專利名稱：脂肪味覺受體及其使用方法
脂肪味覺受體及其使用方法 發(fā)明背景傳統(tǒng)上認為嘴巴對脂肪的探測有賴于脂肪的質(zhì)地、粘度和氣味。然而， 有些脂肪替代物雖然模擬了這些品質(zhì)，但卻不能完全模擬脂肪的口感和美 味。部分地出于此原因，認為存在著脂肪味覺。fMRI(功能性磁共振成像) 研究已表明植物油刺激人皮質(zhì)的味覺區(qū)域，且在大鼠中進行的神經(jīng)記錄已 表明向舌頭施加游離脂肪酸(FFA)刺激舌咽神經(jīng)的舌支。這提示脂肪感覺 具有外三叉組份。也已經(jīng)觀察到分離的大鼠味覺細胞響應(yīng)中鏈和長鏈FFA， 抑制延遲整流鉀通道。從而，若干線索證據(jù)都提示中鏈和長鏈FFA能夠引 發(fā)脂肪味覺。食品工業(yè)急需篩選引發(fā)脂肪味覺但本身不是脂肪的化合物的系統(tǒng)。此 類系統(tǒng)可用于鑒定能夠替代食品脂肪的化合物，由此提供更為健康的食品， 其卡路里更低，但保留了期望的風(fēng)味特征。發(fā)明概述本發(fā)明公開了包含由重組DNA分子表達的蛋白質(zhì)的功能性脂肪味覺 受體。所述蛋白質(zhì)可以是G蛋白偶聯(lián)受體蛋白的部分，如GPR120、 GPR40 或兩者兼而有之?？捎芍亟MDNA分子在細胞中表達所述脂肪味覺受體。 也考慮含脂肪味覺受體蛋白質(zhì)基因的細胞。在一個實施方案中，提供了納入(incorporate)功能性脂肪味覺受體的 測定系統(tǒng)。所述測定系統(tǒng)可用于鑒定具有脂肪味道的化合物，既包括脂肪 化合物，也包括非脂肪化合物。在一個實施方案中，所述測定系統(tǒng)對具有脂肪味道的化合物產(chǎn)生可測量的應(yīng)答，例如，在添加脂肪的時候，包括游離脂肪酸，如長鏈和中鏈脂 肪酸。還公開了用于鑒定味道像脂肪的化合物的方法。所述方法可這樣實施 克隆脂肪味覺受體的蛋白質(zhì)組份、表達所克隆的蛋白質(zhì)并形成脂肪味覺受 體?？蓪⑺鲋疚队X受體添加到當(dāng)測試化合物與所述受體結(jié)合時能夠產(chǎn) 生應(yīng)答的系統(tǒng)中。當(dāng)檢測到應(yīng)答時，則所述化合物被鑒定那為具有脂肪味 道。還公開了用于制備食品的方法。所述方法可這樣實施制備脂肪味覺 受體測定系統(tǒng)、使用所述系統(tǒng)鑒定味道像脂肪的非脂肪化合物并將所鑒定 的非脂肪化合物摻入食品中。本發(fā)明的其他特點和優(yōu)勢將在如下有關(guān)發(fā)明和附圖的詳細說明中加以 說明，并將由此而變得明顯。附圖的簡短說明
圖1A顯示了轉(zhuǎn)基因小鼠輪廓味覺乳頭切片的細胞圖。切片中的細胞 在Trpm5啟動子的控制下表達綠色熒光蛋白(GFP)。圖1B顯示了與圖1A中相同的輪廓乳頭切片的免疫化學(xué)染色圖，以 GPR120特異性抗體染色，并以Cy 3檢測。圖1C圖示了圖1A和圖1B的重疊圖，其中GPR120和Trpm5在味 覺細胞中存在大約95%的共定位。圖2提供了有關(guān)味蕾中甜味應(yīng)答、苦味應(yīng)答和鮮味應(yīng)答味覺受體細胞 分布的示意圖。圖3A顯示了轉(zhuǎn)基因小鼠輪廓乳頭切片的細胞圖。切片中的細胞在 Trpm5啟動子的控制下表達緣色熒光蛋白(GFP)。圖3B顯示了與圖3A中相同的輪廓乳頭切片的免疫化學(xué)染色圖，以 GPR40特異性抗體染色，并以Cy 3檢測。圖3C圖示了圖3A和圖3B的重疊圖，其中GPR120和T卬m5存在 部分共定位。圖4顯示了小鼠對脂肪乳液的偏好比(preference ratio)和攝入量。偏好 比為0.5表示無關(guān)緊要，高于0.5意味著偏好，而低于0.5意味著躲避。與 對照小鼠相比，GPR40KO小鼠的脂肪偏好和4聶入量均下降。星號指示敲 除小鼠與對照小鼠的攝入或偏好差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性時的脂肪濃度。
發(fā)明詳述
本發(fā)明部分地是基于脂肪味覺受體以及構(gòu)成脂肪味覺受體的蛋白質(zhì)的 發(fā)現(xiàn)。所述蛋白質(zhì)為一類稱為G蛋白偶聯(lián)受體或GPCR的蛋白質(zhì)成員， 并且包括GPR40和GPR120。發(fā)明人已證明這些受體存在于表達Trpm5 的細胞味覺組織中，Trpm5為一種關(guān)鍵的味覺信號傳導(dǎo)蛋白質(zhì)。此外，發(fā) 明人還證明缺失功能性GPR40基因的小鼠(GPR40敲除小鼠)對玉米油、 英脫利匹特(Intralipid)、月桂酸和油酸的偏好和攝入量下降。這些數(shù)據(jù)共 同證明GPR120和GPR40為脂肪味覺受體，并且能夠作為模擬脂肪味道 化合物的篩選工具加以利用?？蓪⑦@類化合物作為脂肪替代物摻入食品中。
脂肪味覺受體蛋白質(zhì)部分地是通過類推苦味、甜味和鮮味化合物味覺 現(xiàn)象而鑒定到的，在此現(xiàn)象中味覺由與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合的呈 味物(tastant)激發(fā)。另夕卜，已經(jīng)觀察到兩種GPCR即GPR40和GPR120 在體內(nèi)和體外受長鏈和中鏈脂肪酸激活。GPR40主要在胰腺中表達，并響 應(yīng)中鏈和長鏈游離脂肪酸刺激胰島素分泌。GPR120在腸和肺中表達，并 且經(jīng)長鏈脂肪酸刺激導(dǎo)致GLP1分泌增加。這兩種受體的配體結(jié)合譜有部 分重疊但并不完全相同。GPR40看來與中鏈脂肪酸(<:1()_12)還有飽和的
(dw6)及非飽和的(ds-2。)強結(jié)合。GPR120看來不與(d(M2)脂肪酸強結(jié)合，
且看來結(jié)合飽和及非飽和的(C14.2。)。
GPR40和GPR120部分地是基于其在味覺組織中表達而被鑒定為與 脂肪味覺受體有關(guān)。利用免疫化學(xué)染色技術(shù)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)GPR120在小鼠 輪廓、葉狀和菌狀味覺乳頭的許多味覺受體細胞中強表達。圖l圖示了輪 廓乳頭切片典型的免疫染色圖，其中每個味蕾上有若干細胞對GPR120特 異性抗體表現(xiàn)出免疫反應(yīng)性。圖1A展示了因Trpm5啟動子控制下的綠色熒光蛋白組成型表達而著色的整體細胞圖。圖1B展示了那些在其細胞表 面表達GPR120的相同細胞，通過基于GPR120特異性抗體的免疫化學(xué)染 色并以Cy3檢測而鑒定。當(dāng)將兩圖重疊時，能夠，見察到GPR120和GFP 在細胞中接近95%的共定位，說明GPR120在大約95%表達Trpm5的細 胞中表達。
利用從人味覺cDNA文庫中獲得的序列也已在人味覺細胞中鑒定到 GPR120。所述文庫由來自人菌狀乳頭的200個分離的味覺受體細胞構(gòu)建 而成，并對來自該文庫中的17,000個克隆進行了測序。將來自該文庫的序 列與GPR120的序列進行了比較，并在來自該文庫的一152個核苦酸的序 列與GPR120基因的3'端之間觀察到精確的匹配，證實GPR120在人味覺 組織中表達。
也已經(jīng)確定GPR120利用同甜味、苦味和鮮味通路中的共用傳導(dǎo)通路。 以Trpm5進行了標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)染色(圖l)和共定位研究，Trpm5為這三種 形式味覺傳導(dǎo)所必需的陽離子通道。觀察到大多數(shù)(如果不是全部的話) Trpm5表達細胞也表達GPR120。這意味著響應(yīng)苦味、甜味或鮮味刺激的 細胞也表達GPR120。有關(guān)味蕾中甜味應(yīng)答、苦味應(yīng)答和鮮味應(yīng)答味覺受 體細胞分布的示意圖示于圖2。如圖示的那樣，所有的甜味、苦味和鮮味 細胞也表達Trpm5。因為GPR120也在幾乎所有Trpm5表達細胞中表達， 其也在苦p未、甜^^未和鮮味應(yīng)答細胞中表達。
也已利用免疫組織化學(xué)染色研究證明了 GPR40存在于小鼠味覺組織 中，如圖3所示。然而，在此情況下，僅一部分Trpm5表達細胞對GPR40 抗體具有免疫反應(yīng)性。共定位研究顯示，如在圖3B中最佳觀察到的那樣， GPR40在Trpm5表達細胞的亞群中表達，并且在不表達Trpm5的"未覺細 胞中表達。圖3A顯示了在Trpm5啟動子控制下表達GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠 輪廓乳頭切片的細胞圖。圖3B圖示了以GPR40特異性抗體染色的相同細 胞切片。
已利用敲除小鼠的行為試驗證明了 GPR40作為脂肪味覺受體發(fā)揮功 能。向缺失功能性GPR40受體的小鼠(GPR40敲除小鼠)提供兩種飲用瓶的選擇， 一種含脂肪乳液， 一種僅含載體，如圖4所示。所述脂肪乳液含 有玉米油、英脫利匹特、月桂酸或油酸。當(dāng)與正常小鼠相比較時，敲除動 物飲用較少的脂肪。與單獨的載體相比，GPR40敲除動物仍然偏好脂肪乳 液，但不如正常小鼠中那么顯著。這些研究共同證明GPR40為脂肪味覺 受體。由于小鼠在缺失GPR40的情況下仍然能夠探測脂肪，其他受體， 很可能是GPR120, —定也在脂肪味覺信號傳導(dǎo)方面起作用。
上文所討論的研究表明GPR120和GPR40為脂肪味覺受體的組份。 GPR120廣泛表達，包括在表達其他味覺形式受體的味覺受體細胞中。很 可能GPR120參與眾所周知的脂肪酸所致的其他味覺形式的調(diào)節(jié)。另一方 面，GPR40在味覺細胞的不同亞群中表達，并且可能是介導(dǎo)特異性脂肪p木 覺的主要受體。
構(gòu)成功能性脂肪味覺受體的蛋白質(zhì)或其部分可以克隆，在非味覺細胞 中表達，并用在測定中，以鑒定具有脂肪味道的化合物，既包括脂肪化合 物，也包括非脂肪化合物。所述測定可以是基于細胞的測定，其中味覺受 體與能夠響應(yīng)化合物與味覺受體的結(jié)合而提供可檢測信號的第二組份聯(lián) 合。在所述測定中，可使測試化合物在允許與受體結(jié)合的條件下與細胞一 起孵育。然后可以通過測定是否響應(yīng)所添加的化合物而產(chǎn)生了信號來檢測 結(jié)合。化合物一經(jīng)鑒定，便可摻入食品中，以模擬脂肪味道，而不會增添 脂肪的卡路里和有害健康的效應(yīng)。
應(yīng)當(dāng)理解，本文所述當(dāng)前優(yōu)選實施方案的多種變化和改動對于本領(lǐng)域 技術(shù)人員而言將是顯而易見的?？梢赃M行這樣的變化和改動，而不會偏離 本發(fā)明主題的精神和范圍，也不會減小其預(yù)期的優(yōu)點。因此這樣的變化和 改動旨在為所附的權(quán)利要求書所涵蓋。
權(quán)利要求
1.分離的脂肪味覺受體。
2. 權(quán)利要求1的脂肪味覺受體，還包含由重組DNA分子表達的蛋白質(zhì)。
3. 權(quán)利要求1的脂肪味覺受體，還包含由重組DNA分子表達的蛋白 質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包括G蛋白偶聯(lián)受體。
4. 權(quán)利要求1的脂肪味覺受體，還包含由重組DNA分子表達的蛋白 質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包括部分GPR120。
5. 權(quán)利要求1的脂肪味覺受體，還包含由重組DNA分子表達的蛋白 質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包括部分GPR40。
6. 權(quán)利要求1的脂肪味覺受體，還包含由重組DNA分子表達的蛋白 質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包括部分GPR40和部分GPR120。
7. 含有脂肪味覺受體的細胞，所述脂肪味覺受體包含由重組DNA分 子表達的蛋白質(zhì)。
8. 權(quán)利要求7的細胞，其中所述蛋白質(zhì)為部分GPR40。
9. 權(quán)利要求7的細胞，其中所述蛋白質(zhì)為部分GPR]20。
10. 用于測定脂肪味道的測定系統(tǒng)，包含功能性脂肪味覺受體，所述 脂肪味覺受體包括由重組DNA分子表達的蛋白質(zhì)。
11. 權(quán)利要求10的用于測定脂肪味道的測定系統(tǒng)，其中所述蛋白質(zhì)為 部分GPR40。
12. 權(quán)利要求10的用于測定脂肪味道的測定系統(tǒng)，其中所述蛋白質(zhì)為 部分GPR120。
13. 權(quán)利要求10的測定系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)對具有脂肪味道的非脂肪 組合物產(chǎn)生可測量的應(yīng)答。
14. 權(quán)利要求10的測定系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)在添加脂肪時產(chǎn)生可測量 的應(yīng)答。
15. 權(quán)利要求10的測定系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)在添加游離脂肪酸時產(chǎn)生可測量的應(yīng)答。
16. 權(quán)利要求10的測定系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)在添加長鏈游離脂肪酸時 產(chǎn)生可測量的應(yīng)答。
17. 權(quán)利要求10的測定系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)在添加中鏈游離脂肪酸時 產(chǎn)生可測量的應(yīng)答。
18. 鑒定味道像脂肪的化合物的方法，包括 克隆表達脂肪味覺受體蛋白質(zhì)組份的基因， 表達所克隆的蛋白質(zhì)， 形成脂肪味覺受體，將所表達的脂肪味覺受體納入在添加具有脂肪味道的化合物時能夠產(chǎn) 生應(yīng)答的系統(tǒng)中，向所述系統(tǒng)添加測試化合物，和測量系統(tǒng)對所添加的測試化合物的應(yīng)答。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述蛋白質(zhì)為G蛋白偶聯(lián)受體。
20. 用于制備食品的方法，包括制備在添加具有脂肪味道的測試化合物時能夠產(chǎn)生應(yīng)答的測定系統(tǒng)， 向所述系統(tǒng)添加測試化合物，通過檢測測定系統(tǒng)在添加化合物時的應(yīng)答來鑒定味道像脂肪的化合 物，和將所鑒定的測試化合物摻入食品中。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述化合物不是脂肪。
全文摘要
本發(fā)明公開了脂肪味覺受體以及使用所述受體篩選模擬脂肪味道的化合物的方法。所述受體可包括G蛋白偶聯(lián)受體蛋白，如GPR40或GPR120。還公開了制備食品的新方法，包括在測定系統(tǒng)中測試化合物，然后將所鑒定的具有脂肪味道的非脂肪化合物摻入到食品中。
文檔編號C07K14/72GK101218250SQ200680025247
公開日2008年7月9日 申請日期2006年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月28日
發(fā)明者C·卡爾托尼, C·貝岑農(nóng), J·勒-庫特, S·達馬克 申請人:雀巢技術(shù)公司