一種抑制人黑色素瘤RBM3基因表達(dá)的siRNA及其質(zhì)粒載體的制作方法

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna及其質(zhì)粒載體。

背景技術(shù)：

黑色素瘤，又稱惡性黑色素瘤，是來源于黑色素細(xì)胞的一類惡性腫瘤，常見于皮膚，亦見于黏膜、眼脈絡(luò)膜等部位。它是一種由來源于神經(jīng)脊的黑色素細(xì)胞異常增生而產(chǎn)生的惡性皮膚腫瘤，具有極高的轉(zhuǎn)移性，而且對一般化療有抗性。因此盡管黑色素瘤的發(fā)病率在皮膚癌中只排第三位，但它的致死率卻是最高的，在所有皮膚癌致死的病人中，有近80％的病人死于黑色素瘤。黑色素瘤是皮膚腫瘤中惡性程度最高的瘤種，有效阻斷黑色素瘤細(xì)胞增殖可為黑色素瘤的治療提供大力幫助。

rna干涉(rnainterfering，rnai)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種抑制基因表達(dá)的最有力的工具之一。此技術(shù)采用19-23個堿基或發(fā)夾狀不同長度的雙鏈rna(sirna)可使不同類型細(xì)胞的靶向基因表達(dá)明顯降低，因此，rnai技術(shù)可使基因表達(dá)下調(diào)。這是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默。這種新興的生物技術(shù)為疾病分子水平的治療提供了新的技術(shù)和方法，在哺乳動物細(xì)胞中建立rna干涉技術(shù)，可以用于研究某些特定基因的功能，從而可以解決某些疾病的發(fā)病機(jī)制，同時對疾病尤其是對腫瘤的治療也有一定的應(yīng)用價值，并且rna干涉技術(shù)所使用的劑量僅為反義寡核苷酸劑量的萬分之一左右。另一方面，若小雙鏈rna中改變1個核苷酸，就可使該rnai靶向基因沉默作用消失，這樣，就有可能將這一技術(shù)用于抑制某些過度表達(dá)基因的表達(dá)，而不影響正常基因的表達(dá)，因此，利用rna干擾技術(shù)制備基因藥物將是一種有效的途徑。

在環(huán)境溫度發(fā)生明顯改變時(如冬眠)，生物體會產(chǎn)生某種蛋白來調(diào)節(jié)機(jī)體功能，以適應(yīng)溫度變化。比如，在環(huán)境溫度降低時機(jī)體會在低溫的刺激下產(chǎn)生一些蛋白來適應(yīng)環(huán)境變化，該類蛋白統(tǒng)稱為“冷休克蛋白”(coldshockproteins)。rna結(jié)合蛋白rbm3是一種十分重要的冷休克蛋白，其分子量約17kda。目前研究顯示，除低溫外，其他壓力因素如低氧亦可刺激細(xì)胞表達(dá)rbm3蛋白。腫瘤組織中，低氧水平致使rbm3編碼的蛋白的總量上升，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖不受控制，并最終加速腫瘤的形成，如乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌及前列腺癌等，因此rbm3還被認(rèn)為是一種癌基因。研究者采用sirna技術(shù)來“沉默”rbm3的基因表達(dá)，來降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)rbm3的水平，進(jìn)而來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。但癌基因rbm3是否影響黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力尚不清楚，同時目前尚無專門用于抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的rnai技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna，同時還提供了該sirna表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，并發(fā)現(xiàn)癌基因rbm3表達(dá)水平下調(diào)可顯著抑制人黑素瘤細(xì)胞的體外增殖。

本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna，所述sirna能夠抑制人黑色素瘤rbm3基因的表達(dá)，正義鏈序列為seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4或seqno.5中任意一個所示的序列。

進(jìn)一步地，所述sirna正義鏈序列為seqno.1或seqno.5中任意一個所示的序列。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含能夠抑制人rbm3基因表達(dá)的sirna；所述sirna的正義鏈序列為seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4或seqno.5中任意一個所示的序列。

進(jìn)一步地，所述sirna正義鏈序列為seqno.1或seqno.5中任意一個所示的序列。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)sirna對應(yīng)的dna序列的合成

根據(jù)序列表中任何一個sirna的正義鏈序列，設(shè)計其對應(yīng)的dna序列，序列兩端引入酶切位點(diǎn)，所述dna序列為兩條單鏈，并且兩條單鏈?zhǔn)且粚パa(bǔ)序列，設(shè)計好的序列經(jīng)合成后，通過退火形成雙鏈dna；

2)psilencer3.1-puro-sirna載體的構(gòu)建

將psilencer3.1-puro載體使用步驟1)中所述的兩個限制性內(nèi)切酶ecori和hindiii進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，然后將回收的目的片段與步驟1)中形成的雙鏈dna序列連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽性菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，即可，將經(jīng)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為psilencer3.1-puro-sirna載體。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體在抑制黑色素瘤增殖藥物方面的應(yīng)用，所述質(zhì)粒載體含有能夠產(chǎn)生特異性抑制人rbm3基因表達(dá)的sirna；所述的sirna的正義鏈序列為seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4和seqno.5中任意一個所示的序列。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的抑制人黑色素瘤細(xì)胞中rbm3基因表達(dá)的sirna，可以有效抑制黑色素瘤細(xì)胞的體外增殖，為黑色素瘤的藥物治療提供新的靶點(diǎn)，為治療黑色素瘤提供了一定的理論基礎(chǔ)和可行的藥物。

附圖說明

圖1為sirna表達(dá)質(zhì)粒對rbm3的基因沉默效果分析；

圖2為rbm3基因沉默對人黑色素瘤細(xì)胞體外增殖的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna，所述sirna能夠抑制人黑色素瘤rbm3基因的表達(dá)，正義鏈序列為seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4或seqno.5中任意一個所示的序列。

進(jìn)一步地，所述sirna正義鏈序列為seqno.1或seqno.5中任意一個所示的序列。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含能夠抑制人rbm3基因表達(dá)的sirna；所述sirna的正義鏈序列為seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4或seqno.5中任意一個所示的序列。

進(jìn)一步地，所述sirna正義鏈序列為seqno.1或seqno.5中任意一個所示的序列。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)sirna對應(yīng)的dna序列的合成

根據(jù)序列表中任何一個sirna的正義鏈序列，設(shè)計其對應(yīng)的dna序列，序列兩端引入酶切位點(diǎn)，所述dna序列為兩條單鏈，并且兩條單鏈?zhǔn)且粚パa(bǔ)序列，設(shè)計好的序列經(jīng)合成后，通過退火形成雙鏈dna；

2)psilencer3.1-puro-sirna載體的構(gòu)建

將psilencer3.1-puro載體使用步驟1)中所述的兩個限制性內(nèi)切酶ecori和hindiii進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，然后將回收的目的片段與步驟1)中形成的雙鏈dna序列連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽性菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，即可，將經(jīng)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為psilencer3.1-puro-sirna載體。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體在抑制黑色素瘤增殖藥物方面的應(yīng)用，所述質(zhì)粒載體含有能夠產(chǎn)生特異性抑制人rbm3基因表達(dá)的sirna；所述的sirna的正義鏈序列為seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4和seqno.5中任意一個所示的序列。

圖1為sirna表達(dá)質(zhì)粒對rbm3的基因沉默效果分析。將5種人rbm3基因特異性的sirna表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人黑色素瘤細(xì)胞系(a375)，2天后將細(xì)胞裂解取全蛋白進(jìn)行western印跡分析，β-actin作為內(nèi)參。結(jié)果顯示編號為seqno.1和seqno.5的sirna可強(qiáng)烈抑制rbm3基因在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)。

圖2為rbm3基因沉默對人黑色素瘤細(xì)胞體外增殖的影響。將2種人rbm3基因特異性的sirna表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人黑色素瘤細(xì)胞系(a375)，分別于第1天，第2天，第3天和第4天用mtt法測量rbm3基因沉默對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示這兩種sirna表達(dá)質(zhì)粒均可以有效地抑制人黑色素瘤細(xì)胞的體外增殖。

實(shí)施例1

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna，所述sirna能夠抑制人黑色素瘤rbm3基因的表達(dá)，正義鏈序列為seqno.1所示的序列。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含能夠抑制人rbm3基因表達(dá)的sirna；所述sirna的正義鏈序列為seqno.1所示的序列。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于：所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)sirna對應(yīng)的dna序列的合成

根據(jù)序列表中sirna的正義鏈序列seqno.1，設(shè)計其對應(yīng)的dna序列，序列兩端引入酶切位點(diǎn)，所述dna序列為兩條單鏈，并且兩條單鏈?zhǔn)且粚パa(bǔ)序列，設(shè)計好的序列經(jīng)合成后，通過退火形成雙鏈dna；

2)psilencer3.1-puro-sirna載體的構(gòu)建

將psilencer3.1-puro載體使用步驟1)中所述的兩個限制性內(nèi)切酶ecori和hindiii進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，然后將回收的目的片段與步驟1)中形成的雙鏈dna序列連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽性菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，即可，將經(jīng)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為psilencer3.1-puro-sirna載體。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體在抑制黑色素瘤增殖藥物方面的應(yīng)用，所述質(zhì)粒載體含有能夠產(chǎn)生特異性抑制人rbm3基因表達(dá)的sirna；所述的sirna的正義鏈序列為seqno.1所示的序列。

試驗(yàn)結(jié)果表明：1)rbm3sirna抑制基因表達(dá)分析

參考圖1，seqno.1的sirna表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人黑色素瘤細(xì)胞系(a375)后2天，westernblot分析其對rbm3基因表達(dá)的抑制效果。結(jié)果顯示seqno.1幾乎完全抑制rbm3基因的表達(dá)。

2)rbm3sirna對人黑色素瘤細(xì)胞體外增殖的影響

參考圖2，seqno.1的sirna表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人黑色素瘤細(xì)胞系(a375)后1-4天，用mtt法檢測其對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示seqno.1的sirna可顯著抑制人黑色素瘤細(xì)胞的體外增殖。

實(shí)施例2

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna，所述sirna能夠抑制人黑色素瘤rbm3基因的表達(dá)，正義鏈序列為seqno.5所示的序列。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含能夠抑制人rbm3基因表達(dá)的sirna；所述sirna的正義鏈序列為seqno.5所示的序列。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于：所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)sirna對應(yīng)的dna序列的合成

根據(jù)序列表中sirna的正義鏈序列seqno.5，設(shè)計其對應(yīng)的dna序列，序列兩端引入酶切位點(diǎn)，所述dna序列為兩條單鏈，并且兩條單鏈?zhǔn)且粚パa(bǔ)序列，設(shè)計好的序列經(jīng)合成后，通過退火形成雙鏈dna；

2)psilencer3.1-puro-sirna載體的構(gòu)建

將psilencer3.1-puro載體使用步驟1)中所述的兩個限制性內(nèi)切酶ecori和hindiii進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，然后將回收的目的片段與步驟1)中形成的雙鏈dna序列連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽性菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，即可，將經(jīng)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為psilencer3.1-puro-sirna載體。

一種抑制人黑色素瘤rbm3基因表達(dá)的sirna的質(zhì)粒載體在抑制黑色素瘤增殖藥物方面的應(yīng)用，所述質(zhì)粒載體含有能夠產(chǎn)生特異性抑制人rbm3基因表達(dá)的sirna；所述的sirna的正義鏈序列為seqno.5所示的序列。

試驗(yàn)結(jié)果表明：

1)rbm3sirna抑制基因表達(dá)分析

參考圖1，seqno.5的sirna表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人黑色素瘤細(xì)胞系(a375)后2天，western印跡分析其對rbm3基因表達(dá)的抑制效果，結(jié)果顯示seqno.5可顯著抑制rbm3基因的表達(dá)，抑制率大于85％。

2)rbm3sirna對人黑色素瘤細(xì)胞體外增殖的影響

參考圖2，seqno.5的sirna表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人黑色素瘤細(xì)胞系(a375)后1-4天，用mtt法檢測其對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示seqno.5的sirna可顯著抑制人黑色素瘤細(xì)胞的體外增殖，抑制率大于95％。

所述sirna的正義鏈序列可以用seqno.2、seqno.3、seqno.4的序列進(jìn)行替換。