敏度則達(dá)不到氣溶膠痕量檢測(cè)的要求。

實(shí)施例3：用于牛支原體檢測(cè)的試劑盒

試劑盒的組成：實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物和探針組合(seqidno.1、2和3所示)，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對(duì)照和實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)試劑。

所述陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如seqidno.4所示(141個(gè)堿基)的核苷酸片段構(gòu)成的peasy-t3重組質(zhì)粒組成；具體如下：

5'-gacttagttatagctgatggcggtatacaacaagttaatgaagctaaaaaaacgcttaaaacgcttaatataaacatccctgttattggattagtaaaaaatgagtttcacaaaaccaaagccttaattgacctagatatg-3'；(seqidno.4)

所述陰性對(duì)照為peasy-y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

實(shí)施例4：檢測(cè)氣溶膠樣品中牛支原體試劑盒的應(yīng)用

1、牛支原體氣溶膠樣品的制備

在奶牛場(chǎng)的不同環(huán)境中(奶牛舍、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、擠奶廳、產(chǎn)房等)，應(yīng)用ms-ⅰ型空氣微生物采樣箱，通過(guò)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的agi采樣器采集牛支原體氣溶膠樣本。采樣器放置高度為距地面1.5m，然后將30ml含0.01％(v/v)牛血清白蛋白的pbs(ph7.0)注入proton采樣器，同時(shí)滴加一滴橄欖油。將porton沖擊式穩(wěn)流器的一端接到主機(jī)入氣口上，另一端用橡膠管連接到proton采樣器的出氣口上。采樣流量為12.5l/min，采樣時(shí)間為30min。采樣結(jié)束后將采樣器內(nèi)的采集液收集到50ml離心管后低溫保存。

2、氣溶膠模板dna制備

將氣溶膠收集液12000r/min離心10min，棄上清，采用細(xì)菌基因組dna提取試劑盒制備dna模板。以30μlddh2o溶解模板，-20℃存儲(chǔ)備用。

3、taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)

對(duì)采自10個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的10份dna氣溶膠樣本進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同實(shí)施例1中的步驟4，數(shù)據(jù)的收集和擴(kuò)增曲線的生成由定量pcr儀器自帶軟件完成。結(jié)果如表2所示，同時(shí)將上述樣本進(jìn)行常規(guī)pcr檢測(cè)(引物為mb-184-f：5'-taatttagaagctttaaatgagcgc-3'，mb-184-r：5'-aataacagggatgtttatattaagc-3')，結(jié)果如表2所示。

表2不同樣本牛支原體檢測(cè)結(jié)果

上述結(jié)果說(shuō)明本方法能靈敏地檢測(cè)出奶牛場(chǎng)不同環(huán)境氣溶膠中的牛支原體濃度。

以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東師范大學(xué)

<120>一種檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agctgatggcggtatacaacaa22

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

catatctaggtcaattaaggctttggt27

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

acgcttaatataaacatccctgtta25

<210>4

<211>141

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gacttagttatagctgatggcggtatacaacaagttaatgaagctaaaaaaacgcttaaa60

acgcttaatataaacatccctgttattggattagtaaaaaatgagtttcacaaaaccaaa120

gccttaattgacctagatatg141