原花青素在抗寨卡病毒等黃病毒感染中的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及藥學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，具體說是原花青素在抗寨卡病毒等黃病毒感染中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

寨卡病毒(zikavirus)是一種主要通過伊蚊傳播的蚊媒病毒。該病毒最早于1947年偶然通過黃熱病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)在烏干達(dá)寨卡叢林的恒河猴中發(fā)現(xiàn)，隨后于1952年在烏干達(dá)和坦桑尼亞人群中發(fā)現(xiàn)。2015年5月7日，泛美衛(wèi)生組織和世界衛(wèi)生組織宣布，巴西衛(wèi)生當(dāng)局確認(rèn)了巴西東北部寨卡病毒的流行，在這之前寨卡主要是在非洲、東南亞和太平洋島嶼流行，然而，從2015年5月開始，美洲多個國家開始報道有寨卡的傳播，并預(yù)測其他有寨卡媒介蚊蟲的國家都將陸續(xù)會有病例報道。在隨后不到一年的時間里，截至3月10日，世衛(wèi)組織報道有本地傳播病例的國家和地區(qū)已增至52個。截至2016年3月11日，我國已有13例輸入性病例。目前，對于寨卡病毒的治療多使用阿司匹林和非類固醇類抗炎藥物，但寨卡和登革熱存在同時感染的可能，以上藥物可能會增加登革熱出血的風(fēng)險。目前尚無可用疫苗和有效的治療方法。

目前已知，寨卡病毒屬黃病毒科、黃病毒屬，呈球形，為單股正鏈rna病毒，直徑40-70nm，有包膜，長度約為10.8kb，編碼大約3400多個氨基酸。寨卡病毒的抵抗力不詳，但黃病毒屬的病毒一般不耐酸、不耐熱。60℃30min可滅活，70％乙醇、1％次氯酸鈉、脂溶劑、過氧乙酸等消毒劑及紫外線照射均可滅活。寨卡病毒病可導(dǎo)致自限性感染，主要癥狀包括低熱、斑丘疹、關(guān)節(jié)疼痛、結(jié)膜炎，其他癥狀包括肌痛、頭痛、眼眶痛及全身無力等，這些癥狀通常持續(xù)2-7d。寨卡病毒病有造成神經(jīng)和自身免疫系統(tǒng)并發(fā)癥的風(fēng)險，孕婦感染寨卡病毒常導(dǎo)致新生兒小頭畸形。ns3蛋白酶是其多聚蛋白的蛋白酶解加工以使病毒復(fù)制所必需的，從而使ns3pro成為抑制病毒增殖的一個有吸引力的治療靶點，寨卡病毒的ns2b-ns3蛋白酶復(fù)合物在病毒的整個生活周期中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，只有該蛋白酶復(fù)合物被激活并完成一系列水解反應(yīng)后，病毒才能啟動復(fù)制過程。因此，寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白ns2b-ns3蛋白酶復(fù)合物也成為一個關(guān)鍵的抗病毒藥物靶標(biāo)，所以針對寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶進(jìn)行抑制劑篩選對寨卡病毒相關(guān)的藥物研發(fā)具有很大的意義。

原花青素，英文名是oligomericproanthocyanidins(opc)，是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑。一般為紅棕色粉末，氣微、味澀，溶于水和大多有機溶劑。一般為葡萄籽提取物或法國海岸松樹皮提取物。原花青素(葡萄籽提取物)是一種新型高效抗氧化劑，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強效的自由基清除劑，具有非常強的體內(nèi)活性。

但迄今為止，原花青素在抗寨卡病毒等黃病毒感染中的應(yīng)用未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供原花青素在抗寨卡病毒等黃病毒感染中的應(yīng)用。

本發(fā)明針對寨卡病毒等黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns2b-ns3蛋白酶的抑制劑，抑制劑為原花青素。

本發(fā)明所涉及原花青素cas號為4852-22-6，購買于topscience公司。通過設(shè)立陰性對照，發(fā)現(xiàn)原花青素對寨卡病毒等黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns2b-ns3蛋白酶都有很好的抑制活性，因此該化合物有望作為抑制寨卡病毒等黃病毒的潛在藥物。

本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療含有黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns2b-ns3蛋白酶感染的藥物，其活性成分為原花青素，該藥物包含上述含有原花青素以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、增效劑。該藥物可制成注射劑、片劑、丸劑、膠囊、懸浮劑或乳劑的形式使用。其給藥途徑可為口服、經(jīng)皮、靜脈或肌肉注射。

本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：

本發(fā)明的針對寨卡病毒等黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns2b-ns3蛋白酶的抑制劑，這種抑制劑為原花青素。原花青素對寨卡病毒等黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns2b-ns3蛋白酶活性具有顯著的抑制效果。

附圖說明

圖1是原花青素對zikans2b-ns3^pro抑制作用示意圖

具體實施方式

以下通過具體實施例對本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明：

本發(fā)明采用的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns2b-ns3蛋白酶的表達(dá)、純化等方法步驟及化合物篩選方法參考文獻(xiàn)方法(xiac,yangk,chenw,etal.mechanismsofactivationandinhibitionofzikavirusns2b-ns3protease[j].cellresearch,2016,26(11):1260.)寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測定采用純度大于95％的熒光底物ac-lkrr-amc作為底物；熒光強度測定的儀器為fluoraskanascent熒光儀(thermo),激發(fā)光和發(fā)射光的波長分別為355nm和460nm；

蛋白緩沖液組分為10mmtris,20％體積百分?jǐn)?shù)的甘油，ph＝9.0,1mmchaps；用緩沖液配置冠狀病毒主蛋白酶(終濃度100nm),加入化合物dmso溶解度(終濃度為20μm),310.15k放置10min,迅速加入熒光底物ac-lkrr-amc,底物濃度為50μm。每10s記錄一次熒光讀數(shù)，共測定100個點。1200rpm震蕩20s,檢測熒光值。不加備選樣品，其他實驗條件均相同。

以時間為x軸，熒光值為y軸可得酶活動力學(xué)曲線。通過酶標(biāo)儀記錄的酶反應(yīng)的相關(guān)參數(shù)，根據(jù)熒光強度以及反應(yīng)時間，采用graphpadprism5軟件分析前100s的酶促反應(yīng)的速率。設(shè)定v0為不加抑制劑的酶促反應(yīng)的初速度，vi為加抑制劑的酶促反應(yīng)的初速度。根據(jù)酶促反應(yīng)速率，計算出每個化合物的剩余活性ra(residualactivity,ra)(vi/v0)以及抑制率ir(inhibitionrate,ir)(1-vi/v0)。

對于剩余活性<20％的化合物進(jìn)行復(fù)篩，排除操作失誤造成假陽性的可能。對于剩余活性低于15％的化合物，設(shè)計熒光淬滅實驗。綜合考慮化合物的剩余活性百分率和熒光淬滅率就可以判斷化合物對寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns2b-ns3蛋白酶的抑制效果。因為該體系主要是通過熒光強度篩選，所以，當(dāng)有熒光的化合物或者是與mca類似的化合物都會對體系產(chǎn)生干擾。另外，很多dnp類似的結(jié)構(gòu)會淬滅體系的熒光而造成假陽性，為了排除假陽性結(jié)果，我們采用先將蛋白酶與熒光底物反應(yīng)一段時間，讓體系熒光達(dá)到最大值q1、再在體系中加入與實驗組等量的化合物，并檢測體系的熒光值大小為q2。將兩者的熒光值按照公式計算得出熒光淬滅率qr((qr＝q1-q2)/q2*％)。當(dāng)熒光淬滅率高于20％為假陽性結(jié)果需排除，當(dāng)熒光淬滅率低于20％為陽性結(jié)果。

本發(fā)明涉及藥學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，具體說是原花青素在抗寨卡病毒等黃病毒感染中的應(yīng)用，原花青素在抑制寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶ns2b-ns3時候ir>90％以上,在制備抗寨卡病毒等黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶ns2b-ns3的小分子抑制劑方面有很大應(yīng)用潛力。