一種從L?鳥氨酸發(fā)酵液中提取L?鳥氨酸鹽酸鹽的方法與流程

本發(fā)明屬于生物化工領域，具體涉及一種從L-鳥氨酸發(fā)酵液中提取L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法。

背景技術：

L-鳥氨酸是人體代謝中必不可少的中間代謝產物，是一種堿性氨基酸。L-鳥氨酸是活細胞中重要的代謝化合物，是細菌細胞膜和多肽類抗生素的組成成分，但并不參與蛋白質的合成，而是以游離態(tài)存在。它主要參與生物體內的尿素循環(huán)，用于生物體內瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、多胺的生物合成，對于體內氨態(tài)氮的排出有重要作用。其多功能保健作用使得近年L-鳥氨酸產品的開發(fā)逐漸升溫，在醫(yī)藥、保健領域及化學工業(yè)的應用也日益廣泛，前景看好。

L-鳥氨酸的生產方法主要包括有機合成法、精氨酸酶解法和微生物直接發(fā)酵法，其中有機合成法存在污染嚴重、副產物多、提純難度大等缺陷，已逐步淘汰。酶解法利用L-精氨酸酶水解L-精氨酸，得到產物L-鳥氨酸和尿素，該法專一性強，L-精氨酸酶易于獲得，反應條件溫和，但是直接采用L-精氨酸原料，導致生產成本居高不下。微生物直接發(fā)酵法是獲取L-鳥氨酸的重要來源，相比其他方法，發(fā)酵法的原料成本較低、產量較高、同時，通過基因工程方法對菌種進行定向改造，從源頭上提高了L-鳥氨酸的產量，目前用于產生L-鳥氨酸的菌種主要為谷氨酸棒桿菌的精氨酸缺陷型菌株。但是微生物在代謝產生的L-鳥氨酸發(fā)酵液中包含部分雜質氨基酸、糖、蛋白質、色素、無機鹽等雜質成分，給分離提純L-鳥氨酸帶來了一定的困難。由于L-鳥氨酸水溶性極高，因此一般將其轉化為溶解度較小的L-鳥氨酸鹽酸鹽作為產品，現(xiàn)有的L-鳥氨酸鹽酸鹽提取方法主要針對雜質較少的酶解法生產體系。針對的發(fā)酵液體系的L-鳥氨酸鹽酸鹽的提取方法也有報道，一般需要經過微濾除菌體、離子交換除雜、脫色、濃縮結晶等幾個步驟，其中脫色過程一般使用粉末活性炭在偏酸性條件下進行間歇式脫色，處理周期長，活性炭用量大且不能重復利用，導致提取成本大大增加。也有采用納濾膜脫色的報道，但是納濾膜對L-鳥氨酸具有較強的截留能力，需要采用滲濾操作方可提高收率，導致產品被稀釋，增加了后期濃縮能耗。由此可見開發(fā)一種工藝簡單能進行連續(xù)化操作且成本較低的L-鳥氨酸鹽酸鹽提取方法將促進微生物直接發(fā)酵法制備L-鳥氨酸技術用于規(guī)模化生產。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種從L-鳥氨酸發(fā)酵液中提取L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，以解決現(xiàn)有技術存在的處理周期長和成本較高等問題。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種從L-鳥氨酸發(fā)酵液中提取L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，它包括如下步驟：

(1)將L-鳥氨酸發(fā)酵液調節(jié)pH至6.0～6.5后進行微濾處理，除去其中的菌體細胞和顆粒物，收集微濾液；

(2)將步驟(1)中所得的微濾液進行超濾處理，除去其中的雜蛋白和部分色素，收集超濾透過液；

(3)將步驟(2)中所得的超濾透過液加熱至60～70℃后，以3～6BV/h的流速泵入活性炭層析柱進行脫色；在430nm下，以純水為參比，檢測層析柱流出液的透射比，當流出液的透光率低于97％時，停止上柱脫色，收集脫色液；

(4)將步驟(3)中所得的脫色液調節(jié)pH后，采用陽離子交換樹脂層析柱進行吸附，收集完成吸附的離子交換柱進行洗脫處理，所得洗脫液經減壓濃縮蒸氨，得到濃縮液；

(5)將步驟(4)中所得濃縮液降至室溫，加入30～36wt％的鹽酸水溶液進行酸化反應后，代替步驟(2)中所得的超濾液，重復步驟(3)中操作，收集得到二次脫色液；

(6)向步驟(5)中所得的二次脫色液中加入乙醇進行L-鳥氨酸鹽酸鹽結晶；乙醇加入完畢后，養(yǎng)晶4～6h，過濾并真空干燥后，即得L-鳥氨酸鹽酸鹽晶體。

其中，BV是指相對應的單柱所填充的吸附劑床層體積。

步驟(1)中，所述的L-鳥氨酸發(fā)酵液中，L-鳥氨酸的濃度為30～50g/L，色素的含量在430nm下，以純水為參比，透射比為15～30％。

步驟(1)中，調節(jié)pH所用試劑為30～36wt％的鹽酸。

步驟(1)中，所述的微濾處理是采用孔徑為0.2～0.5微米的管式陶瓷膜進行微濾，操作溫度為20～40℃，操作壓力0.05～0.3Mpa。

步驟(2)中，所述的超濾處理是采用截留分子量為5000道爾頓的卷式有機膜進行超濾，操作溫度為20～40℃，操作壓力0.2～0.4Mpa。

步驟(3)中，所述的活性炭層析柱為玻璃或不銹鋼柱，外帶夾套可通入熱水進行保溫，柱內活性炭床層的高徑比為8～12：1，優(yōu)選10：1；其中，所述的活性炭為果殼基顆?；钚蕴?，顆粒粒徑為30～70目。

步驟(3)中，超濾液以3～6BV/h的流速泵入活性炭層析柱進行脫色，且脫色過程中保持溫度為60～70℃。

步驟(3)中，停止上柱脫色并收集脫色液后，可用3BV體積的60℃去離子水以3～5BV/h的流速沖洗活性炭層析柱，收集前段流出的1BV體積的流出液，并與后批次的L-鳥氨酸發(fā)酵液合并，繼續(xù)用于脫色；將完成脫色的活性炭層析柱進行再生，用于下一次脫色。

其中，柱層析的再生方法為：用60℃的0.5mol/L NaOH溶液作為再生劑，以2BV/h的流速沖洗層析柱，NaOH溶液用量為3BV；再用60℃的去離子水以4BV/h的流速沖洗層析柱，直至流出液的pH值為7.0。

步驟(4)中，所述的陽離子交換樹脂層析柱為玻璃或不銹鋼柱，外帶夾套可通入熱水進行保溫，柱內陽離子交換樹脂床層的高徑比為4～8：1，優(yōu)選6：1；其中，所述的陽離子交換樹脂為NH₄⁺型JK006型陽離子交換樹脂。

步驟(4)中，進行吸附的具體操作方法為：將3支相同的陽離子交換樹脂層析柱串聯(lián)，從第1柱進脫色液，由第3柱排出廢液，脫色液的進料速度為2～3BV/h；當進料量達到3BV時，第1柱吸附飽和，停止進脫色液，并以2～3BV/h的進料速度通入去離子水進行洗滌，并由第3柱排出；當去離子水洗滌至3BV時，停止通入去離子水，將第1柱轉去進行洗脫處理；在第3柱后串聯(lián)第4柱，從第2柱進脫色液，由第4柱排出廢液，重復前述操作，進行循環(huán)處理。

步驟(4)中，所述的洗脫處理為保持洗脫流速為1～2BV/h，先用1BV的pH 8～9的氨水進行預洗脫，再用0.5mol/L氨水作為洗脫劑進行洗脫，收集pH9.0～11的洗脫液。其中，使用0.5mol/L氨水作為洗脫劑進行洗脫時，廢棄pH＜8.0的洗脫液，收集pH8.0～9.0的洗脫液用于預洗脫下一離子交換柱。洗脫完成后，向離子交換柱中通入2BV的洗脫劑對離子交換柱進行再生，再通入去離子水洗至流出液的pH為8.0，即完成離子交換柱的再生。

步驟(4)中，所述的減壓濃縮蒸氨的方法為：在60～70℃和-0.1～-0.08Mpa的真空度下，將洗脫液濃縮至L-鳥氨酸的質量百分比為30～40％。

步驟(5)中，所述的酸化反應是指向降至室溫后的步驟(4)中所得濃縮液中加入30～36％的鹽酸水溶液，直至pH為4.5～5.5后，攪拌1～4h。

步驟(6)中，乙醇和二次脫色液的體積比為1.2：1～2.0：1；其中，全部乙醇在1～4h內加入二次脫色液中。

其中，加入乙醇進行結晶的和養(yǎng)晶的過程中，保持體系溫度為20℃。

步驟(6)中，真空干燥的方法為：在50～60℃和-0.1～-0.08Mpa的真空度下，真空干燥晶體4～6h。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明工藝簡單，采用超濾與可再生的活性炭層析柱進行連續(xù)脫色，脫色液的透射比達98％以上，并大幅降低了脫色成本和操作周期。采用連續(xù)離子交換，提高了樹脂對L-鳥氨酸的吸附能力，減少了樹脂再生次數(shù)和廢水排放，并將離子交換的收率保持在97％以上。該法的L-鳥氨酸鹽酸鹽的提取率達85％以上，產品純度達98.5％以上，有利于工業(yè)化生產，具有顯著的經濟和社會價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例中，BV是指相對應的單柱所填充的吸附劑床層體積。

實施例1

將L-鳥氨酸發(fā)酵液(32g/L，透射比30％)調節(jié)至pH 6.0，進行微濾處理，操作壓力0.1Mpa，操作溫度30℃，孔徑為0.5微米，細胞去除率為98％，將收集的微濾液進行超濾處理，操作壓力0.3Mpa，操作溫度35℃，雜蛋白去除率88％，收集超濾液，透射比為45％。將收集的超濾液加熱至60℃，以5BV/h的流速泵入活性炭層析柱進行脫色，床層的直徑比為8。處理完55BV的超濾液后，停止上柱脫色，脫色液透射比為98.5％。用3BV體積的60℃去離子水按3BV/h的流速沖洗活性炭層析柱，收集前段流出的1BV體積的流出液，與后批次的L-鳥氨酸發(fā)酵液合并，繼續(xù)用于脫色；活性炭層析柱則進行再生，用于下一次脫色。將收集的脫色液調節(jié)至pH 2.5進行連續(xù)離子交換除雜，單柱樹脂床層高徑比為6，進料流速為2BV/h，交換飽和后的樹脂對L-鳥氨酸的吸附量達到100mg/g樹脂。洗脫過程中收集pH9.0～11的洗脫液并蒸氨濃縮，溫度為60℃，真空度-0.08Mpa，將洗脫液濃縮至L-鳥氨酸含量為35％wt。加35％濃鹽酸酸化至pH為4.5后進行二次脫色，脫色流速為3BV/h，二次脫色液的透射比為98％，按醇水體積比1.4：1流加乙醇進行結晶，流加時間3h，養(yǎng)晶4h。在真空度-0.1Mpa，55℃下真空干燥晶體6h，即獲得L-鳥氨酸鹽酸鹽產品。產品純度為98.5％，產品提取收率為87％。

實施例2

將L-鳥氨酸發(fā)酵液(40g/L，透射比19％)調節(jié)至pH 6.5，進行微濾處理，操作壓力0.15Mpa，操作溫度25℃，孔徑為0.22微米，細胞去除率為99％，將收集的微濾液進行超濾處理，操作壓力0.25Mpa，操作溫度30℃，雜蛋白去除率91％，收集超濾液，透射比為45％。將收集的超濾液加熱至65℃，以6BV/h的流速泵入實例1中再生的活性炭層析柱進行脫色，床層的高徑比為10。處理完50BV的超濾液后，停止上柱脫色，脫色液透射比為99.0％。用3BV體積的60℃去離子水按3BV/h的流速沖洗活性炭層析柱，收集前段流出的1BV體積的流出液，與后批次的L-鳥氨酸發(fā)酵液合并，繼續(xù)用于脫色；活性炭層析柱則進行再生，用于下一次脫色。將收集的脫色液調節(jié)至pH 2.0進行連續(xù)離子交換除雜，單柱樹脂床層高徑比為6，進料流速為1.5BV/h，交換飽和后的樹脂對L-鳥氨酸的吸附量達到112mg/g樹脂。洗脫過程中收集pH9.0～11的洗脫液并蒸氨濃縮，溫度為55℃，真空度-0.08Mpa，將洗脫液濃縮至L-鳥氨酸含量為40％wt。加34％濃鹽酸酸化至pH為5.0后進行二次脫色，脫色流速為5BV/h，二次脫色液的透射比為98％。按醇水體積比1.5：1流加乙醇進行結晶，流加時間2h，養(yǎng)晶6h。在真空度-0.1Mpa，55℃下真空干燥晶體6h，即獲得L-鳥氨酸鹽酸鹽產品。產品純度為98.8％，產品提取收率為88％。

實施例3

將L-鳥氨酸發(fā)酵液(44g/L，透射比23％)調節(jié)至pH 6.2，進行微濾處理，操作壓力0.3Mpa，操作溫度33℃，孔徑為0.22微米，細胞去除率為99％，將收集的微濾液進行超濾處理，操作壓力0.4Mpa，操作溫度35℃，雜蛋白去除率91％，收集超濾液，透射比為45％。將收集的超濾液加熱至60℃，以6BV/h的流速泵入實例2中再生的活性炭層析柱進行脫色，床層的高徑比為12。處理完65BV的超濾液后，停止上柱脫色，脫色液透射比為98.7％。用3BV體積的60℃去離子水按3BV/h的流速沖洗活性炭層析柱，收集前段流出的1BV體積的流出液，與后批次的L-鳥氨酸發(fā)酵液合并，繼續(xù)用于脫色；活性炭層析柱則進行再生，用于下一次脫色。將收集的脫色液調節(jié)至pH 2.0進行連續(xù)離子交換除雜，單柱樹脂床層高徑比為4，進料流速為1.5BV/h，交換飽和后的樹脂對L-鳥氨酸的吸附量達到91mg/g樹脂。洗脫過程中收集pH9.0～11的洗脫液并蒸氨濃縮，溫度為65℃，真空度-0.09Mpa，將洗脫液濃縮至L-鳥氨酸含量為30％wt。加36％濃鹽酸酸化至pH為5.3后進行二次脫色，脫色流速為6BV/h，二次脫色液的透射比為98.4％。按醇水體積比1.8：1流加乙醇進行結晶，流加時間1h，養(yǎng)晶5h。在真空度-0.1Mpa，60℃下真空干燥晶體4h，即獲得L-鳥氨酸鹽酸鹽產品。產品純度為98.7％，產品提取收率為85％。

實施例4

將L-鳥氨酸發(fā)酵液(31g/L，透射比30％)調節(jié)至pH 6.1，進行微濾處理，操作壓力0.05Mpa，操作溫度35℃，孔徑為0.5微米，細胞去除率為97％，將收集的微濾液進行超濾處理，操作壓力0.2Mpa，操作溫度30℃，雜蛋白去除率93％，收集超濾液，透射比為55％。將收集的超濾液加熱至70℃，以3BV/h的流速泵入實例3中再生的活性炭層析柱進行脫色，床層的高徑比為10。處理完70BV的超濾液后，停止上柱脫色，脫色液透射比為98.0％。用3BV體積的60℃去離子水按5BV/h的流速沖洗活性炭層析柱，收集前段流出的1BV體積的流出液，與后批次的L-鳥氨酸發(fā)酵液合并，繼續(xù)用于脫色；活性炭層析柱則進行再生，用于下一次脫色。將收集的脫色液調節(jié)至pH 1.5進行連續(xù)離子交換除雜，單柱樹脂床層高徑比為8，進料流速為1BV/h，交換飽和后的樹脂對L-鳥氨酸的吸附量達到105mg/g樹脂。洗脫過程中收集pH9.0～11的洗脫液并蒸氨濃縮，溫度為60℃，真空度-0.1Mpa，將洗脫液濃縮至L-鳥氨酸含量為30％wt。加30％濃鹽酸酸化至pH為4.8后進行二次脫色，脫色流速為3BV/h，二次脫色液的透射比為98％。按醇水體積比1.2：1流加乙醇進行結晶，流加時間4h，養(yǎng)晶5h。在真空度-0.1Mpa，60℃下真空干燥晶體4h，即獲得L-鳥氨酸鹽酸鹽產品。產品純度為98.5％，產品提取收率為86％。