一個(gè)微泡膜蛋白及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一個(gè)微泡膜蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的磷酸化CSElL細(xì)胞微泡膜蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞微泡(microvesicles)是由細(xì)胞膜衍生釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的小粒子,其大小約直徑O. Iym至100 μπι。微泡參與蛋白酶、基因、小分子核糖核酸(RNA)、激素受體、細(xì)胞胞器等，在細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移，因而與多種疾病，包括癌癥的惡化有關(guān)(Simak 2006； Cocucci 2009 ；Muralidharan-Chari2010)。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移為癌癥患者死亡的主要因素。腫瘤細(xì)胞藉由分泌蛋白酶，分解細(xì)胞外基質(zhì)而進(jìn)行癌侵襲和癌轉(zhuǎn)移。由腫瘤細(xì)胞釋放的微泡，富含可分解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，從而在癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移上，起到重要作用(Cocucci 2009)。CSElL 蛋白(染色體分離-I 類蛋白，chromosome segregation 1-likeprotein)或稱細(xì)胞凋亡易感蛋白(CAS, cellular apoptosis susceptibility protein)(GenBank登錄號(hào)U33286),高度表現(xiàn)于多種癌癥的組織檢體(Brinkmannl995 ；Tung 2009 ；Tai 2010) o CSElL之前被Scherf等人發(fā)現(xiàn)可被細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulated kinase, E RK)憐酸化，因此是一個(gè)酪氨酸憐酸化蛋白(tyrosinephosphorylated protein),且Scherf等人發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸化的CSElL蛋白其功能在于促使細(xì)胞蛋白由細(xì)胞質(zhì)往細(xì)胞核運(yùn)輸(Scherf 1998)。目前所查資料表明，和CSElL蛋白相關(guān)的專利包括US6，664，057是關(guān)于鑒別一種與癌癥有關(guān)之人類染色體20ql3. 2上之新穎擴(kuò)增子(amplicon)(此擴(kuò)增子含CSElL基因)。US 6，072，031是關(guān)于CSElL之互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary DNA, cDNA)及胺基酸序列，用于偵測(cè)正常細(xì)胞及癌細(xì)胞中CSElL基因之表現(xiàn)及擴(kuò)增，此外將反義CSElL基因序列引入活細(xì)胞中可抑制細(xì)胞凋亡。US 6，207，380是關(guān)于衍生自角蛋白/細(xì)胞角蛋白、CSElL或mat-8的多肽及多核苷酸于人體泌尿道組織之表現(xiàn)，用于偵測(cè)、診斷、監(jiān)測(cè)、活體內(nèi)造影、預(yù)防或治療個(gè)體罹患泌尿系統(tǒng)疾病(如泌尿系統(tǒng)癌)。US 6，207，380亦揭示特異結(jié)合至泌尿道組織角蛋白/細(xì)胞角蛋白、CSElL或mat-8編碼之多肽或蛋白質(zhì)之抗體，該分子有助于治療泌尿道疾病。故US6，207, 380描述利用特異結(jié)合至泌尿道組織之角蛋白/細(xì)胞角蛋白、CSElL或mat-8之抗體以治療泌尿道疾病。US 6，232，086揭示CSElL之互補(bǔ)脫氧核糖核酸及胺基酸序列，用于偵測(cè)正常細(xì)胞及癌細(xì)胞中CSElL基因之表現(xiàn)及擴(kuò)增。US 6，156，564是關(guān)于偵測(cè)人類增生性細(xì)胞之方法，其包含測(cè)量人體組織檢體中CSElL蛋白質(zhì)之表現(xiàn)量，以及偵測(cè)該人類蛋白質(zhì)表現(xiàn)量較正常非增生性人類細(xì)胞之CSElL蛋白質(zhì)表現(xiàn)量高至少兩倍以上。US 6，440，737是關(guān)于調(diào)控CSElL基因表現(xiàn)之反義化合物、組合物及方法。US20080081339是關(guān)于測(cè)量幾十個(gè)體液抗體，包括體液中CSElL “自體抗體“(非CSElL蛋白)作為前列腺癌的診斷標(biāo)志物。US20050260639是關(guān)于檢測(cè)從體液或身體組織分離出之“癌細(xì)胞”內(nèi)的CSE1L，以診斷胰腺癌。W02009/052573是關(guān)于檢測(cè)從體液或身體組織分離出之“癌細(xì)胞”內(nèi)的幾百個(gè)轉(zhuǎn)錄核糖核酸包括CSElL的核糖核酸，以診斷胃腸癌。US20100120074是關(guān)于測(cè)量體液中的CSElL蛋白以診斷轉(zhuǎn)移性癌癥。由上述之說(shuō)明可知這些先前技藝(專利)的內(nèi)容，都在偵測(cè)細(xì)胞層級(jí)之CSElL基因表現(xiàn)或體液CSElL蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一方面涉及于體外分離、結(jié)合或檢測(cè)微泡的方法，用以診斷或治療疾病。在本發(fā)明的一方面涉及診斷腫瘤的方法，包含以下步驟1)取得哺乳動(dòng)物之體液；2)于體外檢測(cè)受檢測(cè)個(gè)體體液中微泡的CSElL或磷酸化CSElL量；2)于體外檢測(cè)正常個(gè)體體液中微泡的CSElL或磷酸化CSElL量做為對(duì)照組；3)依據(jù)受檢測(cè)個(gè)體與對(duì)照組個(gè)體 體液中微泡的CSElL或磷酸化CSElL量的差別，判別受檢測(cè)個(gè)體是否有腫瘤。在本發(fā)明的一方面涉及診斷腫瘤的方法，包含以下步驟1)取得哺乳動(dòng)物之體液；2)于體外檢測(cè)受檢測(cè)個(gè)體體液中磷酸化CSElL量；2)于體外檢測(cè)正常個(gè)體體液中磷酸化CSElL量做為對(duì)照組；3)依據(jù)受檢測(cè)個(gè)體與對(duì)照組個(gè)體體液中磷酸化CSElL量的差別，判別受檢測(cè)個(gè)體是否有腫瘤。在本發(fā)明的一方面涉及由體液分離微泡的方法，包含以下步驟1)取得哺乳動(dòng)物之體液；2)于體外以可和CSElL或磷酸化CSElL結(jié)合的抗體，分離與抗體結(jié)合之微泡。在本發(fā)明的一方面涉及檢測(cè)體液中微泡的方法，包含以下步驟1)取得哺乳動(dòng)物之體液；2)于體外以抗CSElL抗體或抗磷酸化CSElL抗體，檢測(cè)與抗體結(jié)合之微泡。在本發(fā)明的一方面也涉及以可和CSElL或磷酸化CSElL結(jié)合的抗體與細(xì)胞微泡結(jié)合，用于預(yù)防或治療疾病的方法。優(yōu)先考慮的疾病是癌癥。在本發(fā)明的一方面也涉及以含有抗CSElL抗體或抗磷酸化CSElL抗體的組合物與細(xì)胞微泡結(jié)合，以用于診斷或治療疾病。優(yōu)先考慮的疾病是癌癥。本發(fā)明的其它用途，特點(diǎn)，及優(yōu)點(diǎn)可以從下面的詳細(xì)描述和數(shù)據(jù)圖標(biāo)中顯示。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例I的圖，以免疫墨點(diǎn)法(immunoblotting),分析B16-dEV,B16-ras, B16-CSE1L，和 B16_Ras/anti_CSElL 細(xì)胞的 Ras 和 CSElL 蛋白的表達(dá)量。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的圖，顯示v-H-ras癌基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)癌細(xì)胞微泡生成。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3的圖，顯示v-H-ras癌基因轉(zhuǎn)染增加癌細(xì)胞分泌CSE1L。圖4為本發(fā)明實(shí)施例4的圖，顯示CSElL是一個(gè)磷酸化的蛋白。圖5為本發(fā)明實(shí)施例5的圖，顯示v-H-ras癌基因轉(zhuǎn)染增加癌細(xì)胞內(nèi)CSElL蛋白之磷酸化，以及磷酸化CSElL蛋白存在于癌血清中。圖6為本發(fā)明實(shí)施例6的圖，顯示磷酸化ERK與CSElL高表達(dá)于大腸直腸癌腫瘤，且相對(duì)表染色強(qiáng)度一致。圖7為本發(fā)明實(shí)施例7的圖，顯示CSElL介導(dǎo)v-H-ras癌基因所誘導(dǎo)的癌細(xì)胞微泡生成。
圖8為本發(fā)明實(shí)施例8的圖，顯示CSElL介導(dǎo)v-H-ras癌基因所誘導(dǎo)的癌細(xì)胞侵襲。圖9為本發(fā)明實(shí)施例9的圖，顯示CSElL介導(dǎo)v-H-ras癌基因所誘導(dǎo)的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。圖10為本發(fā)明實(shí)施例10的圖，顯示CSElL位于微泡膜，而且抗CSElL的抗體能夠?qū)ふ也⒔Y(jié)合腫瘤。圖11為本發(fā)明實(shí)施例11的圖，顯示抗磷酸化CSElL抗體針對(duì)磷酸化CSElL蛋白 的專一'I"生結(jié)合。圖12為本發(fā)明實(shí)施例12的圖，顯示磷酸化CSElL蛋白位于細(xì)胞微泡。圖13為本發(fā)明實(shí)施例13的圖，顯示相對(duì)于由健康獻(xiàn)血者血清中分離到的微泡，由癌癥患者血清中分離到的微泡有較高的CSElL和磷酸化CSElL盛行率。圖14為本發(fā)明實(shí)施例14的圖，顯示相對(duì)于健康獻(xiàn)血者血清的磷酸化CSE1L，癌癥患者血清有較高的磷酸化CSElL盛行率。
具體實(shí)施例方式細(xì)胞微泡為由細(xì)胞產(chǎn)生，分布于細(xì)胞膜，或從細(xì)胞釋放，可發(fā)現(xiàn)于體液和培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基(Simak 2006 ； Cocucci 2009 ； Mur a I i dhar an-Char i 2010)。本發(fā)明所述的微泡，包括及適用于與細(xì)胞膜結(jié)合的微泡，及從細(xì)胞釋放的微泡。本發(fā)明所述的微泡，也包括及適用于所有大小的細(xì)胞微泡。本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)CSElL調(diào)控細(xì)胞生成微泡、磷酸化CSElL位于微泡的膜上、磷酸化CSElL普遍存在于癌癥患者的血清中。微泡在多種疾病尤其癌癥惡化過(guò)程中起重要的作用(Simak 2006)。因此，可與CSElL或磷酸化CSElL結(jié)合的組合物，如抗CSElL抗體或抗磷酸化CSElL抗體與其衍生物、以及藥品的成分，可以用于檢測(cè)或結(jié)合體液微泡，進(jìn)而診斷或控制疾病。微泡參與蛋白酶、基因、小分子核糖核酸、激素受體、細(xì)胞胞器等在細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移，因而與多種疾病，包括凝血疾病，傷口愈合，動(dòng)脈粥樣硬化，冠狀動(dòng)脈疾病，糖尿病，血液病，傳染病，炎癥性疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，癌癥等的惡化有關(guān)(Simak 2006 ;Cocucci2009 ；Muralidharan-Chari 2010)。因此,微泡的蛋白分子,尤其是位于微泡膜上的蛋白分子，可以用來(lái)作為診斷疾病的標(biāo)志物。另外，可以利用和微泡膜蛋白結(jié)合的抗體或組合物與微泡結(jié)合，應(yīng)用于醫(yī)療成像或治療疾病。在本發(fā)明的另一的發(fā)現(xiàn)是，CSElL與Ras和ERK細(xì)胞信號(hào)通路連結(jié)，激活的Ras和ERK信號(hào)通路可磷酸化CSE1L，磷酸化CSElL普遍性地存在于癌癥患者血清中。另外，在癌癥的診斷上,檢測(cè)血清磷酸化CSElL的癌癥檢驗(yàn)靈敏度，高于檢測(cè)血清非磷酸化CSElL的癌癥檢驗(yàn)敏度。因此，磷酸化CSElL具有癌癥診斷的臨床應(yīng)用性。本發(fā)明的另一發(fā)現(xiàn)是，癌癥患者的體液中有磷酸化CSElL存在，而且雖然正常(健康)人的體液也有CSElL存在，但是在正常人的體液中很難檢測(cè)到磷酸化CSElL(實(shí)施例5)。之前有研究指出，一個(gè)可被細(xì)胞分泌的蛋白若同時(shí)具有蛋白磷酸化形(phosphorylatedform)和去磷酸化形(dephosphorylated form),則并非此蛋白的磷酸化形和去磷酸化形都可被細(xì)胞分泌(Konishi 1994 ；Fendrick 1997)。因此，本發(fā)明的另一發(fā)現(xiàn)是磷酸化CSElL是一種分泌蛋白，且磷酸化CSElL可在癌癥患者的體液中被檢測(cè)到。
本發(fā)明的另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是磷酸化CSElL為微泡的膜蛋白，且抗CSElL的抗體能夠?qū)ふ也⒔Y(jié)合腫瘤。經(jīng)腫瘤細(xì)胞釋放的微泡仍然殘留在腫瘤周圍環(huán)境。因此，利用CSElL結(jié)合劑或磷酸化CSElL結(jié)合劑與治療藥物或細(xì)胞毒性劑結(jié)合，可應(yīng)用于癌癥治療。此外，利用CSElL結(jié)合劑或磷酸化CSElL結(jié)合劑與可發(fā)出熒光、幅射或其它可被偵測(cè)訊息的物質(zhì)結(jié)合，可應(yīng)用于疾病醫(yī)療成像。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及利用可結(jié)合CSEIL或磷酸化CSEIL的組合物或抗體，應(yīng)用于生物體液內(nèi)微泡，包括細(xì)胞條件培養(yǎng)液(cell conditioned media)內(nèi)微泡的分離和分析。所述包括可結(jié)合CSElL或磷酸化CSElL的化合物或抗體的方法或試劑套組盒，適用于(但不僅限于)，超速離心(ultracentrifugation),免疫親和純化(immunoprecipitation),親和純化(affinity purification), (microfiltration),流式細(xì)胞儀或突光激活細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorter),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay),抗體芯片(microarray),生物芯片(biochips),色譜法(chromatography),免疫墨點(diǎn)法(immunoblotting),微流體系統(tǒng)(microfluidic systems),微流控芯片(microfluidic chip),及其它免疫學(xué)技術(shù)。·
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及以包含CSElL結(jié)合劑或磷酸化CSElL結(jié)合劑的方法或試劑盒，分離、分析或結(jié)合微泡，以診斷或監(jiān)測(cè)疾病。CSElL或磷酸化CSElL的分析可以是定量(quantitative)或定性(qualitative)分析，并將分析結(jié)果與同時(shí)對(duì)一個(gè)或多個(gè)確定沒(méi)有疾病的生物體(做為對(duì)照組)的體液微泡內(nèi)CSElL或磷酸化CSElL的分析結(jié)果進(jìn)行比較。如果受檢測(cè)個(gè)體體液微泡內(nèi)CSElL或磷酸化CSElL量與對(duì)照組進(jìn)行比較結(jié)果有差異，可以指出腫瘤的狀況，例如有無(wú)腫瘤和腫瘤惡性程度的變化。由于體液中的微泡可能被溶解，因此微泡所載磷酸化CSElL可釋放到體液。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及以包含可以和磷酸化CSElL結(jié)合的結(jié)合劑(例如抗磷酸化CSElL的抗體)的方法或試劑盒，分離或分析體液內(nèi)磷酸化CSE1L，以診斷或監(jiān)測(cè)疾病。磷酸化CSElL的分析可以是定性性或定量性分析，并將分析結(jié)果與同時(shí)對(duì)一個(gè)或多個(gè)確定沒(méi)有疾病生物體(做為對(duì)照組)的體液內(nèi)磷酸化CSElL的分析結(jié)果進(jìn)行比較。如果受檢測(cè)個(gè)體體液磷酸化CSElL量與對(duì)照組進(jìn)行比較結(jié)果有差異，可以指出腫瘤的狀況，例如有無(wú)腫瘤和腫瘤惡性程度的變化。本發(fā)明亦提供應(yīng)用于上述偵測(cè)及診斷之套組。于診斷或偵測(cè)應(yīng)用上，該套組可包含下述任何一者或所有檢測(cè)試劑、緩沖液、抗磷酸化CSElL抗體或可與磷酸化CSElL蛋白或磷酸化CSElL多肽結(jié)合且可顯示體液或體液微泡內(nèi)磷酸化CSElL蛋白或磷酸化CSElL多肽含量之化學(xué)藥品、多肽及其它分子。本發(fā)明所述的“體液(biological fluid) ”指的是可由生物任何部位分離的流體樣品，包括但不限于血液，血清，血漿，尿液，淋巴液，腦脊液，痰液，胸腔液，乳頭吸出液，呼吸道液，腸道液，泌尿生殖道液，乳汁，淚液，唾液，淋巴液，精液，腦脊液，腹水，羊水，腫瘤囊液。也包括細(xì)胞條件培養(yǎng)液。在體液樣本的微泡也包括存在于體液樣本內(nèi)之細(xì)胞細(xì)胞膜上的微泡。細(xì)胞條件培養(yǎng)液為已經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間的培養(yǎng)液?！叭〉皿w液樣本”意指獲取用于本發(fā)明所描述方法之體液樣本。本發(fā)明所述的“腫瘤”是指?jìng)€(gè)體具有引發(fā)癌癥之細(xì)胞存在。具有引發(fā)癌癥之細(xì)胞通常具有失控之增生、永生、轉(zhuǎn)移潛力、及某些特有的細(xì)胞型態(tài)及細(xì)胞標(biāo)記之典型特征。在某些情況下，癌細(xì)胞呈腫瘤形式，但其亦可能于動(dòng)物體中單獨(dú)存在或以獨(dú)立細(xì)胞形式(如白血病細(xì)胞)于血流中循環(huán)。本發(fā)明所述的“個(gè)體(subject) ”是指其細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生微泡的動(dòng)物。動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，尤其是人類。本發(fā)明所述的“正常個(gè)體(normal subject) ”是指?jìng)€(gè)體沒(méi)有腫瘤或其它疾病。本發(fā)明所述的“受檢測(cè)個(gè)體(test subject) ”是指要被檢測(cè)有沒(méi)有腫瘤或其它疾病的個(gè)體。本發(fā)明所述的“于體外(in vitro) ”是指在一個(gè)活的個(gè)體之外的環(huán)境，通常是一種人工環(huán)境，如試管中或培養(yǎng)的環(huán)境。
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本發(fā)明所述的“免疫學(xué)技術(shù)(immunological techniques) ”是指涉及任何以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，包括但不限于，斑點(diǎn)雜交，免疫墨點(diǎn)法，免疫沉淀，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),和放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)技術(shù)。本發(fā)明所述的“斑點(diǎn)雜交(dot blot assay) ”是指將樣本固定在紙、玻璃纖維、或塑料板材的表面，可以用很多方法，包括以直接或間接標(biāo)記抗體的雜交，檢測(cè)待檢測(cè)蛋白，待檢測(cè)蛋白的存在會(huì)形成明顯的檢測(cè)信號(hào)。本發(fā)明所述的“腫瘤祀向性(tumor targeting) ”是指化合物偏好或優(yōu)先和腫瘤結(jié)合的能力。一個(gè)腫瘤靶向藥物成分是指藥物成分可偏好或優(yōu)先結(jié)合到腫瘤組織。本發(fā)明所述的“癌癥治療(cancer therapy) ”是指可控制腫瘤生長(zhǎng)，侵襲，轉(zhuǎn)移，或癌癥死亡率的技術(shù)、步驟、或物質(zhì)。本發(fā)明所述的“醫(yī)療成像(medical imaging) ”是指臨床用途或醫(yī)療科學(xué)研究，使人體或動(dòng)物組織器官產(chǎn)生圖像的技術(shù)。本發(fā)明所述的“治療藥劑(therapeutic agent) ”是指對(duì)癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，生長(zhǎng)抑制，或免疫抑制效果的藥劑或化合物。本發(fā)明所述的“抗體(antibody) ”是指(一)與相應(yīng)抗原(如CSElL或磷酸化CSE1L)發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白、免疫球蛋白多肽免疫活性部分(即免疫球蛋白的多肽，或片段及其包含抗原結(jié)合位點(diǎn)，可結(jié)合到一個(gè)特定的抗原(如CSElL或磷酸化CSEIL);或(二)任何免疫球蛋白的多肽或片段的衍生物等可結(jié)合到抗原(如CSElL或磷酸化 CSEIL)。本發(fā)明所述的抗體可以用已知的技術(shù)及方法生產(chǎn)。例如，單克隆抗體(monoclonalantibodies)、雜交瘤細(xì)胞(hybridoma)、重組抗體(recombinant antibodies)、卩遼菌體展不(phage display)等技術(shù)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明所述的抗CSElL抗體，或抗磷酸化CSElL抗體與微泡間的結(jié)合反應(yīng)，是以免疫原理技巧檢測(cè)。在典型的免疫檢測(cè)，可以將細(xì)胞、微泡或抗體固定于支持物(管柱、膜、或膠粒)上，分離掉未反應(yīng)或未結(jié)合的物質(zhì)后，可檢測(cè)這些抗體與微泡間的結(jié)合。固定細(xì)胞、微泡或抗體的方法為已知的技術(shù)。例如，它們可以經(jīng)由化學(xué)聯(lián)結(jié)(chemical linking)反應(yīng)或物理吸附(physical adsorption)方法直接固定到固相(solid phase)物質(zhì)上。另外，本發(fā)明的抗體經(jīng)過(guò)生物素聯(lián)結(jié)生物素化(biotinylated)后，也可將抗體間接地固定到吸附抗生素蛋白(avidin)或鏈霉抗生素蛋白(streptavidin)的固相物質(zhì)上。當(dāng)抗體聯(lián)結(jié)到磁性粒子，不僅抗體，包括微泡也可以快速且方便地被檢測(cè)和使用磁鐵分離。另外，當(dāng)使用一種可識(shí)別多種抗原的抗體，例如多重特異性抗體(multispecific antibody),該抗體結(jié)合微泡上的CSElL或磷酸化CSE1L，然后也可以再結(jié)合其它抗原蛋白。另外，抗體也可以經(jīng)過(guò)蛋白A(protein A)或G(protein G)或類似物固定到固相物質(zhì)上。本發(fā)明所述的固定抗體的時(shí)間沒(méi)有特別限制，抗體可在與體液樣本混合接觸之前，之后，或同時(shí)間被固定?？梢允褂萌魏蔚墓滔辔镔|(zhì)固定抗體，此類固相物質(zhì)包括以玻璃、有機(jī)聚合物、聚苯乙烯、娃膠(silica gel)、氧化招、活性炭等物質(zhì)制成之纖維膜、粒子、纖維載體等。例如，本發(fā)明的抗體可以固定到試管、盤(pán)、碟子、或小珠子的反應(yīng)容器的內(nèi)壁。使用本發(fā)明所述抗體檢測(cè)或定量微泡，包括但不限于以下免疫學(xué)方法，例如，熒光抗體法，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA),放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA),免疫組織化學(xué)染色(見(jiàn) Monoclonal Antibodies Principle and Pract ice, 3rd ed. (1996) AcademicPress)，免疫墨點(diǎn)法，及免疫沉淀。本發(fā)明所述的“平均量(average amount) ”之計(jì)算方法,為在一個(gè)或多個(gè)樣本,先確定CSElL或磷酸化CSElL在每個(gè)樣本內(nèi)的值(水平)或濃度，然后計(jì)算CSElL或磷酸化CSElL在這些樣本的平均值或平均濃度。平均值可以由多個(gè)樣本的單獨(dú)值經(jīng)過(guò)總加而成為總加值，再除以值的個(gè)數(shù)決定平均值?！拔⑴莸腃SElL的平均量”是指在一個(gè)或多個(gè)對(duì)照體液樣本內(nèi)，CSElL蛋白在微泡的平均量。“微泡的磷酸化CSElL的平均量”是指在一個(gè)或多個(gè)對(duì)照體液樣本內(nèi)，磷酸化CSElL蛋白在微泡的平均量?！绑w液樣本中的磷酸化CSElL的平均量”是指在一個(gè)或多個(gè)對(duì)照體液樣本內(nèi)，磷酸化CSElL蛋白的平均量。受檢測(cè)體液樣本內(nèi)微泡的CSElL或磷酸化CSElL的量，或受檢測(cè)體液樣本內(nèi)磷酸化CSElL的量，高于對(duì)照組體液樣本中的CSElL或磷酸化CSElL的平均量，是指和對(duì)照組體液樣本比較下，受檢測(cè)體液樣本CSElL或磷酸化CSElL量的增加?！傲康脑黾印蓖ǔＪ侵辽?0%，或至少有20%或50%，或100%，或至少2倍，或至少是5倍，或者可高達(dá)10倍甚至20倍的增加。本發(fā)明所述的“臨界值(cut-off value)”或“陽(yáng)性判定值”是指一個(gè)閾值，用以區(qū)分及判斷受檢測(cè)個(gè)體是否患有疾病或其疾病之情況。臨界值是一個(gè)由統(tǒng)計(jì)得出的適當(dāng)數(shù)值，使用于疾病診斷上，其中測(cè)試值的平均(mean)和標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation, SD)從同一類患者測(cè)試及計(jì)算獲得。當(dāng)病人的測(cè)試值小于這個(gè)臨界值時(shí)，病人被視為陰性(例如無(wú)腫瘤)，當(dāng)病人的測(cè)試值大于或等于臨界值，病人被視為陽(yáng)性(例如有腫瘤)。本發(fā)明所述的“藥物組合(pharmaceutical composition) ”是指一種或多種藥物及一種或多種輔藥、藥物賦形劑的組合。本發(fā)明所述的“藥物的賦形劑、稀釋劑或載體(pharmaceutical excipient,diluent or carrier) ”包括任何經(jīng)政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)核準(zhǔn)的藥用輔料,稀釋劑或載體,例如磷酸鹽緩沖液、水、水油乳液等。也包括任何藥典中使用的藥劑。本發(fā)明所述的“試劑盒(kit) ”或“試劑套組”是指配有進(jìn)行分析或測(cè)定所必需的全部試劑的成套用品。試劑盒內(nèi)包含一個(gè)或多個(gè)試劑項(xiàng)目，包括但不限于，化合物、組合物成分、儀器或設(shè)備等。本發(fā)明所述的試劑盒可以附或不附使用說(shuō)明或操作手冊(cè)。除非另有定義，本發(fā)明所述的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)和一般慣用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有相同含義。本發(fā)明不限于本發(fā)明所述的特定檢測(cè)方法、檢測(cè)指導(dǎo)準(zhǔn)則(protocol)、和檢測(cè)試劑，因?yàn)檫@些檢測(cè)方法和試劑可適度改變而能達(dá)到相同結(jié)果與目的。本發(fā)明所使用的科學(xué)術(shù)語(yǔ)是為了要做具體化的描述，并不是要限制本發(fā)明的范圍或領(lǐng)域。
CSElL蛋白及其編碼基因?yàn)橐阎募妓嚒SElL基因(GenBank編號(hào)U33286)之脫氧核糖核酸(DNA)序列如下所示序列I (SEQ ID NO. 1)I gtcgcgccat tttgccgggg tttgaatgtg aggcggagcg gcggcaggagcggatagtgc61 cagctacggt ccgcggctgg ggttccctcc tccgtttctg tatccccacgagatcctata121 gcaatggaac tcagcgatgc aaatctgcaa acactaacag aatatttaaagaaaacactt181 gatcctgatcctgccatccg acgtccagct gagaaatttc ttgaatctgttgaaggaaat 241 cagaattatccactgttgct tttgacatta ctggagaagt cccaggataatgttatcaaa301 gtatgtgcttcagtaacatt caaaaactat attaaaagga actggagaattgttgaagat361 gaaccaaacaaaatttgtga agccgatcga gtggccatta aagccaacatagtgcacttg421 atgcttagcagcccagagca aattcagaag cagttaagtg atgcaattagcattattggc481 agagaagattttccacagaa atggcctgac ttgctgacag aaatggtgaatcgctttcag541 agtggagatttccatgttat taatggagtc ctccgtacag cacattcattatttaaaaga601 taccgtcatgaatttaagtc aaacgagtta tggactgaaa ttaagcttgttctggatgcc661 tttgctttgcctttgactaa tctttttaag gccactattg aactctgcagtacccatgca721 aatgatgcctctgccctgag gattctgttt tcttccctga tcctgatctcaaaattgttc781 tatagtttaaactttcagga tctccctgaa ttttgggaag gtaatatggaaacttggatg841 aataatttccatactctctt aacattggat aataagcttt tacaaactgatgatgaagag901 gaagccggcttattggagct cttaaaatcc cagatttgtg ataatgccgcactctatgca961 caaaagtacgatgaagaatt ccagcgatac ctgcctcgtt ttgttacagccatctggaat1021 ttactagttacaacgggtca agaggttaaa tatgatttgt tggtaagtaatgcaattcaa1081 tttctggcttcagtttgtga gagacctcat tataagaatc tatttgaggaccagaacacg1141 ctgacaagtatctgtgaaaa ggttattgtg cctaacatgg aatttagagctgctgatgaa1201 gaagcatttgaagataattc tgaggagtac ataaggagag atttggaaggatctgatatt1261 gatactagacgcagggctgc ttgtgatctg gtacgaggat tatgcaagttttttgaggga1321 cctgtgacaggaatcttctc tggttatgtt aattccatgc tgcaggaatacgcaaaaaat1381 ccatctgtcaactggaaaca caaagatgca gccatctacc tagtgacatctttggcatca1441 aaagcccaaacacagaagca tggaattaca caagcaaatg aacttgtaaacctaactgag1501 ttctttgtgaatcacatcct ccctgattta aaatcagcta atgtgaatgaatttcctgtc1561 cttaaagctgacggtatcaa atatattatg atttttagaa atcaagtgccaaaagaacat1621 cttttagtctcgattcctct cttgattaat catcttcaag ctggaagtattgttgttcat1681 acttacgcagctcatgctct tgaacggctc tttactatgc gagggcctaacaatgccact1741 ctctttacagctgcagaaat cgcaccgttt gttgagattc tgctaacaaaccttttcaaa1801 gctctcacacttcctggctc ttcagaaaat gaatatatta tgaaagctatcatgagaagt1861 ttttctctcctacaagaagc cataatcccc tacatcccta ctctcatcactcagcttaca1921 cagaagctattagctgttag taagaaccca agcaaacctc actttaatcactacatgttt1981 gaagcaatatgtttatccat aagaataact tgcaaagcta accctgctgctgttgtaaat2041 tttgaggaggctttgttttt ggtgtttact gaaatcttac aaaatgatgtgcaagaattt2101 attccatacgtctttcaagt gatgtctttg cttctggaaa cacacaaaaatgacatcccg
2161 tcttcctata tggccttatt tcctcatctc cttcagccag tgctttggga aagaacagga2221 aatattcctg ctctagtgag gcttcttcaa gcattcttag aacgcggttc aaacacaata2281 gcaagtgctg cagctgacaa aattcctggg ttactaggtg tctttcagaa gctgattgca2341 tccaaagcaa atgaccacca aggtttttat cttctaaaca gtataataga gcacatgcct2401 cctgaatcag ttgaccaata taggaaacaa atcttcattc tgctattcca gagacttcag2461 aattccaaaa caaccaagtt tatcaagagt tttttagtct ttattaattt gtattgcata2521 aaatatgggg cactagcact acaagaaata tttgatggta tacaaccaaa aatgtttgga 2581 atggttttgg aaaaaattat tattcctgaa attcagaagg tatctggaaa tgtagagaaa2641 aagatctgtg cggttggcat aaccaactta ctaacagaat gtcccccaat gatggacact2701 gagtatacca aactgtggac tccattatta cagtctttga ttggtctttt tgagttaccc2761 gaagatgata ccattcctga tgaggaacat tttattgaca tagaagatac accaggatat2821 cagactgcct tctcacagtt ggcatttgct gggaaaaaag agcatgatcc tgtaggtcaa2881 atggtgaata accccaaaat tcacctggca cagtcacttc acatgttgtc taccgcctgt2941 ccaggaaggg ttccatcaat ggtgagcacc agcctgaatg cagaagcgct ccagtatctc3001 caagggtacc ttcaggcagc cagtgtgaca ctgctttaaa ctgcattttt ctaatgggct3061 aaacccagat ggtttcctag gaaatcacag gcttctgagc acagctgcat taaaacaaag3121 gaagttttcc ttttgaactt gtcacgaCSElL蛋白(蛋白質(zhì)ID編號(hào)AAC50367. I)之胺基酸序列如下所示序列2 (SEQ ID NO. 2)MELSDANLQTLTEYLKKTLDPDPAIRRPAEKFLESVEGNQNYPLLLLTLLEKSQDNVIKVCASVTFKNYIKRNWRIVEDEPNKICEADRVAIKANIVHLMLSSPEQIQKQLSDAISIIGREDFPQKWPDLLTEMVNRFQS⑶FHVINGVLRTAHSLFKRYRHEFKSNELWTEIKLVLDAFALPLTNLFKATIELCSTHANDASALRILFSSLILISKLFYSLNFQDLPEFWEGNMETWMNNFHTLLTLDNKLLQTDDEEEAGLLELLKSQICDNAALYAQKYDEEFQRYLPRFVTAIWNLLVTTGQEVKYDLLVSNAIQFLASVCERPHYKNLFEDQNTLTSICEKVIVPNMEFRAADEEAFEDNSEEYIRRDLEGSDIDTRRRAACDLVRGLCKFFEGPVTGIFSGYVNSMLQEYAKNPSVNWKHKDAAIYLVTSLASKAQTQKHGITQANELVNLTEFFVNHILPDLKSANVNEFPVLKADGIKYIMIFRNQVPKEHLLVSIPLLINHLQAGSIWHTYAAHALERLFTMRGPNNATLFTAAEIAPFVEILLTNLFKALTLPGSSENEYIMKAIMRSFSLLQEAIIPYIPTLITQLTQKLLAVSKNPSKPHFNHYMFEAICLSIRITCKANPAAVVNFEEALFLVFTEILQNDVQEFIPYVFQVMSLLLETHKNDIPSSYMALFPHLLQPVLWERTGNIPALVRLLQAFLERGSNTIASAAADKIPGLLGVFQKLIAS
KANDHQGFYLLNSIIEHMPPESVDQYRKQIFILLFQRLQNSKTTKFIKSFLVFINLYCIKYGALALQEIFDGIQPKMFGMVLEKI11PEIQKVSGNVEKKICAVGITNLLTECPPMMDTEYTKLWTPLLQSLIGLFELPEDDTIPDEEHFIDIEDTPGYQTAFSQLAFAGKKEHDPVGQMVNNPKIHLAQSLHMLSTACPGRVPSMVSTSLNAEALQYLQGYLQAASVTLL用于產(chǎn)生抗磷酸化CSElL (蛋白質(zhì)ID編號(hào)AAC50367. I)抗體之磷酸化肽的氨基酸序列如下序列3 (SEQ ID NO. 3)
LTpEYpLKKTLDPDPAC[Tp 代表磷酸化蘇氨酸(phosphothreonine)，Yp 代表磷酸化酪氨酸(phosphotyrosine)]實(shí)施例抗體實(shí)施例所使用之抗體為抗p21/ras抗體(EP1125Y) (Epitomics，美國(guó))；抗CSElL 抗體(3D8)，抗 MAPK1/MAPK3 抗體(phospho T202/204，G15-B) (Abnova，臺(tái)灣，中國(guó))；抗CSElL抗體(24)，抗磷酸化酪氨酸抗體(PY20)，抗磷酸化絲氨酸及磷酸化蘇氨酸(phospho-serine/threonine)抗體(22A/pSer/Thr) (BD Pharmingen,美國(guó))；抗 β-微管蛋白抗體(D66) (Sigma Chemicals，美國(guó))；抗β-肌動(dòng)蛋白抗體(Ab_5)，抗GFP抗體(Ab-I) (Lab Vision，美國(guó))；抗匪 _2抗體(H-76)，抗磷酸化蘇氨酸抗體(H2) (Santa CruzBiotechnology，美國(guó))；山羊抗小鼠 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories，美國(guó))；聯(lián)結(jié)Alexa Fluor 488(或568)的山羊抗小鼠(或抗兔)IgG二級(jí)抗體(Molecular Probes，美國(guó))?！せ虮磉_(dá)載體pZIP-v-H-ras為一種可以表達(dá)v_H_Ras蛋白的表達(dá)載體，含有新霉素(neomycin)轉(zhuǎn)染選擇標(biāo)記，由Dr. Charming J Der提供。pcDNA-CSElL為一種可以表達(dá)CSElL蛋白的表達(dá)載體，含有新霉素轉(zhuǎn)染選擇標(biāo)記，為之前自行建構(gòu)(Tung 2009) ο可降低細(xì)胞CSElL基因表達(dá)的 CSElL 短發(fā)夾 RNA (shRNA，short hairpin RNA)載體(SC-29909-SH，Santa CruzBiotechnology)，和其對(duì)照控制 shRNA 載體(SC-108060, Santa Cruz Biotechnology),含有P票呤霉素(puromycin)轉(zhuǎn)染選擇標(biāo)記，購(gòu)自Santa Cruz公司(Santa CruzBiotechnology)。細(xì)胞和基因轉(zhuǎn)染B16F10 黑色素瘤細(xì)胞系購(gòu)自 American Type Culture Collection (美國(guó))。以 10% 之胎牛血清(FBS)、100units/mL 青霉素(penicillin)、100mg/mL 鏈霉素(streptomycin)及 2mM 谷氨酸(glutamate)補(bǔ)充之 DMEM 培養(yǎng)基(Dulbecco' s ModifiedEagle' s Medium)于37°C，濕潤(rùn)之5 % CO2大氣條件下培養(yǎng)細(xì)胞。利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑Lipofectamine plus reagent (Invitrogen，美國(guó))以基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以高濃度新霉素和嘌呤霉素篩選經(jīng)轉(zhuǎn)染之細(xì)胞3周。收集多重抗藥性純系(>100)并增殖成大量細(xì)胞。將經(jīng)轉(zhuǎn)染之細(xì)胞維持于含有新霉素和嘌呤霉素之培養(yǎng)基中。用于本文所述實(shí)驗(yàn)之細(xì)胞則培養(yǎng)于不含新霉素和嘌呤霉素之培養(yǎng)基中。免疫墨點(diǎn)法以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，并以刮取法收集細(xì)胞。以RIPA放射免疫沈淀緩沖液(radioimmunoprecipitation buffer) [25mM三輕甲基氨基甲焼鹽酸鹽(Tris-HCUpH 7.2)，0. 1% 十二烷基硫酸鈉(SDS)，0. I % Triton X_100，l% 脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)，150mM 氯化鈉(NaCl)，ImM 乙二胺四乙酸(EDTA)，5mM 正鑰1酸鈉(sodium orthovanadate)，ImM 苯甲基橫酸化氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)，10 μ g/mL 抑肽酶(aprotinin)，5 μ g/mL 亮抑酶肽(Ieupeptin)，25mM β -甘油磷酸(β-glycerophosphate)，5mM 氟化鈉(sodium fluoride)]溶解收集之細(xì)胞。以 BCA 蛋白質(zhì)檢測(cè)套組(Pierce，美國(guó))測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將50 μ g之蛋白質(zhì)檢體做十二烷基石黃酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacryIamidegel electrophoresis)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)潰至硝酸纖維素膜(nitrocellulose membranes ；Amersham Pharmacia,英國(guó))。硝酸纖維素膜于4°C下和含1%牛血清白蛋白(BSA, bovineserum albumin), 50mM 三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽(Tris-HCl,pH 7. 6), 150mM 氯化鈉，O. I %Tween-20的免疫染色封閉液(blocking buffer)反應(yīng)16小時(shí)。再將硝酸纖維素膜于室溫下與一級(jí)抗體反應(yīng)I小時(shí)，接著與辣根過(guò)氧化酶(horseradish peroxidase)結(jié)合之二級(jí)抗體反應(yīng) I 小時(shí)。利用 Forte 免疫墨點(diǎn)偵測(cè)系統(tǒng)(Forte Western HRP Substrate ；Millipore,美國(guó))測(cè)定蛋白含量。免疫沉淀反應(yīng)以磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入適量放射免疫沈淀緩沖液，在冰上或者4°C下裂解20分鐘，12，OOOrpm離心10分鐘后取上清；用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)套組(Pierce，美國(guó))測(cè)定蛋白濃度。將定量細(xì)胞裂解液(500 μ g)、相應(yīng)的抗體、和30 μ L蛋白A/G-微珠(protein A/G-beads)加入免疫沉淀緩沖液(immunoprecipitation buffer)[含 50mM三輕 甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl，pH 7. 5)，150mM氯化鈉]的試管中，于4°C緩慢搖晃孵育過(guò)夜；免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C下，以3，OOOrpm速度離心5分鐘，將蛋白A/G-微珠離心至管底；后將上清液小心吸去，蛋白A/G-微珠用ImL放射免疫沈淀緩沖液洗3-4次；最后加入50 μ L的2倍十二燒基硫酸鈉蛋白加樣緩沖液(SDS protein Loading buffer),在沸水中煮10分鐘；用免疫墨點(diǎn)法分析。以抗GFP的鼠抗體進(jìn)行控制組免疫沉淀反應(yīng)。在以血清樣品進(jìn)行免疫沉淀方面，將血清和與瓊脂糖偶聯(lián)的抗磷酸化蘇氨酸抗體(agarose-conjugated anti-phosphothreonine antibodies, H2)(Santa CruzBiotechnology)于磷酸鹽緩沖液中，在4 °C緩慢搖晃孵育過(guò)夜；免疫沉淀反應(yīng)后，在4 °C下，以3，OOOrpm速度離心5分鐘。后將上清液小心吸去，以ImL磷酸鹽緩沖液洗沉淀物3-4次，最后加入50yL的2倍十二烷基硫酸鈉蛋白加樣緩沖液(SDS proteinLoading buffer)，在沸水中煮10分鐘；用免疫墨點(diǎn)法分析。以和瓊脂糖偶聯(lián)的小鼠正常IgG(agarose-conjugated normal mouse IgG)進(jìn)行控制組免疫沉淀反應(yīng)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)及微泡計(jì)數(shù)將生長(zhǎng)于12 X 12mm蓋玻片之細(xì)胞以IOOOrpm離心10分鐘。以磷酸鹽緩沖液洗滌并以4%多聚甲醒(paraformaldehyde)之磷酸鹽緩沖液固定細(xì)胞,再以甲醇(methanol)處理細(xì)胞，之后將細(xì)胞以含有0. 1%牛血清白蛋白之磷酸鹽緩沖液反應(yīng)一小時(shí)。使細(xì)胞與一級(jí)抗體反應(yīng)一小時(shí)后以磷酸鹽緩沖液洗滌，接著與Alexa Fluor 488 (或568)山羊抗小鼠(或抗兔)IgG 二級(jí)抗體反應(yīng)一小時(shí)后以磷酸鹽緩沖液洗滌。以倒立式熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)含兩個(gè)蓋玻片，每片蓋玻片隨機(jī)取5個(gè)視野觀察。每次實(shí)驗(yàn)觀察三百個(gè)細(xì)胞并計(jì)算這些細(xì)胞表面的微泡，由三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所計(jì)數(shù)的微泡數(shù)目繪統(tǒng)計(jì)圖并顯示統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。細(xì)胞增殖分析將相同數(shù)量之細(xì)胞(IXlO4細(xì)胞個(gè)數(shù)/盤(pán))接種于100-mm細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)。細(xì)胞接種后，每隔24小時(shí)以臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)(trypan blue exclusion assay)計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。每隔三天更新培養(yǎng)液。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)算三盤(pán)細(xì)胞，每盤(pán)只計(jì)算一次。條件培養(yǎng)基(conditionedmedium)
將相同數(shù)量之細(xì)胞接種于100-_細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，先使細(xì)胞生長(zhǎng)至快滿(sub-confluence)后以磷酸鹽緩沖液洗滌，接著將細(xì)胞培養(yǎng)于不含血清之培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞數(shù)，收集該培養(yǎng)液，并以10，OOOrpm離心收集之培養(yǎng)液10分鐘后收集上清液，以移除任何可能之懸浮細(xì)胞或細(xì)胞碎片。微泡收集
細(xì)胞條件培養(yǎng)基和血清中之微泡，基本上以分子篩選層析(size exclusionchromatography)及超高速離心技術(shù)收集。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞條件培養(yǎng)基或血清注入Sepharose 2管柱(Amersham Biosciences,美國(guó))。單獨(dú)收集每I毫升通過(guò)管柱流出的液體，并且以光度儀器測(cè)量280nm吸光度。將含大于50萬(wàn)kDa的收集蛋白質(zhì)液體在4°C下離心105，OOOg 一小時(shí)。離心下來(lái)的即為含有微泡的沉淀物，加入50 μ L的磷酸鹽緩沖液均勻混合并低溫保存。GST-CSE1L融合蛋白合成及CSElL蛋白純化GST-CSE1L融合蛋白質(zhì)是利用小麥胚芽無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(wheat germcell-free protein synthesis system ；CellFree Sciences,日本)合成。簡(jiǎn)言之，以限制酶切割出pcDNA-CSElL載體的CSElL蛋白合成序列，再將CSElL蛋白合成序列以接合酶接合至Ij pPEU-EOl小麥胚芽表達(dá)載體(CellFree Sciences)。將2微克(μ g)的CSElL小麥胚芽表達(dá)載體加入含轉(zhuǎn)錄溶液(transcription premix solution ；CellFree Sciences)的試管中，在37°C進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)6小時(shí)。將10微升(yL)的轉(zhuǎn)錄訊息核糖核甘酸(mRNA)產(chǎn)物與10微升的小麥胚芽提取液(WEPR0 3240，CellFree Sciences)混合，并將此混合液注入到含SUB-AMIX(CeIIFree Sciences)試管的下層，在26°C進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)譯反應(yīng)16小時(shí)以合成GST-CSE1L融合蛋白。利用GST純化組件(Bulk GST Purification Modules,Amersham Pharmacia,美國(guó))以谷胱甘妝-瓊脂糖凝膠 4B 珠(glutathione-Sepharose 4Bbeads Amersham Pharmacia,美國(guó))純化GST-CSE1L融合蛋白。接著，以磷酸鹽緩沖液洗漆含融合蛋白的管柱，再以還原之谷胱甘肽(reduced glutathione ；Amersham Pharmacia)分離融合蛋白。以凝血酶(thrombin ;Sigma Chemicals,美國(guó))于3units/100 μ g融合蛋白質(zhì)的濃度下于22°C切割GST-CSE1L融合蛋白16小時(shí)。以Amicon Ultra-4離心過(guò)濾組(Millipore，美國(guó))移除凝血酶及GST。利用抗CSElL抗體以免疫墨點(diǎn)法確認(rèn)純化之CSE1L。以BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)套組(Pierce)測(cè)定CSElL蛋白濃度。組織微陣列切片和免疫組織化學(xué)反應(yīng)將癌組織和相鄰非癌組織石蠟塊切成適度大小，將組織石蠟塊排列及制成組織微陣列切片。以4μπι厚度的組織微陣列切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)。切片于二甲苯去石蠟并以乙醇復(fù)水后，于95°C下將其浸于檸檬酸鹽緩沖液中10分鐘。利用Histostain套組(Zymed,美國(guó))以標(biāo)記鏈霉抗生物素-生物素法(labeled streptavidin-biotin method)進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)。以3%溶于水之過(guò)氧化氫遮蓋組織切片內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性，之后于室溫下以5%牛血清白蛋白培育I小時(shí)以遮蓋非專一性染色。于室溫下使切片與稀釋50倍之抗體反應(yīng)I小時(shí)，之后與生物素化之二級(jí)抗體(biotinylated secondary antibodies)反應(yīng)，最后與鏈霉抗生物素標(biāo)定之過(guò)氧化酶(streptavidin-labeled peroxidase)反應(yīng)。以二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine)使切片顯影并以蒸懼水洗漆,最后以Mayer' s蘇木清(Mayer1 s hematoxylin)進(jìn)行復(fù)染。
以Matrigel做細(xì)胞侵襲性分析將matrigel基質(zhì)膠(BD Pharmingen,美國(guó))以I : 10的比例稀釋于DMEM中，并和不含聚乙烯卩比咯唳酮之8 μ m孔徑聚碳酸濾紙(polyvinylpyrrolidone-freepolycarbonate filters ;Costar,美國(guó))于4°C共置16小時(shí)，之后以DMEM洗漆濾紙4次后，將其置于微趨化室(microchemotaxis chambers)中。以O(shè). I %胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)處理細(xì)胞并將細(xì)胞重新懸浮于含有10%胎牛血清之DMEM培養(yǎng)基，之后以不含血清之DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。最后將細(xì)胞(3 X IO5)懸浮于DMEM(200 μ L)并置于微趨化室之上層隔間。將含有20%胎牛血清之細(xì)胞培養(yǎng)液(300 μ L)置于微趨化室之下層當(dāng)作細(xì)胞侵襲引誘劑。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10小時(shí)后，以棉花棒完全拭去微趨化室上層隔間濾紙上面之細(xì)胞。以甲醇固定微趨化室上層隔間之濾紙下面的細(xì)胞，并以Liu' s A及Liu' s B試劑染色，之后于顯微鏡下計(jì)數(shù)。重復(fù)檢測(cè)三次，每次檢測(cè)包括四個(gè)重復(fù)。于每個(gè)樣本，隨機(jī)選擇10個(gè)顯微鏡視野計(jì)數(shù)侵襲到微趨化室濾紙下面的細(xì)胞，并且將計(jì)數(shù)平均統(tǒng)計(jì)?！っ庖唠娮语@微鏡(immunogold electron microscopy)用磷酸鹽緩沖液洗漆細(xì)胞，并固定在含0. 5%戍二醒(glutaraldehyde)和2%多聚甲醒(paraformaldehyde)的輕乙基狐嗪乙橫酸(HEPES, hydroxyethyl-piperazineethanesulafonic acid)緩沖液(pH值6. 8) 15分鐘,然后再將細(xì)胞在含2%多聚甲醒的輕乙基狐嗪乙磺酸緩沖液于4°C反應(yīng)14天。樣品再用80%乙醇脫水再以Lowicryl HM20樹(shù)脂(Polysciences，日本)處理及進(jìn)行聚合反應(yīng)24小時(shí)。將含細(xì)胞的樹(shù)脂塊做超薄切片，然后將切片置于涂有2%氯丁橡膠(Neoprene,Ohken,日本)的鎳網(wǎng)(nickel gids)上。樣品以100%乙醇處理3分鐘后，浸泡在65°C的0.0IM乙二胺四乙酸(EDTA，pH值7. 2) 24小時(shí)。樣品用磷酸鹽緩沖液洗三次，再和含1%牛血清白蛋白和0. 1% Tween-20的磷酸鹽緩沖液反應(yīng)15分鐘。樣品再和稀釋于磷酸鹽緩沖液(I 30)的抗體反應(yīng)I小時(shí)，用磷酸鹽緩沖液洗三次，再和偶聯(lián)納米金粒子的二級(jí)抗體(gold-labeled secondary antibodies)反應(yīng)，再用磷酸鹽緩沖液洗三次。之后樣品以醋酸鈾(uranyl acetate)染色，以HitachiH-7000 (Hitachi，日本)電子顯微鏡觀察。明膠酶譜檢測(cè)(gelatinzymography assay)依細(xì)胞數(shù)量調(diào)整細(xì)胞條件培養(yǎng)基體積，取由細(xì)胞條件培養(yǎng)基收集的微泡，進(jìn)行明膠酶譜檢測(cè)。將微泡溶于不含還原劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol)或2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol)的2倍十二燒基硫酸鈉蛋白加樣緩沖液(SDS protein Loadingbuffer),以含lmg/mL明膠(gelatin)的10%十二燒基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。之后將凝膠以含2. 5% Triton X-100的水洗兩次，每次30分鐘去除十二烷基硫酸鈉(SDS)，并隨后將凝膠置于明膠酶譜緩沖液[50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl，pH 7.6)，200mM氯化鈉，IOmM氯化鈣(CaCl2)]于37°C放置24小時(shí)。將凝膠以Comassie blue染色液(0. 125% Comassie blue R-250，50%甲醇，10%乙酸)染色30分鐘，再以脫色液(20%甲醇，10%乙酸，70%水)脫色，直到清晰的透明條帶顯現(xiàn)。動(dòng)物癌轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下(22°C;50%濕度；12小時(shí)之光/暗周期)，將6至7周(N = 18)及14至15周(N = 26)大之C57BL/6小鼠(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，臺(tái)灣，中國(guó))圈養(yǎng)于動(dòng)物室。實(shí)驗(yàn)包括 4 組[即注射 B16-dEV 細(xì)胞(N = 11)，B16-CSE1L 細(xì)胞(N = 14)，B16-ras 細(xì)胞(N =8)，和B16-Ras/anti-CSElL細(xì)胞(N = 11)的小鼠]，且不同年齡的小鼠被均勻地分布在四組。每只鼠由尾靜脈注射100 yL含3X IO4細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液。注射后三個(gè)星期將小鼠犧牲。以肉眼檢驗(yàn)及顯微檢驗(yàn)計(jì)數(shù)小鼠肺中之腫瘤數(shù)。小鼠之飼育及實(shí)驗(yàn)程序均依照臺(tái)灣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)之規(guī)范。有3只注射B16-dEV細(xì)胞的小鼠、10只注射B16-CSE1L細(xì)胞的小鼠、4只注射B16-ras細(xì)胞的小鼠、和I只注射B16-Ras/anti_CSElL細(xì)胞的小鼠，于注射3周后失去生命，因而被排除肺腫瘤統(tǒng)計(jì)。另外，有I只注射B16-dEV細(xì)胞的小鼠、I只注射B16-CSE1L細(xì)胞的小鼠、O只注射B16-ras細(xì)胞的小鼠、和3只注射B16-Ras/anti_CSElL細(xì)胞的小鼠，沒(méi)有生長(zhǎng)腫瘤，因而也被排除腫瘤統(tǒng)計(jì)。病人和腫瘤樣本 腫瘤樣本為從臺(tái)灣彰化基督教醫(yī)院之115個(gè)大腸直腸癌病患，取得未經(jīng)癌治療處理之癌組織及血清檢體。腫瘤檢體在遵循及通過(guò)機(jī)構(gòu)倫理審查委員會(huì)(IRB)審查核準(zhǔn)之指導(dǎo)方針，及告知病患同意下，于診斷及手術(shù)時(shí)取得檢體。腫瘤的分級(jí)和分類，是根據(jù)第六版美國(guó)聯(lián)合委員會(huì)的癌癥分期手冊(cè)。健康捐贈(zèng)者的血清樣品，獲得自60個(gè)健康人(平均年齡
61.0±8. 7歲；年齡范圍，22-71歲)。收集之血液于室溫下放置至少30分鐘，以形成凝塊。接著使檢體于4°C以1300g離心20分鐘，收集血清。將血清以10，OOOrpm離心10分鐘，收集上清液，以移除任何可能之懸浮細(xì)胞或細(xì)胞殘骸，并保存于-80°C冷凍以備后續(xù)檢測(cè)使用。將所有檢體以特定標(biāo)簽標(biāo)示以保護(hù)病患隱私。在進(jìn)行分析前所有檢體都未經(jīng)解凍?；颊叩呐R床病理特征整理于表格I。表格I、大腸直腸癌病患之臨床病理特征
fiuBwiiesI............(■..■: I............(W2_n_,——I(第3期____________(i_4 面，
s Uig( I)s I Hgi1 I I) si agt' III) s I age I V)
_ (η ^ 13) (η = 43) (η = -13) (η = 16)
f 均年齡(范 1到)，歲數(shù)“ 66. O 土65.4 +60.3 ±71. I +
I_I 11.5 42-84 丨 10. O, 40-93 丨 15. 2, 28-92 ii.2, 46-8權(quán)利要求
1.一種可結(jié)合CSElL的抗體或可結(jié)合磷酸化CSElL的抗體。
2.如權(quán)利要求項(xiàng)1，為一種可結(jié)合磷酸化CSElL的抗體。
3.一種于體外檢測(cè)受檢測(cè)個(gè)體腫瘤的方法，包括以下步驟 (1)取得受檢測(cè)個(gè)體的體液樣本為受檢測(cè)體液樣本； (2)取得一個(gè)或多個(gè)正常個(gè)體的體液樣本做為對(duì)照組體液樣本； (3)于體外，以權(quán)利要求I所述抗體，與受檢測(cè)體液樣本及對(duì)照組體液樣本分別混合及反應(yīng)；及 (4)測(cè)量受檢測(cè)體液樣本中微泡的CSElL或磷酸化CSElL的量； (5)測(cè)量對(duì)照組體液樣本中微泡的CSElL或磷酸化CSElL的量，比較在步驟(4)測(cè)得 之量及步驟(5)測(cè)得之平均量，若步驟(4)所述受檢測(cè)體液樣本中微泡的CSElL或磷酸化CSElL的量，高于步驟(5)所述對(duì)照組體液樣本中微泡的CSElL或磷酸化CSElL的平均量，則表示受檢測(cè)個(gè)體有腫瘤之可能性。
4.如權(quán)利要求項(xiàng)3的方法，CSElL或磷酸化CSElL在所述樣本中的量，以斑點(diǎn)雜交法(dot blot assay)進(jìn)行檢測(cè)。
5.如權(quán)利要求項(xiàng)3的方法，CSElL在所述樣本中的量，以抗CSElL抗體和微泡之結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。磷酸化CSElL在所述樣本中的量，以抗磷酸化CSElL抗體和微泡之結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。
6.如權(quán)利要求項(xiàng)3的方法，個(gè)體為人類。
7.—種于體外檢測(cè)個(gè)體腫瘤的方法，包括以下步驟 (1)取得受檢測(cè)個(gè)體的體液樣本為受檢測(cè)體液樣本； (2)取得一個(gè)或多個(gè)正常個(gè)體的體液樣本做為對(duì)照組體液樣本； (3)于體外，以權(quán)利要求項(xiàng)2所述抗體，與受檢測(cè)體液樣本及對(duì)照組體液樣本分別混合及反應(yīng)；及 (4)測(cè)量受檢測(cè)體液樣本的磷酸化CSElL的量； (5)測(cè)量對(duì)照組體液樣本的磷酸化CSElL的量， 比較在步驟(4)測(cè)得之量及步驟(5)測(cè)得之平均量，若步驟(4)所述受檢測(cè)體液樣本中的磷酸化CSElL的量，高于步驟(5)所述對(duì)照組體液樣本中的磷酸化CSElL的平均量，則表示受檢測(cè)個(gè)體有腫瘤之可能性。
8.如權(quán)利要求項(xiàng)7的方法，磷酸化CSElL在所述樣本中的量，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)。
9.如權(quán)利要求項(xiàng)7的方法，磷酸化CSElL在所述樣本中的量，以抗磷酸化CSElL抗體和磷酸化CSElL之結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。
10.如權(quán)利要求項(xiàng)7的方法，個(gè)體為人類。
11.一種于體外從個(gè)體的體液樣本分離微泡之方法，包括以下步驟 (1)取得個(gè)體的體液樣本； (2)于體外以權(quán)利要求項(xiàng)I所述抗體，與體液樣本混合及反應(yīng)'及 (3)分離與抗體結(jié)合之微泡。
12.如權(quán)利要求項(xiàng)11的方法，個(gè)體為動(dòng)物。
13.如權(quán)利要求項(xiàng)11的方法，個(gè)體為人類。
14.一種含有抗CSElL抗體或抗磷酸化CSElL抗體的藥物組合物及藥物的賦形劑、稀釋劑或載體。
15.一種于體外檢測(cè)體液樣本微泡之方法，步驟包括于體外以權(quán)利要求項(xiàng)I所述抗體與體液樣本混合及反應(yīng)；及檢測(cè)抗體之結(jié)合。當(dāng)抗體和體液樣本中微泡的CSElL或磷酸化CSElL結(jié)合,表不微泡存在于體液樣本。
16.一個(gè)用于于體外檢測(cè)或分離體液樣本內(nèi)之微泡的試劑盒,該試劑盒含有權(quán)利要求項(xiàng)I所述抗體。
17.一個(gè)用于于體外檢測(cè)體液樣本內(nèi)之磷酸化CSElL的試劑盒，該試劑盒含有權(quán)利要求項(xiàng)2所述抗體。
全文摘要
細(xì)胞微泡與疾病有關(guān)，本發(fā)明涉及一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的磷酸化CSE1L(染色體分離-1類蛋白，chromosome segregation 1-like protein)微泡膜蛋白及其應(yīng)用。所揭示包含可與CSE1L或磷酸化CSE1L結(jié)合的組合物，用于分離、檢測(cè)或結(jié)合微泡，應(yīng)用于疾病診斷或治療。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102952190SQ20121016178
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者江明聰 申請(qǐng)人:江明聰