專利名稱：特利加壓素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽藥物的制備方法，具體地說，涉及特利加壓素的制備方法。
背景技術(shù)：
特利加壓素的化學(xué)名稱為三甘氨酰賴氨酸加壓素，是一種新型的人工合成的長效血管加壓素制劑。它是一種前體藥物，本身無活性，在體內(nèi)經(jīng)氨基肽酶作用，脫去其N末端的3個甘氨酰殘基后，緩慢“釋放”出有活性的賴氨酸加壓素，因此特利加壓素相當(dāng)于一個能以穩(wěn)定速率釋放出賴氨酸加壓素的儲藏庫。特利加壓素的主要作用是收縮內(nèi)臟血管平滑肌，減少內(nèi)臟血流量(如減少腸系膜、脾、子宮等的血流)，從而減少門靜脈血流、降低門靜脈壓，同時也可作用于食道和子宮等平滑肌。另一方面，在對肝腎綜合征的防治研究中發(fā)現(xiàn)特利加壓素還可降低血漿腎素濃度，從而減少血管緊張素II產(chǎn)生，減輕腎血管收縮，增加肝腎綜合征患者的腎血流量，顯著增加了患者的腎小球濾過率，改善了腎功能。與血管加壓素相比，它作用持久，不引起危險性并發(fā)癥，包括促纖維蛋白溶解以及心血管系統(tǒng)方面的嚴(yán)重并發(fā)癥。目前特利加壓素的制備方法主要包括以下步驟:以RinkAmide樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Gly-OH ;然后加入切肽試劑進行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品，加入堿性物質(zhì)，在pH為7.5 10.0的條件下通空氣氧化，獲得氧化型粗品，最后采用C18(或CS)柱進行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。但是該方法耦聯(lián)采用的縮合劑為TBTU或者HBTU/HOBt，隨著肽鏈的增長，耦聯(lián)越來越困難。此外，特利加壓素的空間位阻大，脫除難度大，也影響了合成的收率。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有特利加壓素的制備方法耦聯(lián)氨基酸，隨著肽鏈的增長，耦聯(lián)越來越困難。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種特利加壓素的制備方法，包括:用脫保護試劑將Rink AmideAM樹脂脫保護，去除Fmoc保護基團；以脫保護后的Rink AmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以1_輕基苯并三氮唑(1-Hydroxybenzotriazole, HOBt) /N，N- 二異丙基碳二亞胺(N, N-diisopropylcarbodiimide, DIC)為縮合劑，依次稱聯(lián)氨基酸，得到特利加壓素肽樹脂；耦聯(lián)第2 12位氨基酸之前，用所述脫保護試劑依次脫去上一位耦聯(lián)產(chǎn)物的Fmoc保護基團；裂解所述特利加壓素肽樹脂，然后加入乙醚沉淀所述特利加壓素肽樹脂，得到還原型特利加壓素粗肽；將所述還原型特利加壓素粗肽環(huán)化得到氧化型特利加壓素粗肽；將所述氧化型特利加壓 素粗肽純化、轉(zhuǎn)鹽、濃縮和凍干得到特利加壓素。進一步,所述脫保護試劑的制備方法為:將哌唳溶于二氯甲燒(dichloromethane,DCM) /氮氮二甲基甲酸胺(N, N-Dimethylformamide, DMF) /N-甲基卩比咯燒酮(N-methy 1-2-pyrrolidone, NMP)溶液中，并加入曲拉通-100,制備得到所述脫保護試劑，其中，DCM/DMF/NMP的體積比=1:1:1，哌啶占所述脫保護試劑的體積百分比為20%，曲拉通-100占所述脫保護試劑的體積百分比為1%;所述脫保護的反應(yīng)溫度為15°C。進一步:所述Rink AmideAM樹脂的替代度< 0.6mmol/g。進一步:稱聯(lián)第I位氨基酸時，Rink AmideAM樹脂:氨基酸:H0Bt:DIC的摩爾比為1:3:3:3 ;耦聯(lián)第2至第6位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物:氨基酸:H0Bt:DIC的摩爾比為1:3:3:3 ;耦聯(lián)第7至第12位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物:氨基酸:H0Bt =DIC的摩爾比為1:3.3:3.3:3.3 ;耦聯(lián)第7 12位氨基酸時，所述脫保護試劑的每次體積用量比耦聯(lián)第I位氨基酸時增加20%。進一步:所述耦聯(lián)的溫度為32°C，時間為2.5 3小時。進一步:所述裂解的裂解液各成分的體積比為三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA):1, 2-乙二硫醇(I, 2-ethanedithiol, EDT):三異丙基娃燒(Triisopropylsilane,TIS):H20=92.5:2.5:4:1，裂解時間為 2h。進一步:所述環(huán)化的氧化劑為雙氧水，pH值為7.1 7.2，時間為2小時。進一步:所述純化的色譜柱為直徑5cm、填料為粒徑IOum的十八烷基鍵合硅膠、孔徑100 A的C18柱，流動相分別為TFA溶液和乙腈，流速為50ml/min，上樣量為3 5g，色譜儀的檢測波長為280nm。進一步:所述轉(zhuǎn)鹽包括離子轉(zhuǎn)換、去離子、平衡 和洗脫，所述轉(zhuǎn)鹽的色譜柱為直徑5cm、填料為粒徑IOum的十八烷基鍵合硅膠、孔徑〗00 A的C18柱，流速為50ml/min，上樣量為5 10g，色譜儀的檢測波長為280nm ;其中，所述離子轉(zhuǎn)換的流動相分別為乙酸銨和乙腈，所述去離子的流動相分別為純水和乙腈，所述平衡的流動相分別為冰醋酸和乙腈，所述洗脫的流動相分別為冰醋酸和乙腈。進一步:所述濃縮的溫度為33°C，真空度彡IOmbar。本發(fā)明的技術(shù)效果如下:1、本發(fā)明采用DIC/HOBt為耦聯(lián)劑，可以加快反應(yīng)速率，降低消旋，使氨基酸的耦聯(lián)效果更好。2、本發(fā)明隨著肽鏈的增長，從耦聯(lián)第7位氨基酸開始，氨基酸和耦聯(lián)劑的摩爾用量增加10%，脫保護試劑的體積用量增加20%，使得耦聯(lián)反應(yīng)的后期連接順利，產(chǎn)品容易純化，收率高。3、本發(fā)明控制耦聯(lián)溫度為32°C，耦聯(lián)2小時后，對耦聯(lián)產(chǎn)物茚檢完全顯陰性，耦聯(lián)
效率高。4、傳統(tǒng)的脫除方法只能脫除大部分的Fmoc基團，要脫除徹底必然損傷肽鏈，增加副反應(yīng)產(chǎn)物，本發(fā)明采用的脫保護試劑，有助于長鏈肽的合成收率，脫除效果好且脫除完全，也有利于降低精制難度。曲拉酮-100可以減小多肽結(jié)構(gòu)的空間位阻，有利于哌啶完全的徹底的脫除Fmoc基團，同時減少哌啶對整個肽鏈的損傷；徹底脫除Fmoc基團有利于合成收率的提聞，大大減小副反應(yīng)廣物的廣生。5、本發(fā)明控制脫保護反應(yīng)溫度，越長的肽鏈，在脫除反應(yīng)時要控制溫度越低，可以有效保護肽鏈不被脫除反應(yīng)放出的熱量破壞，這樣有助于長肽鏈的合成收率，形成的肽鏈完整，也有利于精制難度的降低，從而有效提高產(chǎn)品質(zhì)量。
6、本發(fā)明采用低替代度的Rink AmideAM樹脂，以便減小合成過程中的空間位阻，提高合成效率和產(chǎn)品收率，降低精制難度和成本。
具體實施例方式實施例1制備脫保護試劑脫保護試劑的制備方法為:將哌啶溶于DCM/DMF/NMP溶液中，并加入曲拉通_100，制備得到脫保護試劑，其中DCM/DMF/NMP的體積比=1:1: 1，哌啶占脫保護試劑的體積百分比為20%，曲拉通-100占脫保護試劑的體積百分比為1%。實施例2Rink AmideAM樹脂的預(yù)處理將Rink AmideAM樹脂投入到反應(yīng)器中，先用DMF洗滌一次，抽干。然后用適量DMF常溫溶漲,N2吹拂，攪拌約30min至樹脂充分泡漲，抽干液體。再用DMF洗滌一次，抽干。將Rink AmideAM樹脂在15°C下脫保護反應(yīng)20min去除Fmoc保護基團。脫保護試劑為600ml。Rink AmideAM樹脂的重量濃度為5 10ml/g。該脫保護溫度下可以有效保護肽鏈不被脫保護反應(yīng)放出的熱量 破壞，從而有效提高產(chǎn)品質(zhì)量。然后在室溫下脫保護反應(yīng)20min，排干。最后依次用DMF、甲醇和DMF洗滌，排干。脫保護后，用玻璃棒挑取少許樹脂，茚檢，顯深紫紅色，表明Fmoc已脫，待投料。實施例3氨基酸耦聯(lián)反應(yīng)得到特利加壓素肽樹脂( I)第I位氨基酸的耦聯(lián)第I位氨基酸的耦聯(lián)反應(yīng)的投料配比如表I所示，第I位氨基酸為Fmoc-Gly-OH。表I第I位氨基酸的耦聯(lián)反應(yīng)投料配比
權(quán)利要求
1.一種特利加壓素的制備方法，其特征在于，包括 用脫保護試劑將Rink AmideAM樹脂脫保護,去除Fmoc保護基團； 以脫保護后的Rink AmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以HOBt/DIC為縮合劑，依次耦聯(lián)氨基酸，得到特利加壓素肽樹脂；耦聯(lián)第2 12位氨基酸之前，用所述脫保護試劑依次脫去上一位耦聯(lián)產(chǎn)物的Fmoc保護基團； 裂解所述特利加壓素肽樹脂，然后加入乙醚沉淀所述特利加壓素肽樹脂，得到還原型特利加壓素粗肽； 將所述還原型特利加壓素粗肽環(huán)化得到氧化型特利加壓素粗肽； 將所述氧化型特利加壓素粗肽純化、轉(zhuǎn)鹽、濃縮和凍干得到特利加壓素。
2.如權(quán)利要求I所述的特利加壓素的制備方法，其特征在于，所述脫保護試劑的制備方法為將哌啶溶于DCM/DMF/NMP溶液中，并加入曲拉通-100，制備得到所述脫保護試劑，其中，DCM/DMF/NMP的體積比=1:1:1，哌啶占所述脫保護試劑的體積百分比為20%，曲拉通-100占所述脫保護試劑的體積百分比為1%;所述脫保護的反應(yīng)溫度為15°C。
3.如權(quán)利要求I所述的特利加壓素的制備方法，其特征在于所述RinkAmideAM樹脂的替代度< O. 6mmol/g0
4.如權(quán)利要求I 3任一項所述的特利加壓素的制備方法，其特征在于耦聯(lián)第I位氨基酸時，Rink AmideAM樹脂氨基酸H0Bt :DIC的摩爾比為1:3:3:3 ;耦聯(lián)第2至第6位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物氨基酸H0Bt :DIC的摩爾比為1:3:3:3 ;耦聯(lián)第7至第12位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物氨基酸H0Bt =DIC的摩爾比為1:3. 3:3. 3:3. 3 ;耦聯(lián)第7 12位氨基酸時，所述脫保護試劑的每次體積用量比耦聯(lián)第I位氨基酸時增加20%。
5.如權(quán)利要求4所述的特利加壓素的制備方法，其特征在于所述耦聯(lián)的溫度為32°C，時間為2. 5 3小時。
6.如權(quán)利要求I所述的特利加壓素的制備方法，其特征在于所述裂解的裂解液各成分的體積比為TFA:EDT:TIS:H20=92. 5:2. 5:4:1，裂解時間為2h。
7.如權(quán)利要求I所述的特利加壓素的制備方法，其特征在于所述環(huán)化的氧化劑為雙氧水，PH值為7. I 7. 2，時間為2小時。
8.如權(quán)利要求I所述的特利加壓素的制備方法，其特征在于所述純化的色譜柱為直徑5cm、填料為粒徑IOum的十八烷基鍵合硅膠、孔徑IOOA的C18柱，流動相分別為TFA溶液和乙腈，流速為50ml/min，上樣量為3 5g，色譜儀的檢測波長為280nm。
9.如權(quán)利要求I所述的特利加壓素的制備方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)鹽包括離子轉(zhuǎn)換、去離子、平衡和洗脫，所述轉(zhuǎn)鹽的色譜柱為直徑5cm、填料為粒徑IOum的十八烷基鍵合硅膠、孔徑100 A的C18柱，流速為50ml/min，上樣量為5 10g，色譜儀的檢測波長為280nm ；其中，所述離子轉(zhuǎn)換的流動相分別為乙酸銨和乙腈，所述去離子的流動相分別為純水和乙腈，所述平衡的流動相分別為冰醋酸和乙腈，所述洗脫的流動相分別為冰醋酸和乙腈。
10.如權(quán)利要求I所述的特利加壓素的制備方法，其特征在于所述濃縮的溫度為33°C，真空度≤lOmbar。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特利加壓素的制備方法，包括用脫保護試劑將RinkAmideAM樹脂脫保護，去除Fmoc保護基團；以脫保護后的Rink AmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以HOBt/DIC為縮合劑，依次耦聯(lián)氨基酸，得到特利加壓素肽樹脂；耦聯(lián)第2～12位氨基酸之前，用所述脫保護試劑依次脫去上一位耦聯(lián)產(chǎn)物的Fmoc保護基團；裂解所述特利加壓素肽樹脂，然后加入乙醚沉淀所述特利加壓素肽樹脂，得到還原型特利加壓素粗肽；將所述還原型特利加壓素粗肽環(huán)化得到氧化型特利加壓素粗肽；將所述氧化型特利加壓素粗肽純化、轉(zhuǎn)鹽、濃縮和凍干得到特利加壓素。本發(fā)明的特利加壓素收率達到50%以上。
文檔編號C07K1/16GK103254295SQ20131021436
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月31日
發(fā)明者路兵, 徐偉, 張鴻雁 申請人:青島國大生物制藥股份有限公司