重組質(zhì)粒pMDMcherry、其構(gòu)建方法和紅色熒光蛋白基因標(biāo)記鮰愛德華菌的方法與流程

本發(fā)明屬于生物監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種重組質(zhì)粒pMDMcherry及其構(gòu)建方法，以及紅色熒光蛋白基因標(biāo)記鮰愛德華菌的方法。

背景技術(shù)：

斑馬魚是近十幾年來發(fā)展起來的一種新興的模式動(dòng)物。作為一種脊椎動(dòng)物，它具有許多小鼠所無法達(dá)到的優(yōu)勢：斑馬魚體積小，飼養(yǎng)和維持的費(fèi)用低；繁殖周期短，產(chǎn)卵量大；更為重要的是，斑馬魚胚胎是體外受精，發(fā)育過程可被直接連續(xù)觀察。斑馬魚作為感染性疾病的感染模型越來越受到病原微生物學(xué)家的喜愛。

鮰愛德華氏菌為腸桿菌科愛德華氏菌屬的細(xì)菌。1979年，Hawke首次發(fā)現(xiàn)鮰愛德華氏菌感染斑點(diǎn)叉尾鮰，目前已在澳大利亞、泰國、越南、日本、中國等相繼發(fā)現(xiàn)鮰愛德華氏菌感染魚類發(fā)病，感染對象包括南方大口鲇、斑點(diǎn)叉尾鮰、黃顙魚、鰻鯰和羅非魚等，其發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

目前國內(nèi)對鮰愛德華菌致病機(jī)理研究報(bào)道較少，而研究細(xì)菌致病機(jī)理不可避免地要涉及細(xì)菌與宿主之間的關(guān)系，使用標(biāo)記基因是監(jiān)測細(xì)菌在宿主內(nèi)生長、繁殖及其與宿主相互作用關(guān)系的有效手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒pMDMcherry及其構(gòu)建方法，以及紅色熒光蛋白基因標(biāo)記鮰愛德華菌的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

一種重組質(zhì)粒pMDMcherry，其具有如SEQ ID NO:7所示的堿基序列。

本發(fā)明還提供了上述重組質(zhì)粒pMDMcherry的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)、以質(zhì)粒PRUAL為模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得序列號為SEQ ID No:3的啟動(dòng)子片段；

(2)、以質(zhì)粒pLVX-PAmCherry-C1為模板，SEQ ID No:4和SEQ ID No:5為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得序列號為SEQ ID No:6的紅色熒光蛋白Mcherry片段；

(3)、以步驟(1)的啟動(dòng)子片段和步驟(2)的紅色熒光蛋白Mcherry片段混合作為模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:5為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(4)、將步驟(3)的PCR產(chǎn)物與pMD18-T Vector克隆載體連接，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行測序鑒定，得到序列號為SEQ ID No:7的重組質(zhì)粒pMDMcherry。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)的啟動(dòng)子片段和步驟(2)的紅色熒光蛋白Mcherry片段的體積比為1:1。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)-步驟(3)中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：5×buffer20ul、dNTPs 8ul、primersense 2ul、antisense 2ul、templet 1ul、Primerstar 1ul、加H₂O至100ul。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)-步驟(3)中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃2min；95℃30s、50℃30s、72℃30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(4)中所述連接反應(yīng)的反應(yīng)體系為：10×buffer2ul、templet15ul、templet25ul、templet35ul、T4ligase 0.5ul、加H₂O至20ul。

本發(fā)明還提供了一種紅色熒光蛋白基因標(biāo)記鮰愛德華菌的方法，包括以下步驟：

(1)、從患病斑馬魚體內(nèi)分離出鮰愛德華菌：

(2)、制備鮰愛德華菌感受態(tài)；

(3)、將上述重組質(zhì)粒PMDMcherry轉(zhuǎn)入到制備的鮰愛德華菌感受態(tài)中，即得。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、紅色熒光蛋白(Mcheey fluorescent protein)能夠自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)并在綠光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。作為報(bào)告基因，Mcheey是不需要外源底物或輔助因子，就能在活細(xì)胞中表達(dá)的發(fā)光蛋白，Mcheey作為熒光標(biāo)記分子既具有敏感的標(biāo)記檢測率，又沒有放射性的危害，因此可實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)實(shí)時(shí)檢測標(biāo)記菌株的情況，能很好地進(jìn)行菌體跟蹤研究。本發(fā)明通過巧妙的引物設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了重組質(zhì)粒PMDMcherry的制備；

2、本發(fā)明通過將構(gòu)建的重組質(zhì)粒PMDMcherry轉(zhuǎn)入到制備的鮰愛德華菌感受態(tài)中，建立了Mcheey標(biāo)記的鮰愛德華菌強(qiáng)毒株，便于以后通過熒光顯微鏡觀察鮰愛德華菌侵染宿主的動(dòng)態(tài)過程，實(shí)現(xiàn)熒光菌株觀察，方法簡便直觀，為研究鮰愛德華菌與宿主的相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)，極大地降低了實(shí)驗(yàn)的成本，同時(shí)，質(zhì)量的穩(wěn)定性也非常高；

3、本發(fā)明使用的鮰愛德華菌菌株是在患病斑馬魚體內(nèi)分離出來的，對斑馬魚具有較高的致病性，以模式動(dòng)物斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行該菌株的感染實(shí)驗(yàn)研究，對于鮰愛德華菌致病機(jī)理的了解具有較大的優(yōu)勢。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中構(gòu)建PMDMcherry質(zhì)粒的步驟的示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中顯微鏡下觀察的熒光蛋白。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1重組質(zhì)粒PMDMcherry的構(gòu)建方法

本實(shí)施例的重組質(zhì)粒PMDMcherry的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)制備啟動(dòng)子片段：

以質(zhì)粒PRUAL為模板，ppS(SEQ ID No:1)、ppA(SEQ ID No:2)為上下游引物，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳后用Gel Extraction Kit(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行膠回收，獲得啟動(dòng)子片段，序列號為SEQ ID No:3。PCR反應(yīng)體系見表1，PCR反應(yīng)條件見表2：

ppS：5'CGCCTAGGATACGCACACCGTGGAAAC3'(SEQ ID No:1)

ppA：5'CCTTGCTCACCATTTTTTCTTCCTCCA3'(SEQ ID No:2)

表1PCR擴(kuò)增體系

表2PCR擴(kuò)增程序

(2)制備MCHEEY片段：

以質(zhì)粒PLVX-PAMCHERRY-C1VECTOR(TaKaRa公司)為模板，MCS(SEQ ID No:4)、MCA(SEQ ID No:5)作為上下游引物，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳后用Gel Extraction Kit進(jìn)行膠回收，得到MCHEEY片段，序列號為SEQ ID No:6。PCR反應(yīng)體系見上表1，PCR反應(yīng)條件見上表2。

MCS：5'AGGAAGAAAAAATGGTGAGCAAGGGCGA3'(SEQ ID No:4)

MCA：5'GCGTTCGAATTACTACTTGTACAGCT3'(SEQ ID No:5)

(3)啟動(dòng)子與MCHEEY連接

由于設(shè)計(jì)時(shí)引物ppA和MCS有一段重復(fù)序列，因而它們的PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段和MCHEEY片段也有一段重復(fù)序列，這樣便于用PCR方法連接啟動(dòng)子和MCHEEY片段。以回收的啟動(dòng)子和MCHEEY片段1：1混合作為模板，ppS(SEQ ID No:1)、MCA(SEQ ID No:5)作為上下游引物進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳后用Gel Extraction Kit進(jìn)行膠回收。PCR反應(yīng)體系見上表1，PCR反應(yīng)條件見上表2。

(5)PCR產(chǎn)物的T/A連接、轉(zhuǎn)化與鑒定：

將步驟(4)純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T Vector克隆載體(購買自TaKaRa公司)進(jìn)行連接，16℃連接過夜。連接體系見表3。常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板(含氨芐青霉素50μg/mL)上，37℃孵箱培養(yǎng)16h，挑取陽性克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定的重組質(zhì)粒PMDMcherry進(jìn)行測序鑒定。通過上述方法構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒PMDMcherry的圖譜如圖1所示，重組質(zhì)粒PMDMcherry的序列為SEQ ID NO:7所示。

表3連接體系

實(shí)施例2紅色熒光蛋白基因標(biāo)記鮰愛德華菌的制備方法

本實(shí)施例的紅色熒光蛋白基因標(biāo)記鮰愛德華菌的制備方法，包括以下步驟：

(1)采用常規(guī)操作方法，從患病斑馬魚體內(nèi)分離出鮰愛德華菌強(qiáng)毒株；

(2)制備鮰愛德華菌感受態(tài)

方法如下：

(a)接種鮰愛德華菌到BHI液體培養(yǎng)基中，28℃，280rpm搖床培養(yǎng)過夜；

(b)按1:500的量轉(zhuǎn)接到含500ml BHI液體培養(yǎng)基中，280rpm，2.5-3.5h，培養(yǎng)至OD600為0.6；

(c)立刻置冰水浴中驟冷：可以選擇在一個(gè)大的裝有冰水混合物的容器，放在搖床上快速旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，盡快使培養(yǎng)物溫度降下來；

(d)隨后在250ml預(yù)冷的離心杯中離心，4℃，4000rpm，30min；

(e)棄上清后，用預(yù)冷的滅菌雙蒸水洗：先加少量水懸浮菌體，菌體懸浮后再把水加至500mL，4000rpm，20min，棄上清；

(f)再用10％的預(yù)冷甘油500mL洗1次，4000rpm，20min；將兩個(gè)離心管中的細(xì)菌混合，10％的預(yù)冷甘油100mL洗1次，4000rpm，20min；

(g)最后一次倒盡甘油后(盡量去干凈)，加1mL甘油懸浮細(xì)胞，每80μl分裝到1.5mL EP管(EP管要-80℃預(yù)冷)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)載體PMDMcherry的獲取、連接與轉(zhuǎn)化：

提取測序鑒定正確菌株的質(zhì)粒PMDMcherry(即實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒)，使用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入到制備的鮰愛德華菌感受態(tài)中。電轉(zhuǎn)化方法如下：

(A)從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；

(B)取1μl純化后的重組質(zhì)粒PMDMcherry(200ng)于1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預(yù)冷。

(C)將80ul解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置10min。

(D)打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.1KV。

(E)將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部；

(F)將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1ml的BHI液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。

(G)37℃，220－250rpm復(fù)蘇1小時(shí)。

(H)取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐青霉素的BHI瓊脂平板(含氨芐青霉素50μg/mL)，放于28℃溫室，過夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。

(4)熒光菌株觀察。

構(gòu)建好的菌株用無菌水稀釋后涂到載玻片上，使用熒光顯微鏡，在20×10的放大倍數(shù)下觀察，能穩(wěn)定高效的表達(dá)紅色熒光蛋白，如圖2。

將實(shí)施例1構(gòu)建得到了PMDMcherry重組載體導(dǎo)入到鮰愛德華菌強(qiáng)毒株中，在熒光顯微鏡下觀察,菌體呈現(xiàn)紅色熒光，說明成功轉(zhuǎn)入。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，PMDMCHEEY傳至25代,質(zhì)粒穩(wěn)定率可達(dá)100％。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。