一株利用木糖高效發(fā)酵乙醇的轉基因工程釀酒酵母SF4的制作方法

本發(fā)明涉及釀酒酵母
技術領域：
，尤其涉及一株利用木糖高效發(fā)酵乙醇的轉基因工程釀酒酵母SF4。
背景技術：
：木糖是秸稈水解產物中含量最豐富的一種五碳糖，但是卻不能被傳統(tǒng)的釀酒酵母所利用。充分將木糖轉化成乙醇是秸稈資源合理有效利用的關鍵性環(huán)節(jié)。應用基因工程構建重組酵母菌株，提高其木糖發(fā)酵能力在理論上完全可行，故近三十年來，國內外已有大量的轉基因工程技術手段應用于改良釀酒酵母的報道，旨在獲得和提高釀酒酵母發(fā)酵木糖的能力。雖已取得一定的進展，但相關轉基因酵母仍然存在以下問題：1、乙醇產率較低；2、乙醇及發(fā)酵抑制物的耐受性不高；3、重組菌株穩(wěn)定性不好；4、高濃度糖的耐受性不高。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術存在的缺點和不足，提供一株利用木糖高效發(fā)酵乙醇的轉基因工程釀酒酵母SF4。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一、轉基因工程釀酒酵母SF4（簡稱釀酒酵母SF4）釀酒酵母SF4是通過寡肽鏈[-(G4S1)3-]鏈接的2個木糖利用酶即木糖還原酶XYL1和木糖醇氧化酶XYL2構成的融合蛋白基因；XYL1的基因序列如SEQIDNO：1，XYL2的基因序列如SEQIDNO：2，融合蛋白的基因序列如SEQIDNO：3；釀酒酵母SF4于2016年10月17日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：中國武漢武漢大學郵編：430072），保藏編號為CCTCCNO：M2016563。該融合蛋白基因被證實不僅能夠使天然不能利用木糖的釀酒酵母獲得利用木糖的能力，能以木糖作為唯一碳源轉化成為乙醇，還能夠在以單一木糖、木糖+葡萄糖或稻草等秸稈水解液的發(fā)酵中，進行高效乙醇發(fā)酵。二、釀酒酵母SF4的獲得方法將木糖代謝途徑中關鍵酶基因木糖還原酶基因xyl1和木糖醇氧化酶基因xyl2通過寡肽-（G4S1）3-DNA序列連接，然后與木酮糖激酶基因xks1一道構建到整合型表達載體pAUR101上，并轉化到高溫釀酒酵母SF7中。對得到的釀酒酵母轉化子進行生長曲線測定，轉錄水平測定，蛋白表達含量測定，酶活測定，木糖唯一碳源發(fā)酵產物含量測定，木糖葡萄糖共發(fā)酵產物含量測定，芒草秸稈材料稀硫酸預處理酶解后發(fā)酵產物含量測定實驗。三、轉基因工程釀酒酵母SF4的應用秸稈是最豐富的資源之一，我國每年未被利用的農作物秸稈資源達5億噸之多；農作物秸稈的基本成分是半纖維素、纖維素和木質素，這三者大約各占30%的比例；傳統(tǒng)的釀酒酵母只能利用其中的纖維素分解產物，這是以秸稈釀造乙醇未能產業(yè)化的重要瓶頸之一。將轉基因工程釀酒酵母SF4應用于秸稈水解產物的乙醇發(fā)酵中；除了具備傳統(tǒng)的釀酒酵母生產菌株對該產物中纖維素分解后的6碳糖高效利用以外，還能夠高效發(fā)酵利用該產物中半纖維素分解后的5碳糖，大大提高對原料資源的利用率。本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果：1、RT-PCR結果表明：融合表達基因xyl1-（G4S1）3-xyl2的SF4菌株中xyl1基因表達比對照明顯增強，SF4菌株xyl2基因表達明顯增強，xks1基因表達中SF4與對照相比無明顯差異；2、SDS-PAGE結果表明：xyl1-(G4S1)3-xyl2表達的融合蛋白有較強表達；3、酶活測定結果表明：XYL1酶活菌株SF4比對照提高0.3倍，XYL2酶活菌株SF4比對照提高17.3倍；4、發(fā)酵生長曲線測定結果表明：重組菌株可以在木糖唯一碳源培養(yǎng)基上生長，其中SF4菌株生長量比對照提高1.5倍；5、木糖唯一碳源發(fā)酵時，SF4利用率可達95%，但其乙醇產量只有4.6%，為理論產量的10%；葡萄糖和木糖共發(fā)酵的發(fā)酵時，SF4菌株木糖利用率達到53.8%；6、芒草材料水解（稀硫酸+酶解）液的乙醇發(fā)酵中，與對照菌株相比，菌株SF4五碳糖利用率提高0.8～0.6倍；乙醇產量菌株SF4提高4.5倍左右。附圖說明圖1是pYPGE15XYL1-(G4S1)1-XYL2和pYPGE15XYL1-(G4S1)3-XYL2載體鑒定，1：pYPGE15，2：pYPGE15XYL1，3：pYPGE15XYL2，4：pYPGE15XYL1-(G4S1)1-XYL2，5：ddH2O，6:pYPGE15，7：pYPGE15XYL1，8：pYPGE15XYL2，9：pYPGE15XYL1-(G4S1)3-XYL2，10：ddH2O，M：2kplus；圖2是pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2菌落PCR鑒定；圖3是pAUR101-XYL1、pAUR101-XYL2、pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2載體質粒酶切檢測，1：pAUR101-XYL1，2：pAUR101-XYL1SacI和ApaI雙酶切，3：pAUR101-XYL2，4：pAUR101-XYL2SacI和ApaI雙酶切，5：pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2，6：pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2SacI和SalI雙酶切，7：Trans2KPlusDNAMarker；圖4是pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2-XKS1菌落PCR和雙酶切鑒定，A中，1-3：XKS1a/W3F，4、8：ddH2O；B中，xyl2a/W2F；圖5是SF7酵母轉化子鑒定，A中，1-2：SF-CK，3：pAUR101，4：SF7，5：SF1，6：ddH2O；B中，1-2：SF71，3：pA101-XYL1，4-5：SF72，6：pA101-XYL2，7-8：SF73，9：pA101-XKS1，10：SF7，11：ddH2O；圖6是SF7酵母轉化子鑒定，A中，1-2：SF4，3：pA-XYL1-(G4S1)3-XYL2XKS1，4：SF7，5：ddH2O；B中，1-4：SF5，5：pA1-XYL2XYL1XKS1，6：SF7，7：ddH2O；圖7是XYL1、XYL2和XKS1基因表達RT-PCR分析；圖8是XYL1、XYL2和XKS1共表達鑒定；圖9是XYL1、XYL2和XKS1整合型表達鑒定；圖10是轉基因酵母與對照菌株在20g/L木糖唯一碳源發(fā)酵37℃時生長曲線；圖11是20g/L木糖唯一碳源限氧發(fā)酵木糖含量測定。釀酒酵母SF4于2016年10月17日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：中國武漢武漢大學郵編：430072），保藏編號為CCTCCNO：M2016563。具體實施方式下面結合附圖和實施例詳細說明：一、釀酒酵母SF4的應用步驟SF4→甘油管保存菌種→YPD培養(yǎng)基（2%葡萄糖、1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.03g腺嘌呤、固體添加2%瓊脂）斜面活化→YPD培養(yǎng)基液體三角瓶種子→按照0.1～0.5%量接入秸稈水解液或木糖溶液中→靜止發(fā)酵48～72小時→發(fā)酵液80～100℃蒸餾→冷卻得到乙醇。二、重組菌株構建、驗證的方法與技術路線序列表顯示的是SF4中包含有xyl1-(G4S1)3-xyl2基因的核苷酸序列（序列5）。1、SF4的構建及其功能的驗證1）pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2載體構建由于構建此融合蛋白需要在兩個蛋白質中間加入一段（G4S1）1作為連接肽（序列4），因此設計了如下引物：FP1-1Fi：5’-CCGGAATTCATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’（序列6）；FP1-1Ri：5’-CGGGGTACCACCACCAACAAAGATTGGAATGTTGTC-3’（序列7）；FP2-1Fi：5’-CGGGGTACCGGTGGTTCTATGACTGCAAACCCATCCTTAG-3’（序列8）；FP2-1Ri：5’-CGGGGTACCCTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’（序列9）；FP1-1上游引物引入EcoRI酶切位點，下游引物引入KpnI酶切位點；FP2-1上游和下游引物均引入KpnI酶切位點。以熱帶假絲酵母基因組DNA為模板，采用FP1-1引物，用KODPlus高保真酶擴增XYL1基因（序列1），Tm=56℃，延伸1.5min，回收此PCR產物，同時提取載體pYPGE15質粒，將擴增片段和載體分別用EcoRI和KpnI雙酶切4h，瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶并回收，16℃連接過夜，轉化DH5α，采用P15a和P15s引物檢測陽性轉化子pYPGE15XYL1（FP1-1）。XYL2基因（序列2）克隆以熱帶假絲酵母基因組DNA為模板，采用FP2-1引物，用KODPlus高保真酶進行PCR擴增，Tm=53℃，延伸1.5min，回收此擴增產物，同時提取pYPGE15XYL1（FP1-1）轉化子質粒，將基因和該轉化子用KpnI單酶切2h，再將單酶切的轉化子去磷酸化以防止其自連，瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶并回收，16℃連接過夜，轉化DH5α，采用P15a和P15s引物檢測陽性轉化子pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2(見圖1)。2）pYPGE15XYL1-（G4S1）3-XYL2載體構建此融合蛋白需要在兩個蛋白質中間加入（G4S1）3片段作為連接肽，連接肽引物如下：FP1-3Fi：5’-CCGGAATTCATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’（序列10）FP1-3Ri：5’-CGGGGTACCACCACCAGAACCACCACCACCAACAAAGATTGGAATGTGTC-3’（序列11）FP2-3Fi：5’-CGGGGTACCGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGACTGCAACCCATCCTTAG-3’（序列12）FP2-3Ri:5’-CGGGGTACCCTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’（序列13）此載體與pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2的構建方法一樣，但基因XYL1和基因XYL2的克隆分別采用FP1-3和FP2-3引物（見圖2）。3）pAUR101-XYL1-（G4S1）3-XYL2載體構建首先采用pYPGE15-132s/XYL2a引物從pYPGE15XYL1-（G4S1）3-XYL2載體構建載體上克隆PGK-XYL1-(G4S1)3-XYL2-CYC1（2757bp）片段（序列5），上游引入SalI，回收KODPlusPCR產物，同時提取空載體pAUR101質粒，將基因片段和載體分別用SacI和SalI雙酶切4h，瓊脂糖凝膠電泳后用切口刀片切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠，再用DNA回收試劑盒回收目的片段，加入DNA連接酶后16℃過夜連接，轉化DH5α；采用pA-F和pA-R引物檢測陽性轉化子，如圖2所示，目的片段大小3089bp；同時，用SacI和ApaI雙酶切分別雙酶切pAUR101-XYL1和pAUR101-XYL2，用SacI和SalI雙酶切pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2，如圖3所示，結果與預期大小一致。4）pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2-XKS1的大腸桿菌轉化子的獲得提取載體pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2和pAUR101-XKS1質粒，同時用Sse8387I和SphI雙酶切4h，瓊脂糖凝膠電泳后用切口刀片切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠，再用DNA回收試劑盒回收目的片段，加入DNA連接酶后16℃過夜連接，轉化DH5α；采用xyl2a/W2F和XKS1a/W3F引物檢測陽性轉化子結果如圖4A所示，目的片段大小分別為1780bp和2796bp，與預期的結果一致。同時提取pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2-XKS1質粒，采用XKS1a/W3F引物質粒PCR，結果如圖4B所示，目的片段大小1848bp（序列3），與預期的結果一致。5、酵母轉化及鑒定將構建好的整合型表達載體轉化高溫釀酒酵母SF7，用AbA篩選到陽性轉化子后再提取酵母基因組DNA進行PCR鑒定。5.1、中間載體轉化子鑒定（載體引物pAF/pAR）采用載體引物pAF/pAR對空載體菌株SF7-CK基因組DNA進行PCR鑒定，結果如圖5A所示，目的片段大小436bp，與預期的結果一致。采用載體引物pAF/pAR分別對中間載體SF1、SF2、SF3菌株基因組DNA進行PCR鑒定，結果如圖5B所示，目的片段大小分別為1978bp、2084bp、2834bp，與預期的結果一致。5.2、終載體轉化子鑒定（基因-載體交叉引物）分別采用RHP13F/pAR、W2F/pAR、XKS1a/W4F對終載體菌株SF4基因組DNA進行PCR鑒定，結果如圖6A所示，目的片段大小分別為1649bp、2418bp、1427bp，結果與預期的一致。分別采用XYL1a/W1F、W2F/pAR、XKS1a/W4F，結果如圖6B所示，目的片段大小分別為849bp、1572bp、1427bp，結果與預期的一致。6、RT-PCR檢測目的基因的表達采用液氮研磨法破碎酵母細胞壁后，再利用Tranzol試劑提取酵母總RNA，反轉錄為cDNA，以酵母內源組成型表達的Actin基因作為內參基因，分別對XYL1、XYL2、XKS1進行RT-PCR分析。結果與分析：如圖7所示，SF4菌株中XYL1基因表達比對照明顯增強，而SF5則無變化，SF4、SF5號菌株XYL2基因表達明顯增強，XKS1基因表達中SF4號比對照稍弱，SF5號比對照稍強，分析可能原因是SF4號菌株中加入融合蛋白，導致XKS1基因表達量降低，上述結果與蛋白表達結果（SDS-PAGE）一致。7、SDS-PAGE檢測目的蛋白提取酵母總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，制備蛋白質濃度為1.0mg/mL的蛋白樣品。制備12%分離膠，5%濃縮膠，總蛋白上樣量20μg。結果與分析：如圖8和圖9所示，與對照菌株SF7-CK相比，單個基因及多基因串聯(lián)表達（XYL1、XYL2、XKS1）的載體菌株的蛋白表達量均沒有明顯變化，而融合表達載體菌株XYL1-(G4S1)3-XYL2有較強的蛋白表達。分析可能原因是整合性表達拷貝數太低，導致單位時間內的蛋白表達量較弱。8、XR（木糖還原酶）和XDH（木酮糖氧化酶）酶活測定8.1、XR酶活測定XR酶活測定結果表明，重組菌株SF4的XR酶活達到0.0078U/mg，比對照SF-CK（0.006U/mg）提高了0.3倍。8.2XDH酶活測定XDH酶活測定結果表明，重組菌株SF4的XDH酶活達到0.11U/mg，比對照菌株（SF-CK，XDH酶活為0.006U/mg）提高了17.3倍。9、YPX限氧發(fā)酵9.1、生長曲線以20g/L木糖為唯一碳源限氧發(fā)酵時，菌株在60h時進入對數期(圖10)，120h進入穩(wěn)定期，OD值趨于穩(wěn)定，其中對照菌株SF-CKOD值為0.96，SF4號菌株為2.4，比對照提高1.5倍。9.2、20g/L木糖唯一碳源限氧發(fā)酵過程中木糖含量（圖11）發(fā)酵144h后，對照菌株木糖殘留濃度為17.4g/L，木糖利用率僅為13%，SF4木糖殘留濃度僅為0.8g/L，木糖利用率為96%，比對照提高6.4倍。10、YPX-YPDX厭氧發(fā)酵以45g/L木糖為唯一碳源以及45g/L木糖和45g/L葡萄糖共發(fā)酵，在37℃厭氧條件下發(fā)酵5天，蒸餾出乙醇后，采用比色法測定殘留五碳糖，重鉻酸鉀法測定乙醇含量。10.1、發(fā)酵后殘留木糖含量1）45g/L木糖唯一碳源厭氧發(fā)酵后，對照菌株SF-CK木糖殘留濃度為39.0g/L，SF4號菌株為2.2g/L，SF4殘留的五碳糖含量與對照菌株SF-CK相比有顯著性提高。2）45g/L木糖和45g/L葡萄糖厭氧共發(fā)酵后，對照菌株SF-CK木糖殘留量為36.8g/L，SF4號菌株為20.8g/L。重組菌株SF4與對照菌株SF-CK相比均有顯著性的提高。10.2、木糖利用率1）45g/L木糖唯一碳源發(fā)酵后，對照菌株SF-CK木糖利用率為13.3%，重組菌株SF4為95.1%，比對照菌株提高了6.2倍。2）45g/L木糖和45g/L葡萄糖厭氧共發(fā)酵后，對照菌株SF-CK木糖利用率為18.3%，重組菌株SF4為53.8%，比對照提高1.9倍。11、乙醇產率11.1、45g/L木糖唯一碳源發(fā)酵后，對照菌株SF-CK乙醇產率為1.2%，重組菌株SF4為4.6%，比對照菌株提高2.8倍。11.245g/L木糖和45g/L葡萄糖厭氧共發(fā)酵后，對照菌株SF-CK乙醇產率為15.6%,重組菌株SF4為21.8%，比對照提高0.4倍。三、轉基因釀酒酵母的發(fā)酵、培養(yǎng)和檢測1、YPX-YPDX發(fā)酵實驗1）45g/LYPX-YPDX培養(yǎng)基的配制A、45g/LYPX:18mL2%YP（2%Yeastextract，1%Tryptone），加5MHcl調節(jié)pH至4.8，過濾滅菌的2mL45g/100mLxylose。B、45g/LYPDX:16mL2%YP（2%Yeastextract，1%Tryptone）加5MHCl調節(jié)pH至4.8，過濾滅菌的2mL45g/100mLxylose和2mL45g/100mLglucose。2）接種于發(fā)酵收集適量YPD培養(yǎng)的酵母，蒸餾水洗滌三次接種至上述培養(yǎng)基中，初始OD600=15（稀釋50倍后為0.3），37℃,100r,發(fā)酵4d。2、芒草秸稈分解（稀硫酸預處理-酶解）液的乙醇發(fā)酵1）預處理A、稱取已烘干至恒重的芒草秸稈粉末1.00g于15mL離心管中，平行三份。（本實驗18份）。B、向離心管中加入1%硫酸（v/v）8.0mL，充分搖勻后放入高壓鍋中滅菌，120℃反應20min。冷卻后取出，再放入50℃搖床，150r搖2h。C、取出冷卻至室溫，3000g離心5min，取上清100uL于1.5mL離心管（直接稀釋10倍），4℃保存。2）中和-滅菌A、向15mL離心管中加入8%氫氧化鈉（v/v），調節(jié)pH至4.8，混勻（預實驗確定NaOH用量，大約1mL）。B、將混合液轉入已稱重的50mL三角瓶，用pH4.8的磷酸緩沖液潤洗至總重量增加19.0g。C、將三角瓶放入高壓滅菌鍋中，120℃反應20min，冷卻后取出。3）酶解A.在超凈工作臺中向三角瓶中加入1.0mL，40g/L的纖維素復合酶溶液（終濃度2g/L，滅菌磷酸Buffer配制），放入搖床，150r，50℃酶解48h。B.酶解完成后取出，取上清150uL，3000g離心5min，取上清100uL,（直接稀釋10倍），4℃保存。4）發(fā)酵A、將YPD培養(yǎng)36h的3種酵母菌株分別接種，接種量為OD600=15.0，37℃發(fā)酵4d。B、取發(fā)酵液1mL，3000g離心5min，取上清100uL，稀釋10倍，4℃保存。5）蒸餾發(fā)酵完成后，加入30mL單蒸水，蒸餾，取蒸餾液10mL，比色法測定乙醇含量。3、發(fā)酵產物測定發(fā)酵過程中的葡萄糖采用硫酸-蒽酮法測定，木糖采用苔黑酚法測定，乙醇采用重鉻酸鉀法測定。1）葡萄糖含量測定分別取1.00mg/mL葡萄糖標準溶液2.0，4.0，6.0，8.0mL，10.0mL定容至100mL，再分別取上述各溶液1.0mL于10mL具塞玻璃試管中，加入2.0mL硫酸蒽酮試劑（0.2g蒽酮溶于100mL濃硫酸）快速搖勻，沸水中加熱5min,自來水冷卻至室溫，620nm比色。1mL的蒸餾水作空白樣品。2）木糖含量測定取1.00mg/mL木糖標準溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL于100mL容量瓶中，加水定容，再分別取上述各溶液1.0mL于10mL具塞玻璃試管中，先加入134μLA試劑（A=6g苔黑酚溶于100mL無水乙醇中），再加入2mLB試劑（B=0.1gFeCl3溶于100mL37%濃鹽酸中），混勻后，沸水中加熱20min，自來水冷卻至室溫，660nm比色，1mL的蒸餾水作空白樣品。3）乙醇產率的測定取1mL乙醇樣品，向其中加入2mL5%K2Cr2O7后混勻，沸水浴10min后自來水冷卻至室溫，再加入7mL單蒸水至總體積為10mL，600nm比色，1mL蒸餾水做空白樣品。定義乙醇的產率為發(fā)酵后產生乙醇的質量和發(fā)酵底物中葡萄糖（木糖）的質量的比值。四、應用1、轉基因酵母菌株以芒草材料的發(fā)酵從本實驗大量芒草材料中挑取一對纖維素和木質素含量相近，半纖維素含量差異較大兩種材料，分別命名高材料（H）和低材料（L），用1%稀硫酸預處理后加入纖維素酶酶解48h,再接種酵母，37℃厭氧發(fā)酵5天，比色法測定木糖含量，重鉻酸鉀法測定乙醇濃度。1.1、芒草材料原樣成分本研究根據芒草材料原樣成分分析結果，選取了一對芒草材料，如表1所示，這一對材料的總纖維素和總木質素含量近似相同，但是半纖維素含量差異較大，稀硫酸預處理酶解后五碳糖（主要是木糖）含量差異也較大。表1芒草材料原樣成分分析品名編號總半纖維素總纖維素總木質素低材料（L）芒602629.1825.20高材料（H）南荻13034.3628.4725.661.2、芒草材料發(fā)酵后殘留五碳糖無論高材料是還是低材料，重組菌株SF4發(fā)酵后五碳糖含量殘留最少，分別只有1.7mg/mL和1.8mg/mL，而對照菌株則分別為5.4mg/mL和7.1mg/mL。1.3、芒草材料發(fā)酵后的五碳糖利用率重組菌株SF4五碳糖利用率高低材料分別為87%和85%，分別比對照提高0.8倍和0.6倍。1.4、芒草材料發(fā)酵后的乙醇產率重組菌株SF4最終乙醇產率高低材料分別為8.8%和8.0%，分別比對照菌株提高4.5倍和0.6倍。1.5、小結與分析：由以上結果可知，菌株SF4可以利用預處理酶解后的芒草材料發(fā)酵生成乙醇，五碳糖利用率最高可達87%。序列表<110>華中農業(yè)大學<120>一株利用木糖高效發(fā)酵乙醇的轉基因工程釀酒酵母SF4<140><141><160>13<210>1<211>975<212>DNA-基因xyl1的核苷酸序列<400>Atgtctactactcctactattcctaccattaaattaaactctggttatgaaatgccattagttggtttcggatgttggaaagtcaataatgaaactgctgctgaccaaatctacaatgctatcaaaactggttacagattatttgatggtgctgaagattacggtaatgaaaaagaagttggtgaaggtattaacagagccattaaagaaggattagttaaaagagaagaattattcatcacttctaaattatggaacaatttccatgatccaaagaatgttgaaactgctttaaacaaaactttaagtgacttgaacttggactatgttgatttattcttgattcattttccaattgcttttaaatttgttccaattgaagaaaaatacccacctggtttctactgtggtgatggtgataacttccactatgaagatgttccattattagatacttggaaagctttggaaaaattggttgaagctggtaagatcaaatctattggtatttccaattttactggtgctttgatttacgatttgatcagaggtgctactatcaaaccagctgttttacaaattgaacatcacccatacttgcaacaaccaaaattgattgaatatgttcaaaaagctggtattgccattactggttactcttcatttggtccacaatcattcttggaattggaatccaagagagctttgaacaccccaactttatttgaacatgaaa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