專利名稱：雜色鮑血藍(lán)蛋白Ⅰ和Ⅱ型亞基基因及克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雜色鮑血藍(lán)蛋白I亞基基因及II型亞基基因，本發(fā)明還涉及雜色鮑血藍(lán)蛋白I亞基基因及II型亞基基因克隆方法。
背景技術(shù)：
血藍(lán)蛋白(Hemocyanin)是動(dòng)物界的三大呼吸蛋白之一,主要存在于低等動(dòng)物如節(jié)肢、軟體動(dòng)物的血液中，其活性中心結(jié)合有兩個(gè)Cu+離子，能夠可逆地結(jié)合氧氣。與氧結(jié)合時(shí)，無(wú)色的Cu+變?yōu)樗{(lán)色的Cu2+，從而使血液呈現(xiàn)淡淡的藍(lán)色。血藍(lán)蛋白是一種多功能蛋白， 除最主要的氧氣運(yùn)輸功能外，還在金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)儲(chǔ)存、滲透壓調(diào)節(jié)、蛻皮激素載體、表皮固化等方面發(fā)揮作用，尤其重要的是，近年越來越多的證據(jù)表明它還在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的功能，其中研究最為深入的是酚氧化酶活性。酚氧化酶是先天免疫反應(yīng)中的重要免疫分子，其催化的反應(yīng)及反應(yīng)中產(chǎn)生的活性物質(zhì)可以通過多種方式參與到宿主防御反應(yīng)中。雜色鮑(Haliotis diversicolor)屬軟體動(dòng)物，腹足綱，是我國(guó)南方重要的養(yǎng)殖鮑品種，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是中華民族的傳統(tǒng)美食。由于近年來急速膨脹的鮑養(yǎng)殖業(yè)及日益惡化的養(yǎng)殖環(huán)境，鮑病害呈現(xiàn)出爆發(fā)性的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了極大損害。雜色鮑等低等動(dòng)物缺少特異性免疫系統(tǒng),血藍(lán)蛋白作為其中重要的先天性免疫分子,在鮑血液中的含量非常豐富，因此血藍(lán)蛋白在免疫防御反應(yīng)中扮演著非常重要的角色。此外，由于貝類血藍(lán)蛋白在哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有很好的免疫原性，廣泛用作醫(yī)學(xué)免疫佐劑，但貝類血藍(lán)蛋白基因較大，很難通過基因工程表達(dá)的方法大量生產(chǎn)，只能從甲殼類、貝類等活體中純化，成本很高，因而目前在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有雜色鮑血藍(lán)蛋白的兩個(gè)亞基的核苷酸全基因 序列和蛋白全序列的記載。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供雜色鮑血藍(lán)蛋白I型亞基基因(HdHcl，Haliotisdiversicolor Hemocyanin type I gene)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供雜色鮑血藍(lán)蛋白II型亞基基因(HdHc2，Haliotisdiversicolor Hemocyanin type II gene)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供雜色鮑血藍(lán)蛋白I型亞基基因和II型亞基基因的核苷酸全序列的克隆方法。該方法簡(jiǎn)單易操作，成本低。完整的雜色鮑血藍(lán)蛋白由兩種亞基組成，分別由兩個(gè)基因編碼，命名為HdHcl和HdHc2。而血藍(lán)蛋白具有復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，其酚氧化酶活性需由兩種亞基組成的完整蛋白分子才能發(fā)揮出來，單獨(dú)的HdHcl或者HdHc2蛋白不能發(fā)揮功能。但是，目前尚無(wú)法通過體外表達(dá)的方法生產(chǎn)有天然活性的血藍(lán)蛋白，因此，本發(fā)明先從雜色鮑的血淋巴中提取分離得到一種藍(lán)色蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定以及與NCBI中已知的同源鮑類的血藍(lán)蛋白的肽段序列比對(duì)，確定所獲得的藍(lán)色蛋白具有HdHcl和HdHc2兩種血藍(lán)蛋白亞基的部分肽段序列，同時(shí)具有酚氧化酶活性，進(jìn)而確定所得蛋白為完整的雜色鮑血藍(lán)蛋白。然后，根據(jù)所得HdHcl和HdHc2部分肽段序列，及NCBI中同源性90%的歐洲瘤鮑(Haliotis tuberculata)血藍(lán)蛋白I和II型亞基基因序列(AJ252741和AJ297475)，分別設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)而組建雜色鮑基因組文庫(kù)并從中篩選到了完整的HdHcl和HdHc2基因序列，而血藍(lán)蛋白基因均為單拷貝，且雜色鮑基因組中沒有同源基因，因此根據(jù)所獲得的HdHcl和HdHc2基因序列與所得的質(zhì)譜鑒定的蛋白肽段序列進(jìn)行比對(duì)，從而確定所得HdHcl和HdHc2基因是雜色鮑血藍(lán)蛋白的兩個(gè)亞基基因的核苷酸全序列。本發(fā)明提供的HdHcI核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，該基因序列全長(zhǎng)19339 bp,其對(duì)應(yīng)外顯子(exon)及長(zhǎng)度如表I所示表I :HdHcl核苷酸序列外顯子(exon)及長(zhǎng)度
權(quán)利要求
1.雜色鮑血藍(lán)蛋白I型亞基基因，它的核苷酸序列如SEQID NO. I所示。
2.雜色鮑血藍(lán)蛋白I型亞基蛋白，它的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.雜色鮑血藍(lán)蛋白II型亞基基因，它的核苷酸序列如SEQID NO. 3所示。
4.雜色鮑血藍(lán)蛋白II型亞基蛋白，它的氨基酸序列如SEQID NO. 4所示。
5.雜色鮑血藍(lán)蛋白I型亞基基因和II型亞基基因全序列的克隆方法以雜色鮑肌肉為材料提取基因組DNA，對(duì)得到的基因組DNA進(jìn)行片段化處理，然后對(duì)DNA斷裂末端進(jìn)行補(bǔ)齊和磷酸化修復(fù)，然后進(jìn)行電泳分離片段化DNA，回收38kb-48kb的DNA片段，所回收的DNA片段與pCClFOS載體連接，再經(jīng)噬菌體包裝并轉(zhuǎn)染大腸桿菌，經(jīng)過酶切與測(cè)序鑒定后制備 了雜色鮑基因組文庫(kù)，制備雜色鮑基因組文庫(kù)甘油菌，用HdHcl和HdHc2的上、下游引物通過PCR方法篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序，最終篩選到雜色鮑血藍(lán)蛋白I型和II型亞基基因的核苷酸全序列。
全文摘要
本發(fā)明公開雜色鮑血藍(lán)蛋白Ⅰ和Ⅱ型亞基基因及克隆方法。本發(fā)明提供的雜色鮑血藍(lán)蛋白Ⅰ型亞基基因和Ⅱ型亞基基因有利于針對(duì)血藍(lán)蛋白等雜色鮑體內(nèi)重要免疫分子開展基因功能及其相關(guān)應(yīng)用研究，對(duì)于鮑等經(jīng)濟(jì)貝類病害的防治具有重要意義，且可將雜色鮑血藍(lán)蛋白Ⅰ型亞基基因和Ⅱ型亞基基因資源進(jìn)一步應(yīng)用于免疫醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并降低醫(yī)療成本。
文檔編號(hào)C07K14/795GK102719440SQ201210179890
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者姜敬哲, 張晗, 彭文, 王江勇, 韓燾 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所