熒光藻藍(lán)蛋白、晶體的生產(chǎn)工藝及制品的制作方法

專利名稱：熒光藻藍(lán)蛋白、晶體的生產(chǎn)工藝及制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白、晶體的制造工藝及制品，尤其涉及的是在一般條件下從藻類中提取的能發(fā)射強(qiáng)烈熒光的藻藍(lán)蛋白并將其轉(zhuǎn)化為晶體形態(tài)，并在科研、醫(yī)療、檢測、信電等領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
早在上個世紀(jì)初，國外就曾報道在藍(lán)藻和紅藻中存在具強(qiáng)烈熒光性的紅色、紫羅蘭色和藍(lán)色蛋白質(zhì)。1910年，Kylin首次將這些色素蛋白定名為“藻色蛋白”(Phycochromo-proteins)。這種大量出現(xiàn)于紅藻，藍(lán)綠藻和隱藻中的捕光色素蛋白，就是目前亟待開發(fā)的藻膽蛋白(Phycobiliproteins，PBP)，它主要包括藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)，熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)，藻紅藍(lán)蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)和別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin，APC)四種。藻膽蛋白把捕獲的光能高效的傳遞給葉綠素，從而使海藻的光合作用得以發(fā)生。
與化學(xué)合成的熒光染料相比，熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)純天然來源，資源豐富，物理性質(zhì)穩(wěn)定，水溶性好，不與蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等發(fā)生非特異性吸附，安全且無毒性，對生態(tài)環(huán)境無污染。另外熒光藻藍(lán)蛋白摩爾吸光系數(shù)大，熒光量子產(chǎn)率高，熒光發(fā)射波長大于550nm，強(qiáng)烈吸收光譜帶很寬，有利于選擇激發(fā)光源，克服了傳統(tǒng)熒光標(biāo)記物熒光背景大、易淬滅等缺點(diǎn)，大大提高了熒光檢測的敏感性。
中國專利申請(94109295.X)公開了一種“鈍頂節(jié)旋藻藻藍(lán)蛋白及其應(yīng)用”。該發(fā)明公開了一種新穎的藻藍(lán)蛋白，該蛋白是從鈍頂節(jié)旋藻中提取的，分子量為14500道爾頓，等電點(diǎn)為4.8，最大光譜吸收值為620nm。該蛋白是由α和β亞單位組成的寡聚體。雖然該藻藍(lán)蛋白具有一定的保健功效，以及該藻藍(lán)蛋白的保健食品組合物在熒光檢測領(lǐng)域有一定的用途，但是由于該蛋白質(zhì)處在凍干或沉淀狀態(tài)，藻藍(lán)蛋白的功能基團(tuán)很容易失活，當(dāng)受到某些物理因素如熱、紫外線照射，高壓和表面張力等或化學(xué)因素等影響時，常常會出現(xiàn)生物活性的喪失，一些側(cè)鏈基團(tuán)的暴露，一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變和生物化學(xué)性質(zhì)的改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的喪失，所以需要現(xiàn)制現(xiàn)用，不能長期保存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供制備熒光藻藍(lán)蛋白溶液的方法，該方法與現(xiàn)有技術(shù)相比；只需通過兩種填充介質(zhì)的柱層析就能制備出較不同純度級別的熒光藻藍(lán)蛋白溶液。
本發(fā)明的另一個目的在于提供熒光藻藍(lán)蛋白晶體的制備方法，該方法與現(xiàn)有技術(shù)相比；在普通的實(shí)驗(yàn)條件下就可以完成，簡單易行。
本發(fā)明還針對現(xiàn)有技術(shù)的蛋白質(zhì)處在凍干粉或沉淀狀態(tài)，不能長期保存，生物活性容易喪失，不能長期利用，提供一種能長期保存，所需的保藏條件要求小，熒光活性高的熒光藻藍(lán)蛋白晶體。
本發(fā)明的上述技術(shù)問題主要是通過下述技術(shù)方案得以解決的一種熒光藻藍(lán)蛋白溶液的制備方法，其特征在于，將藻細(xì)胞破碎后，通過過濾和0-4℃，6000-10000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)高速冷凍離心分離，去除沉淀，收集上清，分級鹽析后收集熒光藻藍(lán)蛋白沉淀，沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液后依次經(jīng)過羥基磷灰石、葡聚糖凝膠Sephadex G-150或Sephadex G-200、羥基磷灰石柱層析，羥基磷灰石柱層析時使用濃度范圍為0.005-0.2摩爾/升的磷酸鹽緩沖液洗脫，控制流速在0.5-2.5毫升/分鐘，最后收集A620/A280＞4.0、A620/A280＞4.5、A620/A280＞5.0一種或多種不同純度要求的熒光藻藍(lán)蛋白溶液，制成不同純度級別的熒光藻藍(lán)蛋白溶液。
作為優(yōu)選，所述制備熒光藻藍(lán)蛋白溶液的方法，其特征在于，所述熒光藻藍(lán)白蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用濃度范圍為0.005-0.1摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液洗脫。
作為優(yōu)選，所述制備熒光藻藍(lán)蛋白溶液的方法，其特征在于，所述熒光藻藍(lán)蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用線性梯度磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫流速控制在0.5-2.5毫升/分鐘。
現(xiàn)有技術(shù)制備熒光藻藍(lán)蛋白的方法是以新鮮藻泥為原料，用含EDTA的磷酸緩沖液洗滌，經(jīng)超聲波破碎細(xì)胞，釋放出色素蛋白，通過離心分離，去除不溶性細(xì)胞膜及細(xì)胞器。收集上清夜，經(jīng)分級鹽析，收集熒光藻藍(lán)蛋白沉淀。沉淀溶于含EDTA的磷酸緩沖液中，通過Sephadex G-25脫鹽，上DEAE-SephadexFF柱，去掉堿性雜質(zhì)蛋白，然后上羥基磷灰石柱，獲得熒光藻藍(lán)蛋白洗脫液。接著上CM-SephadexFF柱，去掉酸性雜質(zhì)蛋白。最后再上第二次羥基磷灰石，獲得熒光藻藍(lán)蛋白，熒光藻藍(lán)蛋白溶液純度A620/A280＞4.5。本發(fā)明的熒光藻藍(lán)蛋白的純化是將細(xì)胞破碎抽提液經(jīng)過一次HA柱再過Sephadex G-150(或Sephadex G-200)，然后在過一次HA柱，操作步驟簡單，生產(chǎn)周期短，同時可以得到A620/A280＞4.0、A620/A280＞4.5、A620/A280＞5.0的一種或多種不同純度要求的熒光藻藍(lán)蛋白溶液，制成不同純度級別的熒光藻藍(lán)蛋白溶液制品，制成的熒光藻藍(lán)蛋白溶液產(chǎn)品性能更好，純度更高，更重要的是生產(chǎn)工藝非常簡單。
一種熒光藻藍(lán)蛋白制備成晶體的方法，其特征在于，將一定純度的熒光藻藍(lán)蛋白放在閉光封閉的環(huán)境中，加入0.05％-0.2％氯化鎂和2％-4％氯化鈉，調(diào)節(jié)pH值使其在晶體的成長過程中始終穩(wěn)定在pH6.0～7.5的范圍內(nèi)，并線性梯度地加入硫酸銨并輕微攪動，使其轉(zhuǎn)變成粗晶體，通過重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品；晶體產(chǎn)品極大提高了熒光藻藍(lán)蛋白更大限度地提高其純度和保持產(chǎn)品的高生物活性。
作為優(yōu)選，所述的熒光藻藍(lán)蛋白制備成晶體的方法，其特征在于，所述的在晶體的成長過程中始終穩(wěn)定在pH6.8～7.2的范圍內(nèi)。
一種熒光藻藍(lán)蛋白晶體，分子結(jié)構(gòu)為通過硫醚鍵連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)---開鏈線性延展的四吡咯化合物，脫輔蛋白單體由α、β、兩種亞基組成，在適宜波長激發(fā)下能發(fā)射強(qiáng)烈熒光，特征吸收峰為615～625nm，熒光發(fā)射峰為645～655nm，等電點(diǎn)為4.3～4.8，其特征在于所述的熒光藻藍(lán)蛋白為晶體結(jié)構(gòu)。所述的晶體屬于P21空間群。
作為優(yōu)選，所述的熒光藻藍(lán)蛋白晶體的晶胞參數(shù)為a＝107.20，b＝115.40，c＝183.04，β＝90.2°。
作為優(yōu)選，所述的晶胞內(nèi)的不對稱單位由兩個(αβ)含有一個單體，所述的單體構(gòu)為αβ單體。
運(yùn)用X射線衍射分析在2.2埃分辨率水平測定了熒光藻藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，晶體學(xué)R因子為19.2％，自由R因子為23.9％。晶胞參數(shù)為a＝107.20，b＝115.40，c＝183.04，β＝90.2°，晶胞的不對稱單位由兩個(αβ)六聚體組成，晶體屬于P21空間群。
作為優(yōu)選，所述的熒光藻藍(lán)蛋白晶體的特征光譜吸收峰為620nm，熒光發(fā)射峰為650nm。
本發(fā)明熒光藻藍(lán)蛋白晶體具有能夠長期保存，所需的保藏條件要求小，熒光活性高的的特點(diǎn)，其制作方法在普通的實(shí)驗(yàn)條件下就可以完成，簡單易行。并在科研、醫(yī)療、檢測、信電等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。


圖1為構(gòu)成熒光藻藍(lán)蛋白晶體的一種藻藍(lán)素(Cys-PCB)的結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式
以下通過試驗(yàn)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述熒光藻藍(lán)蛋白晶體的有益效果。
試驗(yàn)例1熒光藻藍(lán)蛋白晶體在熒光檢測方面的應(yīng)用1.熒光藻藍(lán)蛋白晶體與親和素的交聯(lián)制成熒光探針試驗(yàn)材料選本發(fā)明的熒光藻藍(lán)蛋白晶體，分子量約260000道爾頓；pH值7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖液(PBS)，其中含0.1摩爾/升氯化鈉(NaCl)；3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)，分子量312道爾頓；二硫代蘇糖醇(DTT)，分子量154道爾頓。
試驗(yàn)方法1)熒光藻藍(lán)蛋白的衍生化取5.2毫克熒光藻藍(lán)蛋白晶體溶于1.0毫升磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入15微升3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)無水甲醇液(4毫克/毫升)，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)與熒光藻藍(lán)蛋白摩爾比約為10，常溫反應(yīng)100分鐘，經(jīng)葡聚糖(Sephadex G-50)凝膠層析柱(Φ1×17厘米)脫鹽，磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液)平衡和洗脫，收集熒光藻藍(lán)蛋白溶液峰。
2)親和素的巰基化1毫升親和素(約2毫克/毫升，溶解于含有0.1摩爾/升氯化鈉、pH7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖液中)，加入25微升上述3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)無水甲醇液，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)與親和素摩爾比約為10，常溫反應(yīng)60分鐘，加入二硫蘇糖醇(DTT)使得其終濃度為25微摩爾/升，常溫反應(yīng)90分鐘，同上過葡聚糖凝膠層析(SephadexG-50)，收集蛋白峰。
3)熒光藻藍(lán)蛋白與親和素的交聯(lián)取衍生化的熒光藻藍(lán)蛋白與巰基化的親和素混合，搖床低速(小于20轉(zhuǎn)/分鐘)振蕩，4℃反應(yīng)過夜。
4)終止交聯(lián)反應(yīng)第3)步反應(yīng)溶液中加入100微升的50毫摩爾/升碘乙酸鈉封閉殘余巰基，常溫反應(yīng)30分鐘。
5)產(chǎn)物的純化第4)步產(chǎn)物經(jīng)丙烯葡聚糖(Sephacryl S-300HR)凝膠柱層析，收集第一個蛋白峰即為熒光熒光藻藍(lán)蛋白標(biāo)記制品。
6)保存熒光藻藍(lán)蛋白標(biāo)記制品，最后溶于磷酸鹽緩沖液(含有0.1摩爾/升乙二胺四乙酸(DETA)、1摩爾/升碘乙酰胺、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％疊氮化鈉(NaN3))，0～5℃保存。
2.熒光藻藍(lán)蛋白標(biāo)記蛋白A試驗(yàn)材料熒光藻藍(lán)蛋白晶體，分子量約260000道爾頓；pH值7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖液(PBS)，其中含0.1摩爾/升氯化鈉(NaCl)；3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)無水甲醇液；二硫蘇糖醇(DTT)pH7.4緩沖液；蛋白A；乙二胺四乙酸(DETA)；碘乙酰胺。
試驗(yàn)方法1)、熒光藻藍(lán)蛋白的衍生化取5.2毫克熒光藻藍(lán)蛋白晶體溶于1.0毫升磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液)中，加入15微升3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)無水甲醇液(4毫克/毫升)，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)與熒光藻藍(lán)蛋白摩爾比約為10，常溫反應(yīng)60分鐘，經(jīng)葡聚糖(Sephadex G-50)凝膠層析脫鹽(1×17厘米)，磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液)平衡和洗脫，收集熒光熒光藻藍(lán)蛋白溶液峰。
2)、蛋白A的巰基化0.5毫升蛋白A(2毫克/毫升)100mmol/L磷酸鹽緩沖液(含有100mmol/L氯化鈉)pH7.4，加入上述3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)無水甲醇液，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)與蛋白摩爾比約為10，常溫反應(yīng)40分鐘，加入二硫蘇糖醇(DTT)使得其終濃度為25微摩爾/升，常溫反應(yīng)25分鐘，同上過葡聚糖凝膠層析(Sephadex G-50)，收集蛋白峰。
3)、熒光藻藍(lán)蛋白與蛋白A的交聯(lián)取0.8毫克/毫升衍生化的熒光熒光藻藍(lán)蛋白與0.3毫克/毫升巰基化的蛋白A等量混合，搖床低速(小于20轉(zhuǎn)/分鐘)振蕩，4℃反應(yīng)過夜。
熒光藻藍(lán)蛋白標(biāo)記制品，最后溶于磷酸鹽緩沖液(含有0.1摩爾/升乙二胺四乙酸(DETA)、1摩爾/升碘乙酰胺、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％疊氮化鈉(NaN3))，0～5℃保存。
使用熒光藻藍(lán)蛋白晶體標(biāo)記親和素和蛋白A的標(biāo)記率均在60％以上，而使用熒光藻藍(lán)蛋白凍干粉或沉淀標(biāo)記親和素的標(biāo)記率一般為40％-50％，結(jié)果表明，使用熒光藻藍(lán)蛋白晶體進(jìn)行分子標(biāo)記的效果明顯優(yōu)于熒光藻藍(lán)蛋白凍干粉或沉淀的標(biāo)記。
試驗(yàn)例2熒光藻藍(lán)蛋白晶體在免疫分析方面的應(yīng)用。
熒光藻藍(lán)蛋白與抗體的交聯(lián)試驗(yàn)材料選本發(fā)明的熒光藻藍(lán)蛋白晶體分子量約260000道爾頓；pH值7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖液(PBS)；PD-10柱(葡聚糖凝膠層析柱Sephadex G-25M)，安瑪西亞Amersham公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號No.17-0851-01；NAP5柱(葡聚糖凝膠層析柱Sephadex G-25 DNA grade)，安瑪西亞Amersham公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號No 17-0853-02；琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)己烷-1-碳酸酯)(SMCC)，Pierce公司，產(chǎn)品目錄號No.22360；N-乙基馬來酰胺(NEM)，Sigma公司，產(chǎn)品目錄號E-1271；二甲基亞砜(DMSO)，Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號No.27,685-5。
試驗(yàn)方法1)、熒光藻藍(lán)蛋白晶體的預(yù)處理將熒光藻藍(lán)蛋白晶體溶于1.0毫升磷酸鹽緩沖液(PBS)中，于透析緩沖液中透析除鹽。透析后的熒光藻藍(lán)蛋白濃度調(diào)整到5-10毫克/毫升為宜。
2)、熒光藻藍(lán)蛋白的衍生化將琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)己烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解于無水二甲基亞砜(DMSO)配制成10毫克/毫升的母液，每毫克的熒光藻藍(lán)蛋白添加11微升的SMCC，鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60分鐘，使藻藍(lán)蛋白分子上的氨基與琥珀酰胺反應(yīng)生成衍生化的藻藍(lán)蛋白。
交換緩沖液預(yù)先平衡凝膠柱，將衍生化的熒光藻藍(lán)蛋白過柱。
3)、抗體的處理二硫蘇糖醇(DTT)溶解于蒸餾水中，配制成1摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)母液，調(diào)整抗體的濃度，使其濃度至少為4毫克/毫升。
每毫升抗體溶液中加入20微升的二硫蘇糖醇(DTT)母液，室溫靜置反應(yīng)30分鐘，將抗體的二硫鍵打開形成巰基。
交換緩沖液預(yù)先平衡凝膠柱，將反應(yīng)液過柱，收集抗體部分。
4)、熒光藻藍(lán)蛋白和抗體的共價交聯(lián)每毫克抗體加入3.2毫克的SMCC衍生化的熒光藻藍(lán)蛋白，鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60分鐘，使藻藍(lán)蛋白分子上的馬來酰亞胺基和抗體上的巰基實(shí)現(xiàn)共價交聯(lián)。
10毫克的N-乙基馬來酰胺(NEM)溶解于1.0毫升的無水二甲基亞砜(DMSO)中制成N-乙基馬來酰胺(NEM)母液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。
每毫克抗體中加入3.4微升N-乙基馬來酰胺(NEM)母液，鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60分鐘，反應(yīng)后，使抗體上的巰基封閉。
5)、交聯(lián)物的存儲將交聯(lián)物于存儲緩沖液中透析后保存于冰箱。
結(jié)果表明，當(dāng)使用熒光藻藍(lán)蛋白的沉淀產(chǎn)品來實(shí)現(xiàn)該用途時，由于沉淀產(chǎn)品只是蛋白的硫酸銨沉淀物，在使用中存在一定的局限性和缺點(diǎn)，不能保證在實(shí)施熒光檢測及免疫分析標(biāo)記前熒光藻藍(lán)蛋白的同一性，故對分析結(jié)果的精準(zhǔn)性產(chǎn)生一定影響。用熒光藻藍(lán)蛋白的晶體來實(shí)現(xiàn)該用途，更好地解決了熒光藻藍(lán)蛋白在此領(lǐng)域的缺陷，使標(biāo)記和分析更加精準(zhǔn)。將熒光藻藍(lán)蛋白的晶體用于熒光檢測及免疫分析，或與其他物質(zhì)如抗體、生物素、親合素、免疫蛋白等結(jié)合，制成熒光探針或熒光標(biāo)記用于熒光檢測及分析。通過檢測其發(fā)出的熒光，可以用于熒光顯微檢測、熒光免疫測定、雙色或多色熒光分析、癌細(xì)胞表面抗原檢測、疾病檢測診斷、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分析。
試驗(yàn)例3熒光藻藍(lán)蛋白晶體用于制備光子開關(guān)試驗(yàn)材料選本發(fā)明的熒光藻藍(lán)蛋白晶體分子量約260000道爾頓。
試驗(yàn)原理熒光藻藍(lán)蛋白晶體是一種重要的光敏蛋白生物光色材料，具有光驅(qū)動質(zhì)子泵功能。具備的光致變色、非線性光學(xué)變換、直視圖顯示、調(diào)整光電響應(yīng)、雙穩(wěn)態(tài)、開關(guān)存儲等特性，在光學(xué)信息存儲與處理、快速光電探測、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方面具有潛在的應(yīng)用前景。熒光藻藍(lán)蛋白晶體具有的光敏性構(gòu)象變化使其成為理想的光子開關(guān)材料。在特定波長的光照射下，處于基態(tài)的熒光藻藍(lán)蛋白晶體(FPC)分子發(fā)生一系列相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)變化，即光異構(gòu)化過程，形成一定的光循環(huán)，在光循環(huán)過程中，其中間產(chǎn)物的各吸收波長相對于初態(tài)發(fā)生一定的頻移。對于光子開關(guān)而言，是利用熒光藻藍(lán)蛋白分子在不同波長光作用下的非線性吸收特性來實(shí)現(xiàn)的.其分子光異構(gòu)化過程非?？欤_(dá)到了ps量級，且以分子作為邏輯門理論最小工作單元，因而有望使光子開關(guān)的速度及集成度得到更進(jìn)一步的提高。
試驗(yàn)方法將熒光藻藍(lán)蛋白晶體溶解于水，用甩膠的方法在經(jīng)過親水處理后的導(dǎo)電玻璃(ITO)上涂一層水溶性的熒光藻藍(lán)蛋白膠膜，自然干燥后得到藍(lán)色透明的熒光藻藍(lán)蛋白膜，厚約為500nm。然后在其上蒸上厚約為50nm的金屬Al膜，器件有效面積為1.0×1.0cm，電阻約為1.5×106Ω。
當(dāng)導(dǎo)電玻璃為負(fù)電極時是低阻方向，其電阻約為100Ω，其伏安特性幾乎表現(xiàn)為線性關(guān)系。而當(dāng)導(dǎo)電玻璃為正電極時是高阻方向，其伏安特性表現(xiàn)為非線性變化關(guān)系，是典型的二極管伏安特性，這種非線性伏安特性主要來自金屬Al與熒光藻藍(lán)蛋白的相互作用。這表明在電極附近形成了空間電荷區(qū)。
在600nm激發(fā)下，熒光藻藍(lán)蛋白的光致發(fā)光峰的位置約為645nm；而熒光藻藍(lán)蛋白的電致發(fā)光峰則隨所加電壓的不同而有所不同。我們同時還發(fā)現(xiàn)當(dāng)導(dǎo)電玻璃為負(fù)電極時，由于電阻值較小，此時很難觀察到熒光藻藍(lán)蛋白的電致發(fā)光，而當(dāng)導(dǎo)電玻璃為正電極時則很容易觀察到較強(qiáng)的熒光藻藍(lán)蛋白的電致發(fā)光。
熒光藻藍(lán)蛋白吸收峰在620nm(2.0eV)附近，光致發(fā)光峰位于650nm(1.9eV)附近。當(dāng)在Al/熒光藻藍(lán)蛋白/ITO二端加上一定的電壓，空穴和電子將從ITO和Al電極注入到熒光藻藍(lán)蛋白的價帶和導(dǎo)帶中。熒光藻藍(lán)蛋白的價帶位于5.5～6.0eV，ITO的功函數(shù)越為5.6eV，空穴很容易注入到熒光藻藍(lán)蛋白的價帶中。另一方面，Al的功函數(shù)約為4.1eV，電子亦較容易進(jìn)入熒光藻藍(lán)蛋白的價帶中，而發(fā)出650nm左右的熒光。隨著電壓的增大(大于7V)，從電極注入到熒光藻藍(lán)蛋白導(dǎo)帶中的電子數(shù)增多，導(dǎo)致激子湮滅現(xiàn)象的出現(xiàn)，使此時的電致發(fā)光的強(qiáng)度有所下降。至于在595nm附近出現(xiàn)的新的肩峰，以及隨電壓增大發(fā)光峰的紅移現(xiàn)象，我們認(rèn)為未加電場時，熒光藻藍(lán)蛋白中的發(fā)色團(tuán)的分布是各向同性的，當(dāng)ITO和Al電極分別加上正負(fù)電壓時，具有極性的四吡咯發(fā)色團(tuán)在電場的作用下進(jìn)行局部的微小取向運(yùn)動，改變了四吡咯發(fā)色團(tuán)的空間構(gòu)象，從而導(dǎo)致了它的光譜學(xué)特性的改變。
試驗(yàn)例4熒光藻藍(lán)蛋白晶體用于疾病的治療與預(yù)防。
試驗(yàn)材料選本發(fā)明的熒光藻藍(lán)蛋白晶體分子量約260000道爾頓。
抑制腫瘤細(xì)胞生長運(yùn)用半固體瓊脂培養(yǎng)法和MTT檢測法測定了熒光藻藍(lán)蛋白晶體對人血癌細(xì)胞株HL-60，K-562和U-937生長的影響。體外培養(yǎng)條件下用不同濃度的熒光藻藍(lán)蛋白晶體處理這3種腫瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示熒光藻藍(lán)蛋白晶體對這三種腫瘤細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，并存在濃度劑量效應(yīng)，高濃度抑制作用強(qiáng)。
(1)在較高濃度(100微克/毫升)時對HL-60細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用；(2)在濃度(100微克/毫升和30微克/毫升)時對K-562細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用；(3)在濃度(100微克/毫升)時對U-937細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用。
抗輻射作用從熒光藻藍(lán)蛋白晶體抗輻射作用的機(jī)理來看，造血干細(xì)胞的損傷和恢復(fù)在造血型放射病中起著重要的作用，降低造血干細(xì)胞的放射敏感性或防止照射動物體內(nèi)存活干細(xì)胞的繼續(xù)減少，促使其提前進(jìn)入增殖期，對照射動物造血功能的恢復(fù)將起到有益的作用。預(yù)防性的給小鼠腹腔注射熒光藻藍(lán)蛋白晶體的溶解液，能顯著減輕輻射對小鼠外周血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的損傷，可促進(jìn)小鼠外周白細(xì)胞的恢復(fù)，亦能促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞、粒單系祖細(xì)胞和多能造血干細(xì)胞的恢復(fù)和增殖。
免疫功能給注射有肝腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)小白鼠口服熒光藻藍(lán)蛋白晶體后，實(shí)驗(yàn)組的小白鼠比對照組的小白鼠的成活率明顯提高；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的小白鼠的淋巴細(xì)胞活性明顯高于對照組以及正常小白鼠。因此，熒光藻藍(lán)蛋白晶體能提高免疫系統(tǒng)功能，以抵抗各種疾病。
表1不同劑量組的熒光藻藍(lán)蛋白晶體的治療效果


人類T淋巴細(xì)胞表面具有綿羊紅細(xì)胞(SRBC)的受體，因此，綿羊紅細(xì)胞能粘于T細(xì)胞的周圍，形成玫瑰花樣的細(xì)胞團(tuán)，故名E玫瑰花形試驗(yàn)，形成此種玫瑰花結(jié)的T細(xì)胞稱為紅細(xì)胞玫瑰花形成細(xì)胞。人體T淋巴細(xì)胞E花環(huán)實(shí)驗(yàn)是鑒定與計數(shù)人外周血T淋巴細(xì)胞的功能和數(shù)量的常用方法，特別是活性細(xì)胞玫瑰花形成細(xì)胞(EaRFC)是一組對SRBC具有高度親和力的T細(xì)胞特殊亞組，是T細(xì)胞中具有免疫活性功能的效應(yīng)細(xì)胞。熒光藻藍(lán)蛋白晶體能夠促進(jìn)植物血球凝集素(PHA)刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，能恢復(fù)T細(xì)胞受環(huán)磷酰胺損傷后E玫瑰花環(huán)形成能力，特別是對活性E花環(huán)(Ea)的形成能力有較好的恢復(fù)作用。因此熒光藻藍(lán)蛋白晶體能提高免疫系統(tǒng)功能，以抵抗各種疾病。
消炎作用熒光藻藍(lán)蛋白晶體具有強(qiáng)抗氧化性，是一種活性氧自由基消除劑，在一定程度上具有消炎作用。
熒光藻藍(lán)蛋白晶體能消除葡萄糖氧化酶引起的炎癥。
熒光藻藍(lán)蛋白晶體具有護(hù)肝功效能抑制Fe3+-抗壞血酸誘導(dǎo)的肝臟微粒體脂過氧化作用。口服50-300毫克/千克劑量的熒光藻藍(lán)蛋白晶體即能產(chǎn)生明顯的消炎作用。其消炎活性不依賴于皮質(zhì)類固醇的釋放。且對急、慢性炎癥組織都有作用。
熒光藻藍(lán)蛋白晶體能抑制紅細(xì)胞的裂解，其作用方式與trolox(維生素E類似物)和抗壞血酸(維生素C)的作用方式相同，但抗氧化性較trolox強(qiáng)16倍，較維生素C強(qiáng)20倍。熒光藻藍(lán)蛋白晶體能通過消除水相中的過氧化物自由基來防止其誘導(dǎo)的紅細(xì)胞裂解。
總之，炎癥代謝產(chǎn)物，如白細(xì)胞三烯、氧自由基等能誘導(dǎo)白細(xì)胞遷移進(jìn)入組織或黏附于血管內(nèi)皮，而中性白細(xì)胞的黏附和浸潤是炎癥反應(yīng)的核心。在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中，熒光藻藍(lán)蛋白晶體通過清除活性氧物質(zhì)(ROS)，例如羥自由基(OH·)、烷氧自由基(RO·)和超氧化物自由基等，在一定程度上起到緩解炎癥的作用。
熒光藻藍(lán)蛋白晶體抗癌的機(jī)理
抗癌機(jī)制熒光藻藍(lán)蛋白能被腫瘤細(xì)胞選擇性吸收到細(xì)胞膜中。根據(jù)對K-562細(xì)胞的作用研究發(fā)現(xiàn)，熒光藻藍(lán)蛋白能引起原癌基因(c-myc)的含量的增高，而對BCL-2的表達(dá)量沒有影響。因此可見是原癌基因(c-myc)表達(dá)量的增高引起了細(xì)胞的凋亡，或存在另一種途徑抑制了K-562細(xì)胞的生長，從而達(dá)到抗癌的效果。熒光藻藍(lán)蛋白可作為一種DNA穩(wěn)定因子起作用，通過影響合成DNA和RNA的機(jī)制，來抑制腫瘤細(xì)胞生長，或以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信息分子的改變來達(dá)到抗癌效果。
以上機(jī)理表明可以將熒光藻藍(lán)蛋白晶體作為一種功效成分制成藥物或食物，用于癌癥、腫瘤疾病的治療與預(yù)防。
結(jié)果表明熒光藻藍(lán)蛋白晶體不僅可以制備抗癌抗腫瘤藥物，還可將熒光藻藍(lán)蛋白晶體作為一種功效成分或中間體，制備成藥物或食物用于癌癥、腫瘤的預(yù)防與治療；又可將熒光藻藍(lán)蛋白晶體作為一種功效成分或中間體，制備成藥物或食物用于抗輻射、增強(qiáng)免疫力或消炎多色熒光分析、癌細(xì)胞表面抗原檢測、疾病檢測診斷、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分析。
試驗(yàn)例5熒光藻藍(lán)蛋白晶體在保健食品方面的應(yīng)用試驗(yàn)材料配方1含35％的熒光藻藍(lán)蛋白晶體成品，藻多糖、螺旋藻粗提干粉、生曬參、天然維生素E，其余為水，制成膠囊。
配方2藻多糖、螺旋藻粗提干粉、生曬參、天然維生素E，其余為水，制成膠囊。
試驗(yàn)方法1.用亞急性試驗(yàn)方法評價了配方1膠囊和配方2膠囊對隨機(jī)抽取的昆明小鼠300只抗輻射作用的影響，以及配方1膠囊對輻射后小鼠白細(xì)胞總數(shù)的影響，一次照射60Co-γ射線，結(jié)果顯示如表2所示表2兩種膠囊對小鼠存活率的影響

注配方組1和配方2相比X2＝59.98，P＜0.01。說明含有熒光藻藍(lán)蛋白晶體配方組1比對照配方組2對輻射后的小鼠有很好的保健作用。
表3配方1膠囊對小鼠白細(xì)胞總數(shù)的影響。

注**與對照組比較，P＜0.012.用負(fù)重游泳試驗(yàn)及生化指標(biāo)檢測評價了配方I保健膠囊的抗疲勞作用。膠囊以125mg/kg.bw、250mg/kg.bw、750mg/kg.bw的劑量連續(xù)給小鼠灌胃30d。結(jié)果顯示，高劑量組小鼠負(fù)重游泳時間明顯長于對照組；游泳后0min高劑量組及游泳后30min高、中劑量組小鼠血乳糖明顯低于對照組；高劑量組小鼠肝糖原含量明顯高于對照組；高劑量組小鼠血清尿素氮含量明顯低于對照組。表面此膠囊具有抗疲勞作用。
表4配方I膠囊對負(fù)重游泳試驗(yàn)的小鼠之間的對比

注**與對照組比較，P＜0.01試驗(yàn)例5三種不同的熒光藻藍(lán)蛋白狀態(tài)下的穩(wěn)定性之間的比較試驗(yàn)材料熒光藻藍(lán)蛋白沉淀、熒光藻藍(lán)蛋白凍干粉、熒光藻藍(lán)蛋白晶體。
試驗(yàn)方法目前，熒光藻藍(lán)蛋白沉淀的適宜保存方法為4℃條件下，懸浮于150mM磷酸鈉，60％硫酸銨，pH7.0，1mM EDTA，1mM NaN3溶液中；熒光藻藍(lán)蛋白凍干粉的適宜保存方法為4℃條件下保存。本發(fā)明熒光藻藍(lán)蛋白晶體的適宜保存方法為4℃條件下，懸浮于150mM磷酸鈉，60％硫酸銨，pH7.0，1mM EDTA，1mMNaN3溶液中。
將熒光藻藍(lán)蛋白沉淀、凍干粉和晶體三種形態(tài)的產(chǎn)品于各自的適宜保存條件下保存，不同的保存時間取出，用0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PBS)配成濃度為100ug/L的熒光藻藍(lán)蛋白溶液，測定620納米波長下的吸光光度值，計算出相對吸光值。
表5熒光藻藍(lán)蛋白三種不同狀態(tài)下的穩(wěn)定性之間的比較 熒光藻藍(lán)蛋白晶體在其適宜的條件下保存兩年后，相對吸光光度值無變化，而熒光藻藍(lán)蛋白以沉淀和凍干粉的形態(tài)保存兩年后，相對吸光光度值的降低量分別為61％和35％，這表明熒光藻藍(lán)蛋白以晶體的形態(tài)保存明顯優(yōu)于沉淀和凍干粉形態(tài)。分析其原因，熒光藻藍(lán)蛋白以晶體形態(tài)存在時，熒光藻藍(lán)蛋白分子按照特定的規(guī)律排列于晶胞中，色素基團(tuán)包被于熒光藻藍(lán)蛋白分子內(nèi)而受到有效的保護(hù)，不易被氧化和微生物降解；而熒光藻藍(lán)蛋白以沉淀和凍干粉的形態(tài)保存時，熒光藻藍(lán)蛋白的分子為無序排列，色素蛋白大量暴露于分子外圍，容易被氧化或微生物降解而導(dǎo)致熒光藻藍(lán)蛋白的變性，導(dǎo)致熒光藻藍(lán)蛋白在620納米波長下的吸光光度值的降低。
實(shí)施例11、熒光藻藍(lán)蛋白的制備細(xì)胞破碎稱取鈍頂螺旋藻置入燒杯中，用蒸餾水清洗兩次，加入pH值6.0、濃度0.005mol/L的磷酸緩沖液，攪拌均勻。于冰浴(0℃)中1800W超聲破碎30分鐘，將破碎好的藻液置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，8000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)0℃下離心離心60分鐘，去掉沉淀，收集上清液；鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達(dá)到25％飽和度，0℃溫度條件下靜置10小時，6000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)0℃冷凍離心60分鐘，棄去沉淀。上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(0℃)靜置10小時，6000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)0℃冷凍離心60分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH6.0)溶解，在0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中充分透析第一次羥基磷灰石柱層析將透析后的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為5ml，然后在洗脫過程中以0.005-0.2mol/L的線性梯度磷酸鹽緩沖液(pH6.0磷酸鹽緩沖液，含0.1mol/L氯化鈉)洗脫，流速為0.5ml/min，洗脫總體積為600ml。用自動部分收集器收集洗脫液。將熒光藻藍(lán)蛋白含量和純度較高的收集液合并在一起，分別加入固體硫酸銨至80％飽和度，于低溫(0℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-150)柱層析上述純化收集的熒光藻藍(lán)蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-150)分子篩柱上。用0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液緩沖液(pH值6.0)洗脫，控制流速在5ml/min，收集A620/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數(shù)次鹽析濃縮后的熒光藻藍(lán)蛋白合并，以6000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)0℃冷凍離心離心60分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH6.0)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中充分透析。將透析后的藻藍(lán)蛋白加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時相同，洗脫體積為1000ml，收集A620/A280＞4.0、A620/A280＞4.5和A620/A280＞5.0的部分。
2.熒光藻藍(lán)蛋白晶體的制備將制備A620/A280＞4.0、4.5或A620/A280＞5.0的熒光藻藍(lán)蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恒低溫條件(溫度控制在0℃)的超凈工作上。溶液中加入0.2％(質(zhì)量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質(zhì)量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動調(diào)控裝置調(diào)節(jié)液體的pH值始終穩(wěn)定在pH6.0。
將固體硫酸銨溶解于0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中制備成100％飽和度的硫酸銨溶液，并用0.2μm的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛熒光藻藍(lán)蛋白溶液中，并輕微攪動，使溶液混合均勻，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的熒光藻藍(lán)蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(0℃)預(yù)冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然后用65％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體3遍。
將所得到的熒光藻藍(lán)蛋白晶體溶解于0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.0.)中，按照以上結(jié)晶的方法和步驟，實(shí)施重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
熒光藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)的確定熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)分子結(jié)構(gòu)為通過一個或兩個硫醚鍵共價連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)(藻藍(lán)素Phycocyanobilins，PCB)——一種開鏈四吡咯發(fā)色團(tuán)組成的，接位點(diǎn)通常在α84(α亞基第84位氨基酸)和β84(β亞基第84位氨基酸)等保守位點(diǎn)上。其脫輔蛋白由等摩爾量的α和β亞基構(gòu)成，α、β亞基是由160～180個氨基酸構(gòu)成的多肽鏈。α亞基分子量大小約為13～20kD，β亞基分子量大小約為14～24kD。在離體條件下，熒光藻藍(lán)蛋白以(αβ)3和(αβ)6存在。熒光藻藍(lán)蛋白的α和β亞基通過分子間的各種相互作用力(疏水鍵、氫鍵、和離子鍵等)先形成單體(αβ)，單體之間再聚合成三聚體(αβ)3(這時還需要有連接多肽(linkerpolypeptides)的作用)。熒光藻藍(lán)蛋白的六聚體(αβ)6由兩個(αβ)3組成。熒光藻藍(lán)蛋白的α亞基含1個藻藍(lán)素，β亞基含2個藻藍(lán)素。
熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)在620nm處有最大吸收峰，在280nm和360nm處具有特異性熒光激發(fā)峰，在650nm左右具有熒光吸收峰。其等電點(diǎn)為4.6。
熒光藻藍(lán)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的確定利用x-射線衍射的方法對本發(fā)明所制備的熒光藻藍(lán)蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其結(jié)果如下熒光藻藍(lán)蛋白晶體中，運(yùn)用X射線衍射分析在2.2埃分辨率水平測定了藻藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，晶體學(xué)R因子為19.2％，自由R因子為23.9％。晶胞參數(shù)為a＝107.20，b＝115.40，c＝183.04，β＝90.2°，晶胞的不對稱單位由兩個(αβ)六聚體組成，晶體屬于P21空間群。
實(shí)施例21、熒光藻藍(lán)蛋白的制備細(xì)胞破碎稱取鈍頂螺旋藻置入燒杯中，用蒸餾水清洗兩次，加入pH值6.8、濃度0.005mol/L的磷酸緩沖液，攪拌均勻。于冰浴(0℃)中1800W超聲破碎40分鐘，將破碎好的藻液置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，7000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)2℃下離心90分鐘，去掉沉淀，收集上清液；鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達(dá)到25％飽和度，2℃溫度條件下靜置10小時，7000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)2℃冷凍離心90分鐘，棄去沉淀。上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(2℃)靜置10小時，7000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)2℃冷凍離心90分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中充分透析第一次羥基磷灰石柱層析將透析后的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為15ml，然后以0.005-0.1mol/L的線性梯度磷酸鹽緩沖液(pH6.4磷酸鹽緩沖液，含0.1mol/L氯化鈉)洗脫，流速為0.8ml/min，洗脫總體積為600ml。用自動部分收集器收集洗脫液。將熒光藻藍(lán)蛋白含量和純度較高的收集液合并在一起，分別加入固體硫酸銨至80％飽和度，于低溫(2℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-150)柱層析上述純化收集的熒光藻藍(lán)蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-150)分子篩柱上。用0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液緩沖液(pH值6.8)洗脫，控制流速在5ml/min，收集A620/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數(shù)次鹽析濃縮后的熒光藻藍(lán)蛋白合并，以7000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)2℃冷凍離心離心90分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中充分透析。將透析后的藻藍(lán)蛋白加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時相同，洗脫體積為1000ml，收集A620/A280＞4.0、A620/A280＞4.5和A620/A280＞5.0的部分。
2.熒光藻藍(lán)蛋白晶體的制備將制備A620/A280＞4.0、4.5或A620/A280＞5.0的熒光藻藍(lán)蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恒低溫條件(溫度控制在10℃)的超凈工作上。溶液中加入0.2％(質(zhì)量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質(zhì)量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動調(diào)控裝置調(diào)節(jié)液體的pH值始終穩(wěn)定在pH6.8。
將固體硫酸銨溶解于0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液(PH6.8)中制備成100％飽和度的硫酸銨溶液，并用0.2μm的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛熒光藻藍(lán)蛋白溶液中，并輕微攪動，使溶液混合均勻，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的熒光藻藍(lán)蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(0℃)預(yù)冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然后用60％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體4遍。
將所得到的熒光藻藍(lán)蛋白晶體溶解于0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中，按照以上結(jié)晶的方法和步驟，實(shí)施重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
熒光藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)的確定熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)分子結(jié)構(gòu)為通過一個或兩個硫醚鍵共價連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)(藻藍(lán)素Phycocyanobilins，PCB)——一種開鏈四吡咯發(fā)色團(tuán)組成的，接位點(diǎn)通常在α84(α亞基第84位氨基酸)和β84(β亞基第84位氨基酸)等保守位點(diǎn)上。其脫輔蛋白由等摩爾量的α和β亞基構(gòu)成，α、β亞基是由160～180個氨基酸構(gòu)成的多肽鏈。α亞基分子量大小約為13～20kD，β亞基分子量大小約為14～24kD。在離體條件下，熒光藻藍(lán)蛋白以(αβ)3和(αβ)6存在。熒光藻藍(lán)蛋白的α和β亞基通過分子間的各種相互作用力(疏水鍵、氫鍵、和離子鍵等)先形成單體(αβ)，單體之間再聚合成三聚體(αβ)3(這時還需要有連接多肽(linkerpolypeptides)的作用)。熒光藻藍(lán)蛋白的六聚體(αβ)6由兩個(αβ)3組成。熒光藻藍(lán)蛋白的α亞基含1個藻藍(lán)素，β亞基含2個藻藍(lán)素。
熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)在620nm處有最大吸收峰，在280nm和360nm處具有特異性熒光激發(fā)峰，在650nm左右具有熒光吸收峰。其等電點(diǎn)為4.6。
熒光藻藍(lán)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的確定利用X-射線衍射的方法對本發(fā)明所制備的熒光藻藍(lán)蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其結(jié)果如下熒光藻藍(lán)蛋白晶體中，運(yùn)用X射線衍射分析在2.2埃分辨率水平測定了熒光藻藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，晶體學(xué)R因子為19.2％，自由R因子為23.9％。晶胞參數(shù)為a＝107.20，b＝115.40，c＝183.04，β＝90.2°，晶胞的不對稱單位由兩個(αβ)六聚體組成，晶體屬于P21空間群。
實(shí)施例31、熒光藻藍(lán)蛋白的制備細(xì)胞破碎稱取鈍頂螺旋藻置入燒杯中，用蒸餾水清洗兩次，加入pH值7.1、濃度0.005mol/L的磷酸緩沖液，攪拌均勻。于冰浴(0℃)中1800W超聲破碎35分鐘，將破碎好的藻液置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，9000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)4℃下離心50分鐘，去掉沉淀，收集上清液；鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達(dá)到20％飽和度，5℃溫度條件下靜置10小時，9000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)4℃冷凍離心離心35分鐘，棄去沉淀。上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(5℃)靜置10小時，9000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)4℃冷凍離心離心35分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.1)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.1)中充分透析第一次羥基磷灰石柱層析將透析后的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為20ml，然后在洗脫過程中以0.005-0.15mol/L的線性梯度磷酸鹽緩沖液(pH7.1磷酸鹽緩沖液，含0.1mol/L氯化鈉)洗脫，流速為1.2ml/min，洗脫總體積為800ml。用自動部分收集器收集洗脫液。將熒光藻藍(lán)蛋白含量和純度較高的收集液合并在一起，分別加入固體硫酸銨至80％飽和度，于低溫(5℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-200)柱層析上述純化收集的熒光藻藍(lán)蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-200)分子篩柱上。用0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液緩沖液(pH值7.1)洗脫，控制流速在5ml/min，收集A620/A280＞4.0的熒光藻藍(lán)蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數(shù)次鹽析濃縮后的熒光藻藍(lán)蛋白合并，以9000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)4℃冷凍離心離心35分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.1)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.1)中充分透析。將透析后的藻藍(lán)蛋白加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時相同，洗脫體積為1000ml，收集A620/A280＞4.0、A620/A280＞4.5和A620/A280＞5.0的部分。
2.熒光藻藍(lán)蛋白晶體的制備將制備A620/A280＞4.0、4.5或A620/A280＞5.0的熒光藻藍(lán)蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恒低溫條件(溫度控制在10℃)的超凈工作上。溶液中加入0.2％(質(zhì)量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質(zhì)量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動調(diào)控裝置調(diào)節(jié)液體的pH值始終穩(wěn)定在pH7.1。
將固體硫酸銨溶解于0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.1)中制備成100％飽和度的硫酸銨溶液，并用0.2μm的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛熒光藻藍(lán)蛋白溶液中，并輕微攪動，使溶液混合均勻，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的熒光藻藍(lán)蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(5℃)預(yù)冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然后用60％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體5遍。
將所得到的熒光藻藍(lán)蛋白晶體溶解于0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.1)中，按照以上結(jié)晶的方法和步驟，實(shí)施重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
熒光藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)的確定熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)分子結(jié)構(gòu)為通過一個或兩個硫醚鍵共價連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)(藻藍(lán)素Phycocyanobilins，PCB)——一種開鏈四吡咯發(fā)色團(tuán)組成的，接位點(diǎn)通常在α84(α亞基第84位氨基酸)和β84(β亞基第84位氨基酸)等保守位點(diǎn)上。其脫輔蛋白由等摩爾量的α和β亞基構(gòu)成，α、β亞基是由160～180個氨基酸構(gòu)成的多肽鏈。α亞基分子量大小約為13～20kD，β亞基分子量大小約為14～24kD。在離體條件下，熒光藻藍(lán)蛋白以(αβ)3和(αβ)6存在。熒光藻藍(lán)蛋白的α和β亞基通過分子間的各種相互作用力(疏水鍵、氫鍵、和離子鍵等)先形成單體(αβ)，單體之間再聚合成三聚體(αβ)3(這時還需要有連接多肽(linkerpolypeptides)的作用)。熒光藻藍(lán)蛋白的六聚體(αβ)6由兩個(αβ)3組成。熒光藻藍(lán)蛋白的α亞基含1個藻藍(lán)素，β亞基含2個藻藍(lán)素。
熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)在620nm處有最大吸收峰，在280nm和360nm處具有特異性熒光激發(fā)峰，在650nm左右具有熒光吸收峰。其等電點(diǎn)為4.6。
熒光藻藍(lán)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的確定利用X-射線衍射的方法對本發(fā)明所制備的熒光藻藍(lán)蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其結(jié)果如下熒光藻藍(lán)蛋白晶體中，運(yùn)用X射線衍射分析在2.2埃分辨率水平測定了熒光藻藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，晶體學(xué)R因子為19.2％，自由R因子為23.9％。晶胞參數(shù)為a＝107.20，b＝115.40，c＝183.04，β＝90.2°，晶胞的不對稱單位由兩個(αβ)六聚體組成，晶體屬于P21空間群。
實(shí)施例41、熒光藻藍(lán)蛋白的制備細(xì)胞破碎稱取鈍頂螺旋藻置入燒杯中，用蒸餾水清洗兩次，加入pH值7.2、濃度0.005mol/L的磷酸緩沖液，攪拌均勻。于冰浴(0℃)中1800W超聲破碎30分鐘，將破碎好的藻液置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，10000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)10℃下離心30分鐘，去掉沉淀，收集上清液；鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達(dá)到25％飽和度，10℃溫度條件下靜置14小時，10000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)7℃冷凍離心30分鐘，棄去沉淀。上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(10℃)靜置14小時，10000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)7℃冷凍離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.2)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中充分透析第一次羥基磷灰石柱層析將透析后的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為30ml，然后在洗脫過程中以0.005-0.18mol/L的線性梯度磷酸鹽緩沖液(pH7.2磷酸鹽緩沖液，含0.1mol/L氯化鈉)洗脫，流速為1.6ml/min，洗脫總體積為800ml。用自動部分收集器收集洗脫液。將熒光藻藍(lán)蛋白含量和純度較高的收集液合并在一起，分別加入固體硫酸銨至80％飽和度，于低溫(10℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-150)柱層析上述純化收集的熒光藻藍(lán)蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-150)分子篩柱上。用0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液緩沖液(pH值7.2)洗脫，控制流速在5ml/min，收集A620/A280＞4.0的熒光藻藍(lán)蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數(shù)次鹽析濃縮后的熒光藻藍(lán)蛋白合并，以10000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)7℃冷凍離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.2)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中充分透析。將透析后的熒光藻藍(lán)蛋白加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時相同，洗脫體積為1000ml，收集A620/A280＞4.0、A620/A280＞4.5和A620/A280＞5.0的部分。
2.熒光藻藍(lán)蛋白晶體的制備將制備A620/A280＞4.0、4.5或A620/A280＞5.0的熒光藻藍(lán)蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恒低溫條件(溫度控制在10℃)的超凈工作上。溶液中加入0.2％(質(zhì)量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質(zhì)量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動調(diào)控裝置調(diào)節(jié)液體的pH值始終穩(wěn)定在pH7.2。
將固體硫酸銨溶解于0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中制備成100％飽和度的硫酸銨溶液，并用0.2μm的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛熒光藻藍(lán)蛋白溶液中，并輕微攪動，使溶液混合均勻，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的熒光藻藍(lán)蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(5℃)預(yù)冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然后用65％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體3遍。
將所得到的熒光藻藍(lán)蛋白晶體溶解于0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中，按照以上結(jié)晶的方法和步驟，實(shí)施重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
熒光藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)的確定熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)分子結(jié)構(gòu)為通過一個或兩個硫醚鍵共價連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)(藻藍(lán)素Phycocyanobilins，PCB)——一種開鏈四吡咯發(fā)色團(tuán)組成的，接位點(diǎn)通常在α84(α亞基第84位氨基酸)和β84(β亞基第84位氨基酸)等保守位點(diǎn)上。其脫輔蛋白由等摩爾量的α和β亞基構(gòu)成，α、β亞基是由160～180個氨基酸構(gòu)成的多肽鏈。α亞基分子量大小約為13～20kD，β亞基分子量大小約為14～24kD。在離體條件下，熒光藻藍(lán)蛋白以(αβ)3和(αβ)6存在。熒光藻藍(lán)蛋白的α和β亞基通過分子間的各種相互作用力(疏水鍵、氫鍵、和離子鍵等)先形成單體(αβ)，單體之間再聚合成三聚體(αβ)3(這時還需要有連接多肽(linkerpolypeptides)的作用)。熒光藻藍(lán)蛋白的六聚體(αβ)6由兩個(αβ)3組成。熒光藻藍(lán)蛋白的α亞基含1個藻藍(lán)素，β亞基含2個藻藍(lán)素。
熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)在620nm處有最大吸收峰，在280nm和360nm處具有特異性熒光激發(fā)峰，在650nm左右具有熒光吸收峰。其等電點(diǎn)為4.6。
熒光藻藍(lán)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的確定利用X-射線衍射的方法對本發(fā)明所制備的熒光藻藍(lán)蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其結(jié)果如下熒光藻藍(lán)蛋白晶體中，運(yùn)用X射線衍射分析在2.2埃分辨率水平測定了熒光藻藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，晶體學(xué)R因子為19.2％，自由R因子為23.9％。晶胞參數(shù)為a＝107.20，b＝115.40，c＝183.04，β＝90.2°，晶胞的不對稱單位由兩個(αβ)六聚體組成，晶體屬于P21空間群。
實(shí)施例51、熒光藻藍(lán)蛋白的制備細(xì)胞破碎稱取鈍頂螺旋藻置入燒杯中，用蒸餾水清洗兩次，加入pH值7.5、濃度0.005mol/L的磷酸緩沖液，攪拌均勻。于冰浴(0℃)中1800W超聲破碎35分鐘，將破碎好的藻液置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，8000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)10℃下離心60分鐘，去掉沉淀，收集上清液；鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達(dá)到25％飽和度，4℃溫度條件下靜置8小時，8000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)10℃冷凍離心60分鐘，棄去沉淀。上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(4℃)靜置8小時，8000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)10℃冷凍離心60分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.5)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中充分透析第一次羥基磷灰石柱層析將透析后的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為25ml，然后在洗脫過程中以0.005-0.1mol/L線性梯度磷酸鹽緩沖液(pH6.4磷酸鹽緩沖液，含0.1mol/L氯化鈉)洗脫，流速為2.5ml/min，洗脫總體積為600ml。用自動部分收集器收集洗脫液。將熒光藻藍(lán)蛋白含量和純度較高的收集液合并在一起，分別加入固體硫酸銨至80％飽和度，于低溫(5℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-200)柱層析上述純化收集的熒光藻藍(lán)蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-200)分子篩柱上。用0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液緩沖液(pH值7.5)洗脫，控制流速在5ml/min，收集A620/A280＞4.0的熒光藻藍(lán)蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數(shù)次鹽析濃縮后的熒光藻藍(lán)蛋白合并，以8000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)10℃冷凍離心離心60分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.5)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中充分透析。將透析后的藻藍(lán)蛋白加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時相同，洗脫體積為1000ml，收集A620/A280＞4.0、A620/A280＞4.5和A620/A280＞5.0的部分。
2.熒光藻藍(lán)蛋白晶體的制備將制備A620/A280＞4.0、4.5或A620/A280＞5.0的熒光藻藍(lán)蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恒低溫條件(溫度控制在10℃)的超凈工作上。溶液中加入0.2％(質(zhì)量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質(zhì)量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動調(diào)控裝置調(diào)節(jié)液體的pH值始終穩(wěn)定在pH7.5。
將固體硫酸銨溶解于0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中制備成100％飽和度的硫酸銨溶液，并用0.2μm的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛熒光藻藍(lán)蛋白溶液中，并輕微攪動，使溶液混合均勻，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的熒光藻藍(lán)蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(5℃)預(yù)冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然后用65％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體3遍。
將所得到的熒光藻藍(lán)蛋白晶體溶解于0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中，按照以上結(jié)晶的方法和步驟，實(shí)施重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
熒光藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)的確定熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)分子結(jié)構(gòu)為通過一個或兩個硫醚鍵共價連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)(藻藍(lán)素Phycocyanobilins，PCB)——一種開鏈四吡咯發(fā)色團(tuán)組成的，接位點(diǎn)通常在α84(α亞基第84位氨基酸)和β84(β亞基第84位氨基酸)等保守位點(diǎn)上。其脫輔蛋白由等摩爾量的α和β亞基構(gòu)成，α、β亞基是由160～180個氨基酸構(gòu)成的多肽鏈。α亞基分子量大小約為13～20kD，β亞基分子量大小約為14～24kD。在離體條件下，熒光藻藍(lán)蛋白以(αβ)3和(αβ)6存在。熒光藻藍(lán)蛋白的α和β亞基通過分子間的各種相互作用力(疏水鍵、氫鍵、和離子鍵等)先形成單體(αβ)，單體之間再聚合成三聚體(αβ)3(這時還需要有連接多肽(linkerpolypeptides)的作用)。熒光藻藍(lán)蛋白的六聚體(αβ)6由兩個(αβ)3組成。熒光藻藍(lán)蛋白的α亞基含1個藻藍(lán)素，β亞基含2個藻藍(lán)素。
熒光藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)在620nm處有最大吸收峰，在280nm和360nm處具有特異性熒光激發(fā)峰，在650nm左右具有熒光吸收峰。其等電點(diǎn)為4.6。
熒光藻藍(lán)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的確定利用X-射線衍射的方法對本發(fā)明所制備的熒光藻藍(lán)蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其結(jié)果如下熒光藻藍(lán)蛋白晶體中，運(yùn)用X射線衍射分析在2.2埃分辨率水平測定了藻藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，晶體學(xué)R因子為19.2％，自由R因子為23.9％。晶胞參數(shù)為a＝107.20，b＝115.40，c＝183.04，β＝90.2°，晶胞的不對稱單位由兩個(αβ)六聚體組成，晶體屬于P21空間群。
權(quán)利要求
1.一種熒光藻藍(lán)蛋白溶液的制備方法，其特征在于，將藻細(xì)胞破碎后，通過過濾和0-4℃，6000-10000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)高速冷凍離心分離，去除沉淀，收集上清，分級鹽析后收集熒光藻藍(lán)蛋白沉淀，沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液后依次經(jīng)過羥基磷灰石、葡聚糖凝膠Sephadex G-150或Sephadex G-200、羥基磷灰石柱層析，羥基磷灰石柱層析時使用濃度范圍為0.005-0.2摩爾/升的磷酸鹽緩沖液洗脫，控制流速在0.5-2.5毫升/分鐘，最后收集A620/A280＞4.0、A620/A280＞4.5、A620/A280＞5.0一種或多種不同純度要求的熒光藻藍(lán)蛋白溶液，制成不同純度級別的熒光藻藍(lán)蛋白溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光藻藍(lán)蛋白溶液的制備方法，其特征在于，所述熒光藻藍(lán)蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用濃度范圍為0.005-0.1摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液洗脫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光藻藍(lán)蛋白溶液的制備方法，其特征在于，所述熒光藻藍(lán)蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用線性梯度磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫流速控制在0.5-5.0毫升/分鐘。
4.一種熒光藻藍(lán)蛋白制備成晶體的方法，其特征在于，將一定純度的熒光藻藍(lán)蛋白放在閉光封閉的環(huán)境中，加入0.05％-0.2％氯化鎂和2％-4％氯化鈉，調(diào)節(jié)pH值使其在晶體的成長過程中始終穩(wěn)定在pH6.0～7.5的范圍內(nèi)，并線性梯度地加入硫酸氨并輕微攪動，使其轉(zhuǎn)變成粗晶體，通過重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光藻藍(lán)蛋白晶體的制備方法，其特征在于，所述的在晶體的成長過程中始終穩(wěn)定在pH6.8～7.2的范圍內(nèi)。
6.一種熒光藻藍(lán)蛋白晶體，分子結(jié)構(gòu)為通過硫醚鍵連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)---開鏈線性延展的四吡咯化合物，脫輔蛋白單體由α、β、兩種亞基組成，在適宜波長激發(fā)下能發(fā)射強(qiáng)烈熒光，特征光譜吸收峰為610～630nm，熒光發(fā)射峰為640～660nm，等電點(diǎn)為3.4～4.8，其特征在于所述的熒光藻藍(lán)蛋白為晶體，所述的熒光藻藍(lán)蛋白為晶體屬于P21空間群。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光藻藍(lán)蛋白晶體，其特征在于，所述的熒光藻藍(lán)蛋白晶體的晶胞參數(shù)為a＝107.20，b＝115.40c＝183.04，β＝90.2°。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的熒光藻藍(lán)蛋白晶體，其特征在于，所述的晶胞內(nèi)的不對稱單位由兩個(αβ)含有一個單體，所述的單體為αβ單體。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的熒光藻藍(lán)蛋白晶體，其特征在于，所述的熒光藻藍(lán)蛋白晶體的特征光譜吸收峰為620nm，熒光發(fā)射峰為650nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的熒光藻藍(lán)蛋白晶體，其特征在于，所述的熒光藻藍(lán)蛋白晶體的特征光譜吸收峰為620nm，熒光發(fā)射峰為650nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白、晶體的制造工藝及制品，尤其涉及的是在一般條件下從藻類中提取的能發(fā)射強(qiáng)烈熒光的藻藍(lán)蛋白并將其轉(zhuǎn)化為晶體形態(tài)，本發(fā)明熒光藻藍(lán)蛋白晶體具有能夠長期保存，所需的保藏條件要求小，熒光活性高的特點(diǎn)，其制作方法在普通的實(shí)驗(yàn)條件下就可以完成，簡單易行，并在科研、醫(yī)療、檢測、信電等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號C07K1/00GK1786026SQ200410089529
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者駱建華, 劉維國, 劉俊 申請人:劉維國