以白介素33為治療靶點(diǎn)的腫瘤疫苗的制作方法

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體來說是一種以白介素33為治療靶點(diǎn)的乳腺癌疫苗。

背景技術(shù)：

白細(xì)胞介素-33是2005年由Schmitz等發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員，主要在一些屏障細(xì)胞中組成型表達(dá)，在細(xì)胞壞死或損傷時(shí)釋放，因此被稱為“警報(bào)素”。IL-33可與表達(dá)在巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞，NK細(xì)胞等Th2細(xì)胞表面的ST2受體相結(jié)合，激活下游信號通路，調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫，另外，在特定的病理?xiàng)l件下，，IL-33還可激活Th1、CD8⁺T細(xì)胞等免疫細(xì)胞。IL-33在炎癥性疾病中具有雙重作用，一方面對肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化等具有保護(hù)作用，另一方面，在哮喘和過敏性疾病中又具有致炎作用。

IL-33在腫瘤免疫中的作用尚不清楚，相關(guān)研究認(rèn)為IL-33可通過抑制固有抗腫瘤免疫，增加瘤內(nèi)免疫抑制性細(xì)胞的數(shù)量，來促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌模型中IL-33可促進(jìn)髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T-reg）等免疫抑制細(xì)胞的在腫瘤組織的浸潤，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在胃癌中的研究顯示，IL-33可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。另一方面，有文獻(xiàn)指出，在轉(zhuǎn)基因過表達(dá)IL-33的B16黑色素瘤和Leiws肺癌小鼠模型中，IL-33可通過增加CD8⁺T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，來增加瘤內(nèi)腫瘤浸潤性CTL效應(yīng)，進(jìn)而起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。因此，IL-33可能在不同的腫瘤模型中，不同的腫瘤微環(huán)境中具有不同的作用。具體來說，IL-33可能在腫瘤的免疫逃逸和機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)方面起雙重作用。一方面通過增加免疫抑制性細(xì)胞在腫瘤組織的富集，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，另一方面，通過募集CD8⁺T細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤，打破腫瘤微環(huán)境的免疫耐受，進(jìn)而抑制腫瘤的增殖。因此，IL-33在抗腫瘤免疫中的角色及確切機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率已上升至女性惡性腫瘤第一位，嚴(yán)重威脅女性的生命健康，目前，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，以及放療、化療等輔助手段的應(yīng)用，乳腺癌患者的總體生存率得到極大改善，但是每年還有30%-40%的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，仍導(dǎo)致患者死亡。臨床分離的乳腺腫瘤組織中高表達(dá)IL-33，且與腫瘤的發(fā)展相關(guān)，提示在乳腺癌中，IL-33具有可能的促腫瘤效應(yīng)。

本發(fā)明以HBcAg病毒樣顆粒形式呈遞IL-33，闡述該重組后的假病毒顆粒的抗腫瘤效力，該重組假病毒顆粒疫苗形式能突破自身的免疫耐受，產(chǎn)生針對自身的抗IL-33的特異性抗體，從而拮抗機(jī)體自身的IL-33蛋白水平，下調(diào)IL-33，抑制腫瘤生長。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

以IL33-HBcAg重組病毒樣顆粒進(jìn)行皮下注射,對小鼠進(jìn)行主動(dòng)免疫，每隔兩周免疫一次，每只100ug,共免疫三次，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生持續(xù)性的IL-33特異的抗體應(yīng)答，末次免疫后隔兩周于小鼠第四脂肪墊原位接種4T1腫瘤細(xì)胞，每只1×10⁵cell，第10天成瘤，觀察腫瘤生長情況，發(fā)現(xiàn)以HBcAg-33病毒樣顆粒形式預(yù)防性免疫后，小鼠腫瘤生長受到顯著抑制，觀測時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后，收集免疫后的小鼠脾臟，進(jìn)行流式檢測CTL、Th1/Th2表達(dá)水平，ELISPOT檢測分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)疫苗組顯著提高了CTL和分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞水平。

附圖說明

圖1顯示了免疫記憶的實(shí)驗(yàn)程序

圖2顯示了預(yù)防性免疫HBcAg-33疫苗組較載體組顯示出較高的IL-33特異性IgG抗體水平。（n=10）

圖3顯示了疫苗組與載體組的腫瘤生長曲線，預(yù)防性免疫HBcAg-33疫苗組，顯著抑制了腫瘤的生長。（n=10）

圖4顯示了疫苗組與載體組小鼠的肺轉(zhuǎn)移情況，預(yù)防性免疫HBcAg-33疫苗組沒有出現(xiàn)肺部的轉(zhuǎn)移。（n=10）

圖5顯示了從疫苗組與載體組小鼠體內(nèi)分離的腫瘤大小情況，疫苗組顯著抑制了腫瘤的生長。（n=10）

圖6顯示了經(jīng)流式細(xì)胞分析，預(yù)防性免疫HBcAg-33疫苗組顯著提高了CTL的數(shù)目。（n=10）

圖7顯示了經(jīng)ELISPOT分析，預(yù)防性免疫HBcAg-33疫苗組顯著提高了分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)目。（n=10）

圖8顯示了IL-33預(yù)防性免疫對Th1/Th2應(yīng)答偏倚的調(diào)控，在腫瘤微環(huán)境中，IL-33具有調(diào)控Th1應(yīng)答偏倚的能力。（n=10）

具體實(shí)施方式

通過以下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，以便本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明。下述實(shí)施例僅僅出于示范性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保有關(guān)數(shù)字的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮到會(huì)存在一些誤差和偏差。

實(shí)施例

實(shí)施例1：HBcAg-33的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

HBcAg-33的誘導(dǎo)表達(dá)及純化方法如專利<<主動(dòng)免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構(gòu)建方法>>(ZL 2014 1 0248884.2)中所述。按照此方法步驟獲得HBcAg-33 VLPs及載體HBcAg VLPs 作為免疫原，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2：小鼠預(yù)防性免疫策略

6-8周的Balb/c雌鼠，隨機(jī)分為3組，8只/組，分別為疫苗組、載體組和PBS組。免疫形式如圖1所示，純化的HBcAg-33 VLPs、載體HBcAg VLPs、PBS分別在對應(yīng)組的背部皮下免疫，按每只100ug的注射劑量,隔兩周免疫1次，共免疫3次。每一次免疫后一周于小鼠大腿隱靜脈采血，檢測抗體水平。如圖2所示，其中抗體滴度最高可達(dá)409600。

實(shí)施例3：小鼠乳腺癌原位模型建立：

首先，用含10%FBS,1%青鏈霉素混合溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4T1腫瘤細(xì)胞，末次免疫后隔兩周于小鼠腹部第四脂肪墊注射4T1腫瘤細(xì)胞，每只1×10⁵cell,第10天成瘤，每隔兩天測量腫瘤，繪制腫瘤生長曲線，監(jiān)測腫瘤生長如圖3所示。

實(shí)施例4：模型干預(yù)

監(jiān)測腫瘤生長至13mm左右，在小鼠處于麻醉狀態(tài)時(shí)，心臟取血，使小鼠安樂死，分離血清，并借助流質(zhì)針經(jīng)氣管用1ml印第安墨水灌肺染色5分鐘，然后取出肺臟并在含70%乙醇、10%福爾馬林、5%乙酸的脫色中進(jìn)行脫色處理，由于腫瘤結(jié)節(jié)不吸收墨水而呈現(xiàn)白色，并記錄肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示。

實(shí)施例5：流式細(xì)胞檢測

無菌條件下從小鼠體內(nèi)分離腫瘤和脾臟，各免疫組的腫瘤大小如圖5所示，應(yīng)用小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離脾臟淋巴細(xì)胞，經(jīng)PMA及離子霉素刺激后，分別進(jìn)行Th1/Th2、CTL的表面及胞內(nèi)分子的染色（達(dá)科為），此步驟按說明書進(jìn)行，標(biāo)記完成后于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6所示。

實(shí)施例6：ELISPOT分析

從小鼠體內(nèi)分離的淋巴細(xì)胞，應(yīng)用ELISPOT試劑盒達(dá)科為檢測分泌IFN-r的總淋巴細(xì)胞數(shù)目，分離的脾臟淋巴細(xì)胞按3×10⁵個(gè)細(xì)胞數(shù)目鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，應(yīng)用陽性刺激物體外刺激，于37℃ ，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-20h。操作步驟按照說明書進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖7所示。

實(shí)施例7:IgG抗體亞型檢測

取分離的小鼠全血血清，ELISA檢測IL-33對IgG₁和IgG_2a抗體亞型的調(diào)控。以實(shí)驗(yàn)室制備的HBcAg包被酶標(biāo)板，50μl/孔，于濕盒中4℃過夜，用PBST（含5%的Tween20的PBS，pH7.2）洗滌3次，加入含5%BSA的PBST室溫封閉2h，PBST洗滌3次，加入小鼠血清或組織灌洗液，室溫下孵育1h，PBST洗3次，再加入生物素標(biāo)記的抗小鼠IgA、IgG₁與IgG_2a（1：10000稀釋），最后，加入親和素-堿性磷酸酶（1：10000稀釋），洗滌后加入堿性磷酸酶底物溶液，30min后，在酶標(biāo)儀測OD₄₀₅值，然后計(jì)算IgG₁與IgG_2a的比值結(jié)果如圖8所示。