多光子超分辨顯微成像裝置及方法與流程

本發(fā)明涉及顯微成像，特別涉及一種多光子超分辨顯微成像裝置及方法。

背景技術(shù)：

激光共聚焦顯微鏡是80年代隨著光學(xué)、視頻、計(jì)算機(jī)等技術(shù)的飛速發(fā)展而誕生的新一代顯微鏡。目前，已成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中強(qiáng)有力的研究工具。多光子共聚焦顯微鏡是近年來(lái)發(fā)展的一種成像技術(shù)，主要包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡，其原理是使用高光子密度激發(fā)發(fā)光材料，使其同時(shí)吸收兩個(gè)光子或三個(gè)光子躍遷到激發(fā)態(tài)。相對(duì)于傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡，多光子共焦顯微鏡具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)可以采用在生物組織中穿透能力比較強(qiáng)的紅外激光作為激發(fā)光源，可以解決生物組織中深層物質(zhì)的成像問(wèn)題；(2)由于多光子熒光波長(zhǎng)遠(yuǎn)離激發(fā)光波長(zhǎng)，因此多光子共焦顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)暗場(chǎng)成像；(3)多光子熒光可以避免普通熒光成像中的熒光漂白問(wèn)題和對(duì)生物細(xì)胞的光致毒問(wèn)題；(4)多光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性，有利于對(duì)生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究。

由于多光子顯微鏡通常使用紅外光源作為激發(fā)光源，根據(jù)ernstabbe成像理論，遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率極限約為λ/2na，其中λ是光波波長(zhǎng)，na為透鏡數(shù)值孔徑且小于1，因此在可見(jiàn)光波段內(nèi)，多光子熒光顯微鏡的橫向分辨極限為300納米。但是，細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖﹑分化﹑凋亡以及信號(hào)傳遞等體系的特征尺度都在納米量級(jí)，所以多光子顯微鏡分辨率的提高就成為一個(gè)亟需解決的難題。

美國(guó)專利公開(kāi)的專利號(hào)為us5731588的受激輻射損耗顯微鏡(sted)是第一個(gè)突破衍射限制的超分辨顯微鏡，這項(xiàng)技術(shù)在2006年度被《science》雜志評(píng)選為科學(xué)界十大突破之一，2008年被《naturemethod》雜志評(píng)為年度技術(shù)，最終于2014年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。sted顯微術(shù)的基本原理是使用兩束組合激光，一束激光被聚焦成正常的衍射極限焦斑，使焦斑內(nèi)的熒光分子處于激發(fā)態(tài)，另一束波長(zhǎng)較長(zhǎng)的經(jīng)過(guò)相位調(diào)制的中心為零點(diǎn)激光，稱為退激發(fā)光，使激發(fā)態(tài)的電子以受激發(fā)射損耗的方式回到基態(tài)，并發(fā)出一個(gè)與退激發(fā)光波長(zhǎng)相同的光子。

經(jīng)過(guò)二十年的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，sted超分辨顯微術(shù)已取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，日趨成熟和多樣化。已經(jīng)有專利公開(kāi)了雙光子sted顯微術(shù)(cn101821607a)。目前實(shí)現(xiàn)雙光子sted成像的組裝方式為采用兩個(gè)激光飛秒激光器，一個(gè)作為激發(fā)光源，一個(gè)作為退激發(fā)光源。由于需要同步來(lái)自兩個(gè)激光器脈沖的，因此裝置非常復(fù)雜。更重要的是采用兩個(gè)飛秒光源會(huì)使裝置的成本變得昂貴，難以推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低的多光子超分辨顯微成像裝置及方法。

第一方面，本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像裝置，包括：激光光源、分光裝置、并光裝置、物鏡和光子探測(cè)器；所述激光光源發(fā)出的激光到所述分光裝置，所述分光裝置將入射的激光并分為激發(fā)光和退激發(fā)光，所述激發(fā)光經(jīng)過(guò)的光路為第一光路，所述退激發(fā)光經(jīng)過(guò)的光路為第二光路，所述第二光路中設(shè)有空間調(diào)制裝置，所述空間調(diào)制裝置用于對(duì)所述退激發(fā)光進(jìn)行空間調(diào)制，使得所述退激發(fā)光的光斑成為中心零點(diǎn)的光斑；所述并光裝置用于將所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊為同軸光線，重疊后的激光用于經(jīng)物鏡聚焦后照射熒光樣品，光子探測(cè)器用于采集探測(cè)熒光樣品發(fā)出的熒光，進(jìn)行成像。

本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像裝置，僅使用一個(gè)激光光源，通過(guò)偏分光裝置將激光分成兩束，一束作為退激發(fā)光，另一束作為激發(fā)光，退激發(fā)光經(jīng)相位調(diào)制變成中心零點(diǎn)的光斑，然后將激發(fā)光和退激發(fā)光通過(guò)并光裝置合并為同軸光線，并由物鏡聚焦到待測(cè)樣品上，激發(fā)待測(cè)樣品的熒光。產(chǎn)生的熒光進(jìn)入單光子探測(cè)器進(jìn)行采集，進(jìn)行成像。由于本發(fā)明中使用的激發(fā)光和退激發(fā)光來(lái)自同一臺(tái)激光器，因此他們的脈沖重復(fù)頻率從本質(zhì)上是同步的，無(wú)需使用額外的電子元器件,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實(shí)施方式，所述第二光路中還設(shè)有脈沖拉寬裝置和脈沖時(shí)間調(diào)制裝置。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實(shí)施方式，所述脈沖拉寬裝置包括多個(gè)脈沖拉寬器。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實(shí)施方式，所述第二光路中還設(shè)有第一能量開(kāi)關(guān)，用于控制所述退激發(fā)光的激光能量。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實(shí)施方式，所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊后的激光還經(jīng)過(guò)第二能量開(kāi)關(guān)，所述第二能量開(kāi)關(guān)用于控制重疊后激光的激光能量。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實(shí)施方式，所述光子探測(cè)器的入射端還設(shè)置有濾鏡，所述濾鏡用于選擇所需測(cè)量的光譜范圍。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實(shí)施方式，所述第一光路中設(shè)有第一擴(kuò)束器，所述第二光路中設(shè)有第二擴(kuò)束器，且所述第二激光先經(jīng)過(guò)所述第二擴(kuò)束器擴(kuò)束后，進(jìn)入所述空間調(diào)制裝置。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實(shí)施方式，所述第一擴(kuò)束器和所述第二擴(kuò)束器均為凸透鏡。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實(shí)施方式，還包括半波片，所述激光光源發(fā)出的激光經(jīng)所述半波片入射到所述分光裝置。

第二方面，本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像方法，包括如下步驟：

步驟s1，將初始激光分為激發(fā)光和退激發(fā)光；

步驟s2，對(duì)所述退激發(fā)光進(jìn)行空間調(diào)制，使得所述退激發(fā)光的光斑成為中心零點(diǎn)的光斑；

步驟s3，將所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊為同軸光線，并聚焦于待測(cè)熒光物上；

步驟s4，采集熒光樣品發(fā)出的熒光，獲得圖像。

本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像方法，將初始激光分成兩束，一束作為退激發(fā)光，另一束作為激發(fā)光，退激發(fā)光經(jīng)相位調(diào)制變成中心零點(diǎn)的光斑，然后將激發(fā)光和退激發(fā)光合并為同軸光線，并聚焦到待測(cè)樣品上，激發(fā)待測(cè)樣品的熒光，熒光樣品發(fā)出的熒光，進(jìn)行成像。由于本發(fā)明中使用的激發(fā)光和退激發(fā)光來(lái)自同一臺(tái)激光器，因此他們的脈沖重復(fù)頻率從本質(zhì)上是同步的，無(wú)需使用額外的電子元器件,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。在所有附圖中，類似的元件或部分一般由類似的附圖標(biāo)記標(biāo)識(shí)。附圖中，各元件或部分并不一定按照實(shí)際的比例繪制。

圖1為一實(shí)施例提供的多光子超分辨顯微成像裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為一實(shí)施例提供的對(duì)退激發(fā)光進(jìn)行時(shí)間調(diào)制的示意圖；

圖3為一實(shí)施例提供的對(duì)退激發(fā)光空間調(diào)制所使用的相位板圖；

圖4為一實(shí)施例提供的多光子超分辨顯微成像方法的原理圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只作為示例，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

需要注意的是，除非另有說(shuō)明，本申請(qǐng)使用的技術(shù)術(shù)語(yǔ)或者科學(xué)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)為本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的通常意義。

圖1到圖3為一實(shí)施例提供的多光子超分辨顯微成像裝置，附圖標(biāo)記如下：

1-激光光源，2-半波片，3-分光裝置，4-第一擴(kuò)束器，5-并光裝置，6-玻璃棒，7-脈沖時(shí)間調(diào)制裝置，8-單模保偏光纖，9-第二能量開(kāi)關(guān)，10-第二擴(kuò)束器，11-空間調(diào)制裝置，12-第二能量開(kāi)關(guān)，13-雙色分光鏡，14-偏振調(diào)控裝置，15-掃描控制裝置，16-物鏡，17-載物臺(tái)，18-濾鏡，19-光子探測(cè)器，20-計(jì)算機(jī)。

本實(shí)施例的本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像裝置，包括：激光光源1、分光裝置3、并光裝置5、物鏡16和光子探測(cè)器19；所述激光光源1發(fā)出的激光到所述分光裝置3，所述分光裝置3將入射的激光并分為激發(fā)光和退激發(fā)光，所述激發(fā)光經(jīng)過(guò)的光路為第一光路，所述退激發(fā)光經(jīng)過(guò)的光路為第二光路，所述第二光路中設(shè)有空間調(diào)制裝置11，所述空間調(diào)制裝置11用于對(duì)所述退激發(fā)光進(jìn)行空間調(diào)制，使得所述退激發(fā)光的光斑成為中心零點(diǎn)的光斑；所述并光裝置5用于將所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊為同軸光線，重疊后的激光用于經(jīng)物鏡16聚焦后照射熒光樣品，光子探測(cè)器19用于采集探測(cè)熒光樣品發(fā)出的熒光，上傳到計(jì)算機(jī)20數(shù)模轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行成像。

其中，所述激光光源1為飛秒脈沖激光器，所述空間調(diào)制裝置11為渦旋相位板。所述分光裝置3和所述并光裝置5均為分光棱鏡。

本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像裝置，僅使用一個(gè)激光光源1，通過(guò)偏分光裝置3將激光分成兩束，一束作為退激發(fā)光，另一束作為激發(fā)光，退激發(fā)光經(jīng)相位調(diào)制變成中心零點(diǎn)的光斑，然后將激發(fā)光和退激發(fā)光通過(guò)并光裝置5合并為同軸光線，并由物鏡16聚焦到待測(cè)樣品上，激發(fā)待測(cè)樣品的熒光。產(chǎn)生的熒光進(jìn)入單光子探測(cè)器19進(jìn)行采集，進(jìn)行成像。由于本發(fā)明中使用的激發(fā)光和退激發(fā)光來(lái)自同一臺(tái)激光器，因此他們的脈沖重復(fù)頻率從本質(zhì)上是同步的，無(wú)需使用額外的電子元器件,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實(shí)施方式，所述第二光路中還設(shè)有脈沖拉寬裝置和脈沖時(shí)間調(diào)制裝置7。本實(shí)施例采用飛秒激光作為初始光源，為了達(dá)到更好的退激發(fā)效果，需要把脈沖寬度拉寬到200到300皮秒。本實(shí)施例中，脈沖拉寬裝置使用30厘米長(zhǎng)的高折射率玻璃棒6和100米長(zhǎng)的保偏單模光纖，高折射率玻璃棒6g將脈沖寬度先拉寬到皮秒級(jí)，之后將退激發(fā)光導(dǎo)入100米長(zhǎng)的單模保偏光纖8進(jìn)一步拉寬到300皮秒左右。

進(jìn)一步地，所述第二光路中還設(shè)有第一能量開(kāi)關(guān)，用于控制所述退激發(fā)光的激光能量。所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊后的激光還經(jīng)過(guò)第二能量開(kāi)關(guān)，所述第二能量開(kāi)關(guān)用于控制重疊后激光的激光能量。通過(guò)第一能量開(kāi)關(guān)和第二能量開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)激發(fā)光和退激發(fā)光的能量，從而匹配樣品的熒光分子。

所述光子探測(cè)器19的入射端還設(shè)置有濾鏡18，用于選擇所需測(cè)量的光譜范圍，防止其他光譜影響成像效果。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實(shí)施方式，所述第一光路中設(shè)有第一擴(kuò)束器4，所述第二光路中設(shè)有第二擴(kuò)束器10，且所述第二激光先經(jīng)過(guò)所述第二擴(kuò)束器10擴(kuò)束后，進(jìn)入所述空間調(diào)制裝置11。所述第一擴(kuò)束器4和所述第二擴(kuò)束器10均為凸透鏡。

具體的，本實(shí)施例的多光子超分辨顯微成像裝置還包括半波片2，所述激光光源1發(fā)出的激光經(jīng)所述半波片2入射到所述分光裝置3。物鏡16的入射端還設(shè)有用于控制掃描范圍的掃描控制裝置15，掃描控制裝置15為三維納米移動(dòng)平臺(tái)，當(dāng)然也可以為聲光振鏡。

在掃描控制裝置15的入射端還進(jìn)一步設(shè)有偏振調(diào)控裝置14，用于調(diào)節(jié)激光的偏振性，使其滿足激光空間調(diào)制裝置11的需求，先透過(guò)偏振調(diào)控裝置14，然后進(jìn)入掃描控制裝置15。

其中，本裝置還設(shè)有二色分光鏡，光子探測(cè)器19、濾鏡18、雙色分光鏡13、偏振調(diào)控裝置14、掃描控制裝置15、物鏡16和載物臺(tái)17依次設(shè)置在同一直線上。所述激發(fā)光和退激發(fā)光重疊后，經(jīng)雙色分光鏡13反射進(jìn)入偏振調(diào)控裝置14，并依次穿過(guò)掃描控制裝置15和物鏡16，聚焦在待測(cè)樣品上。樣品發(fā)出的熒光，依次穿過(guò)物鏡16、掃描控制裝置15、偏振調(diào)控裝置14、雙色分光鏡13和濾鏡18進(jìn)入光子探測(cè)器19，通過(guò)計(jì)算機(jī)20進(jìn)行成像。

參照?qǐng)D4，另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像方法，包括如下步驟：

步驟s1，將初始激光分為激發(fā)光和退激發(fā)光；

步驟s2，對(duì)所述退激發(fā)光進(jìn)行空間調(diào)制，使得所述退激發(fā)光的光斑成為中心零點(diǎn)的光斑；

步驟s3，將所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊為同軸光線，并聚焦于待測(cè)熒光物上；

步驟s4，采集熒光樣品發(fā)出的熒光，獲得圖像。

本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像方法，將初始激光分成兩束，一束作為退激發(fā)光，另一束作為激發(fā)光，退激發(fā)光經(jīng)相位調(diào)制變成中心零點(diǎn)的光斑，然后將激發(fā)光和退激發(fā)光合并為同軸光線，并聚焦到待測(cè)樣品上，激發(fā)待測(cè)樣品的熒光，熒光樣品發(fā)出的熒光，進(jìn)行成像。由于本發(fā)明中使用的激發(fā)光和退激發(fā)光來(lái)自同一臺(tái)激光器，因此他們的脈沖重復(fù)頻率從本質(zhì)上是同步的，無(wú)需使用額外的電子元器件,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低。

進(jìn)一步地，步驟s2之前，還對(duì)所述退激發(fā)光進(jìn)行擴(kuò)束，步驟s3之前，對(duì)所述激發(fā)光進(jìn)行擴(kuò)束。為了使激發(fā)光和退激發(fā)光到達(dá)待測(cè)樣品的時(shí)間一致，還對(duì)退激發(fā)光進(jìn)行時(shí)間調(diào)制。

在本申請(qǐng)的描述中，需要理解的是，術(shù)語(yǔ)“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“水平”、“內(nèi)”、“外”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡(jiǎn)化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

此外，術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”等僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。

本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，說(shuō)明了大量具體細(xì)節(jié)。然而，能夠理解，本發(fā)明的實(shí)施例可以在沒(méi)有這些具體細(xì)節(jié)的情況下實(shí)踐。在一些實(shí)例中，并未詳細(xì)示出公知的方法、結(jié)構(gòu)和技術(shù)，以便不模糊對(duì)本說(shuō)明書(shū)的理解。

在本說(shuō)明書(shū)的描述中，具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書(shū)中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求和說(shuō)明書(shū)的范圍當(dāng)中。