專利名稱：卡氮芥的超細纖維劑型的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及卡氮芥的一種生物降解高分子超細纖維劑型的制備方法。
背景技術：
卡氮芥(BCNU)是臨床常規(guī)應用的抗癌藥物，尤其適用于治療腦膠質(zhì)瘤。其作用機制普遍認為是卡氮芥在體內(nèi)與DNA結(jié)合，也有抑制DNA聚合酶作用，從而阻止DNA和RNA合成。它對G1-S過渡期作用最強，對S期有阻滯作用，對G2期作用又增強，對G0期也有作用，故為細胞周期非特異性藥?？ǖ娴闹苄愿?，血漿蛋白結(jié)合率低，相對容易透過血腦屏障。但是，它的熔點低(30-32℃)，半衰期短。遇水、見光容易分解。目前卡氮芥的臨床給藥多為靜脈注射，用藥量大，卻在病灶部位作用效率低。同時，該藥注射后迅速分布全身，會引起強烈的副反應，如遲發(fā)性骨髓抑制、腎毒性胃腸毒性及肝臟毒性等，嚴重時可能導致死亡。另外，用于注射化療時，由于卡氮芥在體內(nèi)半衰期僅有15分鐘，療效十分不理想。針對這些問題，許多學者從不同方面，就化療方式、給藥方法及途徑等進行探索，以期提高治療效果，改善患者生存質(zhì)量。近年來腦瘤局部控緩釋藥物間質(zhì)化療(interstitial chemotherapy)的研究，開辟了腦膠質(zhì)瘤治療的又一新途徑。中國專利CN 1524580 A公開了“卡氮芥緩釋膜片及其制備方法”；中國專利CN 1520808 A公開了“卡莫司汀前體脂質(zhì)體粉針制劑及制備方法”。但是，兩者都存在載藥量低、藥物突釋和體系不穩(wěn)定等問題。
傳統(tǒng)的全身化療藥物具有難以通過血腦屏障、全身反應嚴重、病灶部位藥物局部濃度低等缺點。為此，多采取經(jīng)預置導管向瘤腔內(nèi)注射、皮下埋置泵持續(xù)給藥、甘露醇開放血腦屏障、動脈或選擇性動脈給藥等方法，以增加化療藥物的局部濃度。但這些方法均存在著各種不足，臨床效果不佳。所以，如果在腫瘤手術切除時將化療藥直接放在病灶部位，可避開血腦屏障；藥物緩慢釋放，直接增加局部藥物濃度，從而延長化療藥物的作用時間。這樣既達到了化療的目的，又因為所需要的藥物總量比全身化療要低的多，從而減少了藥物的全身毒副作用?？傊?，局部緩釋化療揚長避短，解決了上述方法的不足。
中國專利CN 03109880.0公開了“超細纖維藥物劑型及其制備方法”。本發(fā)明在該專利的基礎上，針對卡氮芥的具體特點，提出卡氮芥的生物降解高分子超細纖維劑型及其制備方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供卡氮芥的一種超細纖維劑型的制備方法。
本發(fā)明使用生物降解高分子作為藥物的載體。除了聚合物的品種外，聚合物的分子量也是選擇的重要參數(shù)，以便獲得適宜的電紡絲液粘度。使用這些生物降解高分子作為藥物的載體，它們在人體內(nèi)發(fā)生降解，可以補償因總藥量下降造成的藥物釋放速度隨時間的衰減，使藥物釋放行為更加平穩(wěn)；并且在藥物釋放過程中，載體同步降解，最終被人體吸收或代謝，不殘留在人體內(nèi)，不造成對人體的危害。紡絲溶液為聚合物和卡氮芥的混合溶液，使用聚合物和卡氮芥的共同良溶劑，該溶劑具有電紡絲所要求的揮發(fā)性，無毒或低毒，易從纖維產(chǎn)品中除去，殘留量低，使用適當比例的混合溶劑往往具有最好的電紡絲效果。電紡絲的基本設備在中國專利CN03109880.0、中國專利CN 1543929A和中國專利CN 1543972A均有詳細的敘述。
本發(fā)明擔載有卡氮芥的超細纖維無紡布或纖維氈的制備方法，包括以下步驟將卡氮芥加到載體高分子的溶液中，形成兩者的混合溶液，其中載體高分子的質(zhì)量濃度為1～20％，卡氮芥的質(zhì)量為載體高分子的1～100％；高分子溶液是聚乳酸(PLA)、聚ε-己內(nèi)酯(PCL)、聚乙交酯(PGA)，以及丙交酯、乙交酯、ε-己內(nèi)酯和乙二醇之間的二元或三元的無規(guī)或嵌段共聚物，其中，乙二醇的嵌段共聚物中聚乙二醇段的分子量不宜超過5000，可以使用單一的聚合物，也可以使用兩種或兩種以上聚合物的混合物，紡絲溶液為聚合物和卡氮芥的混合溶液，使用聚合物和卡氮芥的共同良溶劑，它們是氯仿、丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚或二氧六環(huán)其中的一種或兩種以上；電紡絲參數(shù)噴絲口的直徑為0.1～0.9mm？；噴絲口到接收屏之間的距離8～30cm，它們之間的電壓1～80kV；高分子和卡氮芥的混合溶液從噴絲口流出的速度0.01～0.5ml/min，制得的纖維單位直徑為0.1～2微米。
電紡絲與傳統(tǒng)紡絲工藝的區(qū)別之一，在于所制備的纖維直徑，在微米至納米范圍內(nèi)，遠小于普通纖維，從而避免了由于纖維的直徑粗、壁厚而造成的降解速度慢，藥物釋放遲滯的現(xiàn)象，卡氮芥的釋放速度較快。但又不像納米顆粒、納米膠囊和納米膠束那樣，比表面積太大，藥物釋放太快。它機械強度較高，可作為獨立劑型使用，無須加工成其它常規(guī)劑型。它們的藥物釋放平穩(wěn)、可控。這樣的超細纖維氈外形與棉球或紗布相似，很容易在腫瘤切除后放置并保持在病灶部位，術后卡氮芥不斷從纖維中擴散出來，發(fā)揮化療的作用，因而特別適用于腫瘤手術后局部化療。電紡絲工藝的另一個優(yōu)點是，由于聚合物從溶液狀態(tài)變成固體納米纖維狀態(tài)，僅需要不到1秒鐘的時間，其中夾帶的卡氮芥在如此短的時間內(nèi)固化，來不及生長成很大的晶粒，也來不及擴散到纖維的表面上來，因而卡氮芥基本上被包裹在纖維內(nèi)部，并且在纖維基體中的分散非常均勻，呈分子狀態(tài)或納米聚集狀態(tài)，用電子顯微鏡觀察不到纖維表面有卡氮芥的藥物顆粒?？梢?，這種可生物降解超細纖維擔載卡氮芥的藥物劑型，可以避免藥物的突釋現(xiàn)象，減少藥物的毒副作用。包裹在纖維內(nèi)部的卡氮芥不易分解變性，增強了藥物的穩(wěn)定性，也在一定程度上解決了卡氮芥藥物穩(wěn)定性差的問題。
實驗表明，電紡絲纖維中的卡氮芥的劑量，可以在很大的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，以適應不同病人的需要。以高分子的質(zhì)量為基數(shù)，載藥量可達到100％。這也是一般的紡絲工藝和其它的藥物劑型所難以達到的。
圖1是實施例1制備的超細纖維藥的ESEM照片。
圖2是實施例2制備的超細纖維藥的SEM照片。
圖3是實施例4制備的超細纖維藥的ESEM照片。
圖4是實施例4制備的超細纖維藥的釋放曲線。(○)在含3mg/l蛋白酶K的Tris-HCl緩沖溶液中；(■)在空白Tris-HCl緩沖溶液中。
圖5是不同BCNU含量的載藥纖維對大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細胞相對存活率-時間曲線。(A)空白PEG750-PLLA纖維氈；(B)擔載5％BCNU的PEG750-PLLA纖維氈；(C)擔載10％BCNU的PEG750-PLLA纖維氈；(D)擔載20％BCNU的PEG750-PLLA纖維氈。
圖6是不同BCNU純藥濃度對大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細胞相對存活率-時間曲線。1μg/ml(■)；10μg/ml(○)；25μg/ml(▲)；50μg/ml()；100μg/ml(★)。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明提供的卡氮芥的可生物降解高分子超細纖維藥物劑型及其制備方法給予進一步說明，但本發(fā)明所適用的載體高分子和溶劑品種，以及紡絲溶液的組成和紡絲條件，并不僅限于實施例的范圍。
實施例1.將左旋聚乳酸PLLA(數(shù)均分子量86400)0.7768g溶于4ml氯仿和1ml丙酮的混合溶劑中，充分溶解后，再加入39mg卡氮芥，攪拌使之充分溶解，形成均一的混合溶液。然后將混合溶液加入到10ml注射器中，采用8號針頭制成的直角平口噴絲口，紡絲流速為2ml/h，所加電壓為35kV，兩極間的距離為24cm。
所得載藥纖維的平均直徑500nm，卡氮芥含量5％，見圖1。
實施例2.將0.9616g丙交酯和乙交酯的無規(guī)共聚物PLGA(其中質(zhì)量組成丙交酯80％，乙交酯20％，數(shù)均分子量79500)溶于5ml氯仿中，充分溶解后，再加入96mg卡氮芥，攪拌使之充分溶解，形成均一的混合溶液。然后將混合溶液進行電紡，采用8號針頭制成的直角平口噴絲口，紡絲流速為1.5ml/h，所加電壓為33kV，兩極間的距離為18cm。
所得載藥纖維的平均直徑1.8μm，卡氮芥含量10％，見圖2。
實施例3.將0.6874g PLLA-PEG嵌段共聚物(數(shù)均分子量為97600，其中PEG段數(shù)均分子量為5000)溶于5ml氯仿中，充分溶解后，再加入0.1375g卡氮芥，攪拌使之充分溶解，形成均一的混合溶液。然后將混合溶液進行電紡，采用8號針頭制成的直角平口噴絲口，紡絲流速為1.8ml/h，所加電壓為35kV，兩極間的距離為24cm。
所得載藥纖維的平均直徑800nm，卡氮芥含量20％。
實施例4.將0.7319g PLLA-PEG嵌段共聚物(數(shù)均分子量為84800，其中PEG段數(shù)均分子量為750)溶于5ml氯仿中，充分溶解后，再加入73mg卡氮芥，攪拌使之充分溶解，形成均一的混合溶液。然后將混合溶液進行電紡，采用8號針頭制成的直角平口噴絲口，紡絲流速為2ml/h，所加電壓為35kV，兩極間的距離為24cm。
所得載藥纖維的平均直徑500nm，卡氮芥含量10％，見圖3。纖維表面光滑，無藥物顆粒，說明藥物均勻分散包裹在纖維內(nèi)部。
實施例5.卡氮芥的超細纖維藥的體外釋放將一定數(shù)量大小、重量相近的擔載卡氮芥的纖維片樣品放在裝有20mlTris-HCl緩沖液(0.05M，pH＝8.6)的廣口瓶中，緩沖液中蛋白酶K濃度為3μg/ml。在對照實驗中，緩沖液中不加酶。將上述樣品置于振蕩培養(yǎng)箱中，溫度保持在37±0.1℃，振蕩頻率為90rpm。每隔一定時間，將待測纖維片取出，冷凍干燥12小時除水。然后將干燥的纖維片用適量的氯仿溶解，接著加入10ml乙腈-水的混合溶劑(32∶68v/v)，25℃下減壓將氯仿除去。將得到的溶液用高壓液相色譜檢測。流動相是乙腈-水的混合溶劑(32∶68v/v)，流速為1.0ml/min.最后得到卡氮芥的累計釋放量-釋放時間的曲線，如圖4所示。
因為卡氮芥在釋放實驗環(huán)境中不穩(wěn)定，容易變性分解。如果直接通過檢測釋放出的卡氮芥來計算卡氮芥的累積釋放量是不合理的。因此，我們采用高壓液相色譜檢測留在纖維片中的卡氮芥來計算卡氮芥的累積釋放量。從釋放曲線可以看出無論是在有酶存在的Tris-HCl緩沖液中還是在無酶存在的對照實驗中，卡氮芥的釋放速度隨載藥量的增加而增加。主要由擴散作用引起的最初的釋放量也隨著載藥量的增加而增加。例如，在18分鐘內(nèi)，含有5％卡氮芥的PEG750-PLLA纖維氈釋放了11.9％，而含有10％卡氮芥的PEG750-PLLA纖維氈釋放了16.1％。
從釋放曲線看出卡氮芥的釋放行為穩(wěn)定，既能在釋放初期有較高的藥物釋放速度，又能在很長的時間內(nèi)平穩(wěn)釋放。對于抗腫瘤藥物的控制釋放來說，卡氮芥的這種釋放行為是很理想的。開始的適度快釋有利于快速抑制腫瘤細胞的繁殖、生長。對于依然存活的少量腫瘤細胞來說，在很長的時間內(nèi)平穩(wěn)釋放卡氮芥將進一步抑制它們的生長。因此，這種劑型特別適用于腫瘤手術后的局部化療。
實施例6.卡氮芥的超細纖維藥的抗癌活性研究將擔載卡氮芥的超細纖維氈用鈷-60的γ-射線輻照進行消毒，劑量5kGy。
將大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細胞株接種于含有10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，并且在含有5％CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)。每次均以0.25％胰酶(pH7.4的磷酸鹽緩沖液)消化1分鐘，吸棄胰蛋白酶后，將細胞轉(zhuǎn)入50ml的離心管中，以1000r/min離心5分鐘之后，用臺盼藍染色法對細胞進行計數(shù)。用培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度到5×104/ml。將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，每孔加入細胞懸液200μL，然后將培養(yǎng)板置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h，讓細胞貼壁生長。將下列樣品加到96孔板中(1)培養(yǎng)對照組，腫瘤細胞株培養(yǎng)，不加任何藥物，每組5孔；(2)卡氮芥純藥，濃度分別為1、10、25、50、100μg/ml，每組5孔；(3)載體對照組，即不含卡氮芥的空白載體，每組10孔；(4)擔載有卡氮芥的纖維氈，卡氮芥在載藥纖維中的含量分別為5、10、20％，每組10孔。相對于培養(yǎng)液的纖維中卡氮芥的含量分別為10、25、50μg/ml。繼續(xù)細胞培養(yǎng)。在每個實驗時間點，用酶標儀在492nm處檢測OD值，計算細胞相對存活率。細胞相對存活率＝實驗組OD值(均值)/培養(yǎng)對照組OD值(均值)×100％。然后做細胞相對存活率-時間曲線。卡氮芥純藥和擔載卡氮芥超細纖維在不同時間點對C6腫瘤細胞的抑制作用的對比，如圖5和圖6所示。
實驗的結(jié)果表明卡氮芥純藥在48小時后完全失效，對癌細胞生長的抑制作用完全消失，癌細胞開始重新生長繁殖，而擔載卡氮芥的超細纖維則在整個測試時間內(nèi)保持對癌細胞的良好抑制作用，不含卡氮芥的超細纖維幾乎沒有細胞毒性。因此超細纖維氈擔載的卡氮芥對癌細胞的抑制和殺滅作用比卡氮芥純藥更加有效，這是由纖維藥的緩釋作用造成的。所以，本發(fā)明技術所制成的卡氮芥超細纖維劑型，成功實現(xiàn)了緩釋、減小毒副作用、增強藥效等目標，解決了卡氮芥純藥易變性和和體內(nèi)半衰期短等問題。
權利要求
1.一種卡氮芥的超細纖維劑型的制備方法，將卡氮芥加到載體高分子的溶液中，形成兩者的混合溶液，其中載體高分子的質(zhì)量濃度為1～20％，卡氮芥的質(zhì)量為載體高分子的1～100％；高分子溶液是聚乳酸(PLA)、聚ε-己內(nèi)酯(PCL)、聚乙交酯(PGA)，以及丙交酯、乙交酯、ε-己內(nèi)酯和乙二醇之間的二元或三元的無規(guī)或嵌段共聚物，其中，乙二醇的嵌段共聚物中聚乙二醇段的分子量不超過5000，可以使用單一的聚合物，也可以使用兩種或兩種以上聚合物的混合物，紡絲溶液為聚合物和卡氮芥的混合溶液，使用聚合物和卡氮芥的共同良溶劑，它們是氯仿、丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚或二氧六環(huán)其中的一種或兩種以上；電紡絲參數(shù)噴絲口的直徑為0.1～0.9mm？；噴絲口到接收屏之間的距離8～30cm，它們之間的電壓1～80kV；高分子和卡氮芥的混合溶液從噴絲口流出的速度0.01～0.5ml/min，制得的纖維單位直徑為0.1～2微米。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種卡氮芥可生物降解高分子超細纖維劑型的制備方法，即將卡氮芥溶解在可生物降解高分子的溶液中，進行靜電紡絲，形成包裹有卡氮芥的超細纖維無紡布或纖維氈。該方法制備工藝簡單，設備成本低，所得的載藥纖維直徑可控制在0.2～2μm，載藥量可在0.1～100％的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。藥物釋放行為穩(wěn)定，既能在釋放初期有較高的藥物釋放速度，又能在很長的時間內(nèi)平穩(wěn)釋放卡氮芥。纖維載體本身能完全生物降解，毒副作用很小。另外，由于卡氮芥被完全包裹在纖維內(nèi)并逐步緩慢釋放，克服了它在人體內(nèi)半衰期很短的缺點，也降低了它對人體毒副作用。這種劑型特別適用于腫瘤手術后的局部化療。
文檔編號D01F1/10GK1687494SQ20051001668
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月5日 優(yōu)先權日2005年4月5日
發(fā)明者景遐斌, 徐秀玲, 陳學思, 楊立新, 徐效義, 梁奇志, 盧天成 申請人:中國科學院長春應用化學研究所