亨廷頓蛋白的?；揎椃椒?br>
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種亨廷頓蛋白的酰基化修飾方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）獲取重組蛋白Htt（1-90）：a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達質(zhì)粒pTWIN1-htt的構建；c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5α-htt的構建；d、重組蛋白的表達；（2）重組蛋白Htt（1-90）的純化；（3）SPPS方法獲得?；揎椀腍tt（Cys-K92-K158）多肽；（4）Htt（Cys-K92-K158）多肽的純化；（5）Htt（Cys-K92-K158）多肽與重組蛋白Htt（1-90）經(jīng)過偶聯(lián)獲得經(jīng)?；揎椖康牡鞍譎tt（1-158）；（6）經(jīng)?；揎椖康牡鞍譎tt（1-158）的純化。通過對亨廷頓蛋白的?；瘜W修飾，乙?；幚砗蟮牡鞍姿獬潭容^小，而非乙酰化蛋白水解程度較大，即說明了乙?；揎椇蟮暮嗤㈩D蛋白穩(wěn)定性較強。
【專利說明】亨廷頓蛋白的酰基化修飾方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的化學修飾，具體涉及一種亨廷頓蛋白的?；揎椃椒?。
【背景技術】
[0002]蛋白質(zhì)修飾是一個復雜的過程，在真核生物中修飾類型很多，常見的有糖基化、乙?；?、泛素化、磷酸化和SUMO化，蛋白質(zhì)修飾能夠改變蛋白質(zhì)的活性、定位或功能。蛋白質(zhì)中的乙?；揎椖軌蛘{(diào)控蛋白的多種性質(zhì)，包括DNA-蛋白質(zhì)相互作用、亞細胞定位、轉(zhuǎn)錄活性和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等。乙?；牡鞍踪|(zhì)具有能夠高抵抗氨基肽酶和泛素依賴蛋白酶降解的能力。研究表明，在擴大的多谷氨酰胺誘導疾病中，蛋白的乙?；腿ヒ阴；氖Ш馐且粋€關鍵過程。
[0003]亨廷頓舞蹈病(Huntington disease,HD)是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)變性疾病，如基因編碼一個由3144個氨基酸組成的亨廷頓蛋白(Huntingtin，Htt)，從Htt氨基酸末端第17位開始有一段重復的谷氨酰胺(CAG)序列。隨著多聚谷氨酰胺的過度延長，Htt蛋白會在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用下發(fā)生交聯(lián)而形成聚集體，在主鏈和側(cè)鏈酰胺基之間氫鍵連接的作用下，多聚谷氨酰胺序列可形成多聚物，稱為多聚谷氨酰胺序列(PolyQ)。正常人的PolyQ長度小于35個，而HD患者的PolyQ長度會超過37個。這些異常蛋白質(zhì)積聚成塊，損壞部分腦細胞，特別是那些與肌肉控制有關的細胞，導致患者神經(jīng)系統(tǒng)逐漸退化，神經(jīng)沖動彌散，動作失調(diào)，出現(xiàn)不可控制的顫搐，并能發(fā)展成癡呆，甚至死亡。臨床表現(xiàn)主要為舞蹈樣不自主動作、精神障礙和進行性癡呆。
[0004]賴氨酸的乙酰化是一種可逆的蛋白質(zhì)后修飾，并且在基因表達中有重要的調(diào)控作用，尤其是組蛋白的乙?；瘜C體影響更大。乙?；饕腥N形式，N-乙?；?、C-端的酰胺化和多肽側(cè)鏈酰基化，酰基化多肽改變了多肽的電荷分布，對多肽和蛋白的周期、生物活性和穩(wěn)定性有重要影響，同時乙?；c對泛素化、磷酸化有競爭性作用。由于亨廷頓蛋白易于凝聚等，基于亨廷頓蛋白的發(fā)病機制，研究其乙?；瘜嗤㈩D疾病有指導性意義。
[0005]沒有修飾的亨廷頓蛋白顯示出比較容易凝聚等，目前國內(nèi)還沒有研究所或者機構對亨廷頓蛋白進行化學修飾，通過對亨廷頓蛋白的?；瘜W修飾，乙?；幚砗蟮牡鞍姿獬潭容^小，而非乙?；?蛋白水解程度較大，即說明了乙?；揎椇蟮暮嗤㈩D蛋白穩(wěn)定性較強。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種亨廷頓蛋白的酰基化修飾方法，經(jīng)過乙?；幚砗蟮牡鞍踪|(zhì)，出峰時間延長，同時吸收峰強度有一定的變化，水解酶處理24h后，經(jīng)過乙酰化處理后的蛋白水解程度較小，而非乙?；鞍姿獬潭容^大，處理48h后，經(jīng)過乙?；幚砗蟮牡鞍着c24h相比只有少量蛋白水解，而非乙?；獬潭容^大，有多個片段產(chǎn)生，即說明了乙?；揎椇蟮暮嗤㈩D蛋白穩(wěn)定性較強。[0007]本發(fā)明的目的可通過下列技術方案來實現(xiàn):一種亨廷頓蛋白的?；揎椃椒?，包括以下步驟:(1)、獲取重組蛋白Htt (1-90):a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達質(zhì)SpTWINl-Aii的構建；c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5a-htt的構建；d、重組蛋白的表達；(2)、重組蛋白Htt (1-90)的純化；(3)、SPPS方法獲得?；揎椀腍tt(Cys-K92-K158)多肽；(4) Htt (Cys_K92_K158)多肽的純化；(5) Htt (Cys_K92_K158)多肽與重組蛋白Htt (1-90)經(jīng)過偶聯(lián)獲得經(jīng)?；揎椖康牡鞍譎tt (1-158); (6)經(jīng)?；揎椖康牡鞍譎tt (1-158)的純化。
[0008]作為優(yōu)選,所述步驟(1)中:a、亨廷頓蛋白基因的獲得:以質(zhì)粒pcDNA3.1/mys-His為模板，設計合成含有I和I限制酶切位點的上下游引物Pl和P2，PCR擴增Aii基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，純化處理后與載體pMDlS-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，通過氨芐青霉素抗性篩選，得到重組質(zhì)粒pMD18T-Aii，送至上海生工生物工程有限公司測序。將驗證后的重組質(zhì)粒用I和I雙酶切處理，酶切產(chǎn)物純化處理后置4°C冰箱保存；b、重組表達質(zhì)粒pTWINl-htt的構建:將原核表達載體pTWINl和重組質(zhì)粒pMD18T-htt分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Pst I雙酶切，純化處理后將線性pTWINl質(zhì)粒片段和htt基因片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定和測序分析驗證，所得重組質(zhì)粒命名為pTWINl-htt ;c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5 a -htt的構建:采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTWINl-htt轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，得到重組菌，命名為:DH5a-htt ;d、重組蛋白的表達:將重組菌DH5a-htt接種至LB液體培養(yǎng)基，置37°C搖床過夜培養(yǎng)。吸取過夜培養(yǎng)菌體以5%接種量接種LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至0D600=0.5^0.7，然后置20°C搖床培養(yǎng)加入lmmol/L的IPTG誘導表達目的蛋白4~6h,離心收集菌體。在40mmol/L的TRIS_Acetate、5mmol/L pH=8.3的溶液中進行超聲破碎。通過離心(23000Xg，30 min, 40C)將細胞碎片和上清液分離，得到重組蛋白 Htt (1-90)。
[0009]進一步地，所述的步驟(3)中合成?；揎椀腍tt (Cys-K92-K158)多肽過程分為三個片段合成:a、首先合成Cys-S138-K158片段；b、再合成CyS-E110_L136片段；C、最后合成Cys-K92-1108片段；d、每個片段通過自然化學連接NCL或EPL方法連接得到Htt(Cys-K92-K158)多肽。
[0010]進一步地，即所述步驟(3)中?；揎椢挥诤嗤㈩D外顯子2或外顯子3區(qū)域，即K92位點、K98位點、K99位點、K125位點、K155位點、K158位點中的至少一個位點。
[0011]進一步地,合成Cys-S138_K158片段所用的固相載體是wang —樹脂。
[0012]進一步地，合成Cys-K92-1108片段和CyS-E110_L136片段所用的固相載體是N-?；?苯并咪唑酮樹脂。
[0013]經(jīng)?；揎椀暮嗤㈩D蛋白與野生型亨廷頓蛋白比較，具有以下優(yōu)點:經(jīng)過乙?；幚砗蟮牡鞍踪|(zhì)，出峰時間延長，同時吸收峰強度有一定的變化，水解酶處理24h后，經(jīng)過乙?；幚砗蟮牡鞍姿獬潭容^小，而非乙酰化蛋白水解程度較大，處理48h后，經(jīng)過乙?；幚砗蟮牡鞍着c24h相比只有少量蛋白水解，而非乙?；獬潭容^大，有多個片段產(chǎn)生，即說明了乙酰化修飾后的亨廷頓蛋白穩(wěn)定性較強?！緦＠綀D】
【附圖說明】
[0014]圖1為獲得Httl-90重組蛋白的流程圖；
圖2為SPPS方法獲得?；腍tt (Cys-K92-K158)蛋白流程圖；
圖3為經(jīng)?；揎椀哪康牡鞍譎tt (1-158)的合成流程圖；
圖4:A為Htt (Cys-K92-K158)蛋白序列和合成片段；
B為Htt (Cys-K92-K158)多肽?；揎椢稽c；
圖5:A為未經(jīng)過水解酶處理的乙?；鞍椎纳V圖；
B為未經(jīng)過水解酶處理的非乙?；鞍椎纳V圖；
圖6:A為經(jīng)水解酶處理24h的乙?；鞍椎纳V圖；
B為經(jīng)過水解酶處理24h的非乙?；鞍椎纳V圖；
圖7:A為經(jīng)水解酶處理48h的乙?；嗤㈩D蛋白的色譜圖；
B為經(jīng)水解酶處理48h的非乙?；嗤㈩D蛋白的色譜圖；
圖8為水解酶處理乙?；头且阴；鞍酌庖哂≯E分析顯影結(jié)果圖；其中I為天然Htt蛋白；2為?；揎椇驢tt蛋白；3為蛋白酶水解天然Htt蛋白；4為蛋白酶水解?；揎椇驢tt蛋白。
具體實施例
[0015]實施例1:獲得重組蛋白Httl-90 (一)試驗材料
(I)載體和菌株
質(zhì)粒pcDNA3.Ι/mys-His由CHDI惠贈；表達載體pTWINl購自NEB公司；質(zhì)粒pMD18_T和大腸桿菌JM109、DH5a購自Takara生物科技有限公司。
[0016](2)弓丨物
Pl:5-CCGGAATTCCTGCCGTGCC-3 (EcoR I)
P2:5-AAAACTGCAGACAGCCGGGC-3 (Pst I)
由上海生工生物工程有限公司合成。
[0017](二)實施方案
1.亨廷頓蛋白基因的獲得
以質(zhì)粒pcDNA3.1/mys-His為模板，設計合成含有I和I限制酶切位點的上下游引物Pl和P2，PCR擴增Aii基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，純化處理后與載體PMD18-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，通過氨芐青霉素抗性篩選，得到重組質(zhì)粒pMD18T-Aii，送至上海生工生物工程有限公司測序。將驗證后的重組質(zhì)粒用I和Pst I雙酶切處理，酶切產(chǎn)物純化處理后置4°C冰箱保存。
[0018]2.重組表達質(zhì)粒pTWINl-Α--的構建
將原核表達載體pTWINl用限制性內(nèi)切酶I和I雙酶切，純化處理后將線性PTffINl質(zhì)粒片段和Ai?基因片段 進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pTWINl-Α--。
[0019]3.表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株的構建
采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTWINl-Α--轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，得到重組菌DH5 α -Mt。
[0020]將重組菌DH5a-Aii接種至LB液體培養(yǎng)基，置37 °C搖床過夜培養(yǎng)。吸取過夜培養(yǎng)菌體以5%接種量接種LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至0D600=0.5^0.7，然后置20°C搖床培養(yǎng)加入lmmol/L的IPTG誘導表達目的蛋白4~6h,離心收集菌體。在40mmol/L的TRIS-Acetate>5mmol/L pH=8.3的溶液中進行超聲破碎。通過離心(23000X g, 30 min,40°C)將細胞碎片和上清液分離開來。粗多肽純度為60%。
[0021] 實施例2:重組蛋白的純化 Httl-90-1ntein-CBD融合蛋白中CBD成分可與幾丁質(zhì)樹脂特異結(jié)合，從而便于去除雜蛋白，隨后intein成分在一定條件下催化融合蛋白在Httl-90和Intein之間發(fā)生斷裂。具體操作如下:將上清液上樣于2ml幾丁質(zhì)重力柱。柱子先經(jīng)過A液(Na-HEPES (pH8.0)20mmol/L,NaCl 500mmol/L,EDTA lmmol/L)進行平衡，上清液上樣后，再以A液洗脫。然后柱子在 B 液(Na-HEPES (ρΗ8.0)20mmol/L，NaCl 500mmol/L,EDTA lmmol/L,DTT 50mmol/L)中 40C 下浸泡 16h。C 液(Na-HEPES (pH8.0) 20mmol/L,NaCl 500mmol/L)洗脫蛋白，每 Iml收集。將每步收集到的樣品進行SDS-PAGE分析，鑒定蛋白質(zhì)的純度是90%。
[0022]洗脫蛋白溶液中加入含有0.25mmol/L pH7.8 MESNA的溶液，室溫搖床切割3次，每次24h。收集切割液加I倍體積的HEPES Buffer慢速沖洗柱子，合并二次洗脫液，最后一次切割液加壓吹干并回收樹脂。將蛋白洗脫液移至超濾管，10000r/min離心15_30min，超濾至1.5ml時移液槍轉(zhuǎn)移上層蛋白液，得到純度為99%的重組多肽2g，_4°C凍存。操作示意圖如圖1。
[0023]實施例3 =SPPS方法獲得位于K92位點經(jīng)?；揎椀腍tt (Cys-K92_K158)多肽 本合成過程分為三個片段，首先合成Cys-S138-K158，再合成CyS-E110_L136，最后合
成Cys-K92-1108。每個片段通過自然化學連接NCL方法連接得到Htt (Cys-K92_K158)多肽
固相肽的合成是在CS336X的多肽合成儀上進行的，Cys-S138-K158多肽的合成是基于Wang樹脂。樹脂的去保護和解聚在(TFA/DCM/H20/TIPS 90/5/2.5/2.5)溶液中能夠自發(fā)進行。然后通過10倍當量的冷乙醚對其沉淀，這些原始多肽通過反相HPLC進行純化，使用waters 600泵和waters 2489紫外/可見光檢測器，柱子采用GRACE-Vydac 218TP54 C18柱。流動相A是0.1%的三氟乙酸水溶液，流動相B是0.1%三氟乙酸乙腈溶液，多肽的檢測波長是214nm和234nm。多肽的質(zhì)量通過MALD1-T0F-MS和ES1-MSF分析。最終得到20mg、純度為99%的Cys-S138-K158多肽，產(chǎn)率為55%。
[0024]Cys-El 10-L136多肽合成基于NBZ樹脂，在多肽的C端產(chǎn)生一個NBZ衍生結(jié)構方便進行NCL反應。NBZ樹脂最初的制備是通過氨基化的MBHA樹脂和去保護的Fmoc-與5倍當量的D1-Fmoc-3, 4 二氨基苯甲酸偶聯(lián)得到的。多肽的延長通過Fmoc保護的氨基酸，當DIPEA濃度達到0.5mol/L時，Dbz與4-硝基苯基氯甲酸酯f禹合時在分子內(nèi)形成環(huán)狀。最后通過鍵的斷裂得到的多肽，合成的多肽N端采用賽唑燒保護,在methoxyamine Hcl pH4.0條件下噻唑烷化學鍵斷裂形成巰基。純化步驟同上最終得到。最終得到18mg、純度為99%的Cys-El 10-L136多肽，產(chǎn)率為58%。
[0025]Cys-K92-1108合成與Cys-E110_L136多肽合成類似，固態(tài)合成是基于NBZ樹脂，在多肽的C端產(chǎn)生一個NBZ衍生結(jié)構方便進行NCL反應。購買得到側(cè)鏈上的氨基乙?；?，α -氨基fmoc保護的賴氨酸，通過固肽合成得到K92-1108-AcK92多肽。最后合成的多肽在N端賽唑烷保護和C端NBZ衍生結(jié)構，在methoxyamine Hcl pH4.0條件下噻唑烷化學鍵斷裂形成巰基，純化步驟同上。最終得到16mg、純度為99%的Cys-E110-L136多肽，產(chǎn)率為60%。如圖2為對K92位點進行酰基化修飾的Htt (Cys-K92-K158)多肽的合成示意圖。
[0026]實施例4:?；揎椀腍tt (Cys-K92-K158)多肽的純化
多肽的鑒定和純化通過重新注入反相色譜，此時檢測器是二極管陣列檢測器，流動相同。流動相A是0.1%的三氟乙酸水溶液，流動相B是0.1%三氟乙酸乙腈溶液，多肽的檢測波長是214nm和234nm。 [0027]最終得到7.2mg 的 HttCys-K92_K158 蛋白，產(chǎn)率為 19.1%。
[0028]實施例5:Htt (Cys-K92_K158)多肽與重組蛋白Htt (1_90)經(jīng)過偶聯(lián)獲得經(jīng)?；揎椖康牡鞍譎tt (1-158)
將重組蛋白Httl-90和固相合成蛋白HttCys-K92-K158放入緩沖液中，利用巰基和硫酯的特異性反應，再經(jīng)過由S到N的轉(zhuǎn)變完成肽鍵的合成。其合成流程圖如圖3。
[0029]實施例6:經(jīng)酰基化修飾目的蛋白Htt (1-158)的純化
NCL反應后的Httl-158產(chǎn)物通過反相高效液相色譜純化，純化柱是C0SM0SIL5C4-AR-300 (4.6mm*150mm 5 μ m)，線性梯度是10_90%，產(chǎn)物洗脫是在55%梯度下，得到產(chǎn)物
4.8mg (0.5 μ mo I, 33%)，通過MALDI計算產(chǎn)物的分子量。通過UPLC評定產(chǎn)物的純度，純度為99%，產(chǎn)率為6.6%ο
[0030]實施例7:酰基化修飾和非?；揎椝馇昂蟮纳V圖比較 樣品制備:將樣品溶解在緩沖液中，通過反相色譜柱，進行分析。
[0031]色譜條件:通過反相-高效液相色譜(RP-HPLC)，waters2795系統(tǒng)，C18柱(4.6πιπι*250πιπι，5μπι)。流動相A:0.1%的三氟乙酸水溶液，B是0.1%的三氟乙酸乙腈溶液。
[0032]取上述溶液加入蛋白質(zhì)水解酶，分別在24h和48h用RP-HPLC檢測水解蛋白，其色譜條件同上。
[0033]從圖5、6、7中可以看出，經(jīng)過乙酰化處理后的蛋白質(zhì)，出峰時間延長，同時吸收峰強度有一定的變化，水解酶處理24h后，經(jīng)過乙?；幚砗蟮牡鞍姿獬潭容^小，而非乙?；鞍姿獬潭容^大，處理48h后，經(jīng)過乙?；幚砗蟮牡鞍着c24h相比只有少量蛋白水解，而非乙?；獬潭容^大，有多個片段產(chǎn)生，即說明了乙?；揎椇蟮暮嗤㈩D蛋白穩(wěn)定性較強。
[0034]實施例8:水解酶處理乙?；头且阴；鞍酌庖哂≯E分析
將乙?；头且阴；鞍變煞N樣品用水解酶處理48h后，將蛋白質(zhì)樣品在120V，15%的Imm的聚丙烯酰胺凝膠上跑膠lh，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，室溫下，在膜上固定lh，使用3倍的PBS緩沖液進行洗脫，在膜上加入亨廷頓鼠抗抗體和兔抗PalmC109，4°C過夜，采用PBS緩沖液(0.1%的吐溫80)洗脫，最后在700nm紅外成像儀上成像，得到結(jié)果如圖8所示。
[0035]結(jié)果為:非乙?；牡鞍捉?jīng)過48小時的水解處理后，蛋白條帶黑度顯著下降，意味著蛋白濃度降低，而乙?；牡鞍捉?jīng)過48小時的水解處理后，蛋白濃度基本不變。
【權利要求】
1.一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)、獲取重組蛋白Htt (1-90):a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達質(zhì)粒pTWINl-Α--的構建；c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5a -htt的構建；d、重組蛋白的表達；(2)、重組蛋白Htt (1-90)的純化；(3),SPPS方法獲得棕櫚化修飾的Htt (Cys-K92_K158)多肽；(4) Htt(Cys-K92-K158)多肽的純化；(5) Htt (Cys-K92_K158)多肽與重組蛋白 Htt (1-90)經(jīng)過偶聯(lián)獲得經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt (1-158)； (6)經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt (1-158)的純化。
2.根據(jù)權利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述步驟(1)中:a、亨廷頓蛋白基因的獲得:設計含有I和I限制酶切位點的上下游引物Pl和P2，從質(zhì)粒pcDNA3.1/mys-His上采用PCR的方法擴增亨廷頓蛋白基因片段，將所擴增的htt基因片段和克隆載體pMDlS-Τ載體鏈接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定和測序分析驗證，所得重組質(zhì)粒命名為pMD18T-Aii ;b、重組表達質(zhì)粒pTWINl-htt的構建:將原核表達載體pTWINl和重組質(zhì)粒pMD18T-Aii分別用限制性內(nèi)切酶I和I雙酶切，純化處理后將線性pTWINl質(zhì)粒片段和Aii基因片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定和測序分析驗證，所得重組質(zhì)粒命名為pTWINl-Α-- ;c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株的構建:采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTWINl-Α--轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，得到重組菌，命名為:DH5a-Aii ;d、重組蛋白的表達:將重組菌DH5 a-Aii接種至LB液體培養(yǎng)基，置37°C搖床過夜培養(yǎng)，吸取過夜培養(yǎng)菌體以5%接種量接種LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至0D600=0.5^0.7，然后置20°C搖床培養(yǎng)加入lmmol/L的IPTG誘導表達目的蛋白4~6h,離心收集菌體,在40mmol/L的TRIS_Acetate、5mmol/L pH=8.3的溶液中進行超聲破碎，通過離心(23000 X g，30min, 40°C )將細胞碎片和上清液分離。
3.根據(jù)權利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述的步驟(3)中合成Htt (Cys-K92-K158)多肽的過程分為三個片段合成:a、首先合成Cys-S138_K158片段；b、再合成Cys-E110-L`136片段；C、最后合成CyS-K92_I108片段；d、每個片段通過自然化學連接NCL或EPL方法連接得到Htt (Cys-K92-K158)多肽。
4.根據(jù)權利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述步驟(3)中棕櫚化修飾位于亨廷頓外顯子2或外顯子3區(qū)域，即C105位點、C109位點、C137位點、C152位點中的至少一個位點。
5.根據(jù)權利要求3所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，合成Cys-K92-1108片段所用的固相載體是wang —樹脂。
6.根據(jù)權利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，合成Cys-El 10-L136片段和Cys-S138_K158片段所用的固相載體是N-?；?苯并咪唑酮樹脂。
【文檔編號】C07K14/47GK103601798SQ201310555256
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權日:2013年11月11日
【發(fā)明者】王喆明 申請人:杭州璞題生物科技有限公司